Suivi des particules sensibles à la masse pour caractériser la dynamique des macromolécules associées à la membrane

En suivant le protocole détaillé ici pour la préparation des bicouches lipidiques (SLB) supportées dans les chambres d’écoulement (Figure 1), on peut clairement reconnaître un motif ressemblant à une moucheture dans la vue native de toutes les conditions affichées (Figure 2). Cet effet est causé par la rugosité de surface du verre, qui domine généralement le signal de diffusion et conduit à des conditions visuellement indiscernables (verre, verre avec SLB ou verre avec SLB et protéines attachées). La présence de vésicules, cependant, est clairement distincte en raison de la grande section de diffusion des vésicules et permet l’observation de la rupture et de la fusion des vésicules en membranes homogènes (Figure 2B et Film supplémentaire 1). En enlevant le signal de diffusion statique de la surface du verre avec une approche ratiométrique qui met l’accent sur les éléments dynamiques dans le champ de vision24,25, on peut découvrir des protéines non marquées diffusant sur la membrane (Figure 2D) tandis qu’un SLB vide (Figure 2C) ou le verre lui-même (Figure 2A) apparaît comme une image bruyante. L’arrière-plan inhérent aux mesures MSPT peut être estimé localement en divisant chaque valeur de pixel par la médiane de n pixels précédents et suivants du film à la même position d’image (Figure 3). En conséquence, les macromolécules apparaissent comme des fonctions isotropes d’étalement ponctuel (PSF) dont le mouvement sur la membrane peut être observé, suivi et quantifié. En fait, la disponibilité du contraste et du comportement dynamique permet la relation directe de la taille moléculaire d’une particule à son comportement diffusif respectif, le tout sans qu’il soit nécessaire de marquer la particule. Néanmoins, pour interpréter le contraste iSCAT déterminé lors des expériences MSPT, il est essentiel d’effectuer un étalonnage qui traduit l’amplitude du signal en masse moléculaire. Ceci peut être réalisé en attachant des biomolécules de masse connue à un SLB via un complexe biotine-streptavidine-biotine (Figure 4A). Comme stratégie exemplaire, on peut utiliser des variantes biotinylées de l’albumine sérique bovine (BSA), de la protéine A (prA), de la phosphatase alcaline (AP) et de la fibronectine (FN), qui se lient à la streptavidine (STP) qui est elle-même liée aux lipides contenant de la biotine (Biotinyl Cap PE) dans la membrane. Comme le montre la figure 4A, le contraste de plus en plus prononcé de ces macromolécules exemplaires reflète le poids moléculaire croissant des étalons biotinylés respectifs. En attribuant chaque pic des histogrammes de contraste (Figure 4B) à la masse correspondante de l’état oligomère de la protéine standard, une relation linéaire entre le contraste et la masse est révélée21,22 et peut ensuite être utilisée pour l’analyse de systèmes de macromolécules inconnus (Figure 4C). Un bon exemple démontrant l’applicabilité et les capacités de la MSPT pour analyser les poids moléculaires et donc étudier les états des oligomères et les événements d’oligomérisation est la prise en compte de l’aldolase biotinylée et des IgG biotinylées (Figure 5). L’aldolase est généralement considérée comme un homotétramère32. Cependant, la distribution de masse résolue par mspt comporte quatre pics distincts, ce qui met en évidence la présence de plusieurs populations (figure 5A). Alors que le premier pic mineur correspond à la streptavidine inoccupée et peut être attendu en raison de la configuration dans ce type d’expérience, des complexes d’aldolases avec seulement deux sous-unités (2SU) ou six sous-unités (6SU) peuvent également être détectés (Figure 5B). Fait intéressant, les complexes tétra- et hexamériques aldolase-streptavidine présentent un coefficient de diffusion réduit par rapport à l’aldolase dimérique et à la streptavidine seule, ce qui indique une traînée visqueuse accrue, par exemple via la fixation d’un deuxième lipide biotinylé à la streptavidine. De même, les IgG biotinylées présentent trois pics dans la distribution de masse, le premier pic correspondant à nouveau à la masse d’une seule streptavidine. La masse du pic le plus abondant correspond à la masse d’une chaîne légère et d’une chaîne lourde (1SU), c’est-à-dire la moitié d’un anticorps IgG. L’anticorps complet avec deux moitiés identiques (2SU) est détecté dans environ 11% des cas. La diminution du coefficient de diffusion avec l’augmentation des tailles complexes indique des interactions de la streptavidine avec plus d’un lipide biotinylé ou une traînée supplémentaire causée par les IgG attachées, ou les deux. Outre la seule analyse des états oligomères dépendants de la membrane, la MSPT confère également l’avantage particulier de corréler le comportement diffusif d’une macromolécule d’intérêt avec son état oligomère. Des résultats représentatifs pour ce type d’analyse sont présentés pour l’annexine V (AnV) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTxB), qui se lient à la dioléoylphosphatidylsérine (DOPS) ou aux glycosphingolipides (GM1), respectivement, incorporés dans la membrane (figure 6A). Les deux estimations de densité du noyau (KET) présentent des distributions unimodales de masse et de diffusion, indiquant une seule espèce abondante ayant un comportement diffusif similaire. La position maximale de la masse moléculaire et du coefficient de diffusion s’est avérée être de 49,8 ± 2,2 kDa et 1,4 ± 0,1 μm2/s, respectivement, pour l’AnV ainsi que de 62,7 ± 3,1 kDa et 0,4 ± 0,1 μm2/s, respectivement, pour CTxB. Les coefficients de diffusion mesurés sont comparables aux valeurs précédemment rapportées obtenues à partir de l’AFM à grande vitesse et du FRAP33,34. La masse légèrement réduite par rapport à la masse de la macromolécule attendue (52 kDa pour un trimère AnV, 65 kDa pour un pentamère CTxB) peut indiquer la présence de complexes plus petits avec moins de sous-unités dans l’ensemble. Bien que la différence de masse entre les protéines soit faible et proche de la limite de détection spécifiée au microscope (≈50 kDa), leurs coefficients de diffusion diffèrent considérablement. Dans un mélange équimolaire, par exemple, en comparant la diffusion du mélange à la distribution de l’AnV et du CTxB seul, on peut conclure que l’AnV est plus abondant sur la membrane que le CTxB (Figure 6B). Cependant, si la concentration de CTxB est doublée par rapport à la concentration d’AnV, l’équilibre est déplacé vers CTxB comme protéine prédominante sur la membrane. Comme illustré pour les mélanges d’AnV et de CTxB, le MSPT permet non seulement de discriminer les macromolécules associées à la membrane en fonction de leur poids moléculaire, mais permet également de discriminer différentes populations de macromolécules en fonction de leur comportement diffusif. Comme pour toutes les techniques de microscopie, certaines exigences expérimentales sont cruciales pour atteindre la qualité souhaitée des données. Un exemple important dans ce contexte est le nettoyage minutieux des couvercles. En général, cela est considéré comme une condition préalable aux expériences à molécule unique liées à la microscopie, mais le MSPT est particulièrement sensible aux impuretés des échantillons. La diffusion accrue provenant de la surface vitrée des couvercles non nettoyés empêche toute mesure quantitative iSCAT. Notamment, même les particules de saleté ou de poussière résiduelles sur un verre insuffisamment nettoyé peuvent provoquer des distorsions d’image notables, reconnaissables comme des points lumineux en mode d’imagerie natif (Figure 7A). Bien que ces défauts soient éliminés par l’estimation de fond en raison de leur nature statique, la détermination précise du contraste d’une particule peut être altérée et donc influencer négativement son analyse quantitative. Un autre problème courant rencontré dans les expériences MSPT sont les vésicules restantes qui flottent (encerclées en orange) à travers le champ de vision ou les vésicules non fusionnées qui sont coincées (encerclées en bleu) à une position spécifique sur la membrane et apparaissent comme de grands diffuseurs pulsés (Figure 7B). Pour minimiser leur apparition et leur interférence avec l’acquisition de films, il est recommandé de bien laver le SLB avant d’ajouter la protéine et d’utiliser des mélanges fraîchement préparés de petites vésicules unilamellaires (VUS) et de cations divalents. Un facteur qui doit être pris en compte pour la conception d’expériences de suivi des particules sensibles à la masse est la densité des macromolécules associées à l’interface membranaire. Des densités de particules élevées sur la membrane peuvent en effet causer des problèmes pour deux raisons : i) La liaison des détections de particules à partir de trames consécutives à des trajectoires devient ambiguë et augmente donc la probabilité d’erreurs et de coefficients de diffusion mal évalués. ii) La masse des particules, qui est extraite de l’amplitude de leur ajustement PSF correspondant, devient systématiquement sous-estimée et les pics de masse s’élargissent car la séparation du signal de fond statique du signal de particules dynamiques est de plus en plus difficile (Figure 7C). Actuellement, l’évaluation visuelle de la qualité des données dans le processus d’acquisition de vidéos MSPT est difficile sur les microscopes commerciaux disponibles car la vue ratiométrique implémentée dans le logiciel d’acquisition utilise la suppression d’arrière-plan établie pour la photométrie de masse21 au lieu de l’algorithme basé sur la médiane décrit ici et dans les références24,25 (Figure 7D ). L’élimination continue de l’arrière-plan basée sur la moyenne utilisée pour visualiser les molécules d’atterrissage en photométrie de masse fait apparaître les particules diffusantes comme des fronts sombres avec des queues brillantes, ce qui rend les taches très anisotropes et interfère avec l’ajustement PSF pendant la procédure de détection. Ainsi, l’utilisation du traitement d’image basé sur la moyenne mis en œuvre dans le logiciel d’acquisition ne convient pas à l’analyse de biomolécules diffusantes sur des membranes. Figure 1 : Diagramme de flux de processus des différentes étapes requises pour analyser les interactions protéine-membrane avec le suivi des particules sensibles à la masse (MSPT). Pour préparer les échantillons pour les mesures MSPT, les lames de couverture en verre doivent être soigneusement nettoyées et activées avec un plasma d’oxygène. Après leur assemblage dans des chambres d’écoulement d’échantillons, de petites vésicules unilamellaires (VUS) sont préparées pour la formation de bicouche lipidique (SLB) soutenue et tous les tampons de réaction sont filtrés pour réduire la diffusion de fond. Des VUS sont ajoutés pour former des bicouches lipidiques dans les chambres d’écoulement. En option, des cations divalents tels que les ions Ca2+ peuvent être ajoutés aux VUS pour favoriser la rupture des vésicules. Enfin, de faibles concentrations de la protéine d’intérêt sont évacuées dans la chambre de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Vue native et ratiométrique de surfaces exemplaires pertinentes pour les mesures MSPT. Images représentatives de la rugosité de surface d’une lame de couverture de verre (A), lors de la formation d’une bicouche lipidique supportée (B), avec une bicouche lipidique supportée intacte (C) et de protéines exemplaires reconstituées sur un SLB (D). Les quatre exemples sont affichés en mode natif, auquel on peut accéder pendant la mesure elle-même, et en tant qu’images ratiométriques traitées après suppression de l’arrière-plan basée sur la médiane. Les barres d’échelle représentent 1 μm. Pour l’analyse des données (voir le bloc-notes Jupyter accompagné; étape 9), les paramètres suivants ont été utilisés: taille médiane de la fenêtre (window_length) = 1001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Diagramme étape par étape des étapes requises pour la collecte et l’analyse des données MSPT. Après l’acquisition des données pour l’échantillon d’intérêt sur le photomètre de masse, les films sont traités pour supprimer l’arrière-plan statique grâce à une approche médiane coulissante au pixel. Par la suite, les particules candidates sont identifiées et ajustées par une fonction d’étalement ponctuel (PSF) avant leur liaison dans les trajectoires des particules. Pour permettre la détermination du coefficient de diffusion pour chaque particule, une analyse du déplacement au carré moyen (MSD) ou de la distribution de distance de saut (JDD) est utilisée. À ce stade, les valeurs de contraste peuvent être transformées en masses moléculaires selon la relation contraste-masse déterminée par la stratégie d’étalonnage. En dernière étape, les trajectoires peuvent être filtrées en fonction de leur longueur ou de la densité des particules de la membrane et visualisées par une estimation bidimensionnelle de la densité du noyau (2D-KDE). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Étalonnage de la relation masse-contraste pour les mesures MSPT. (A) Cadres ratiométriques représentatifs obtenus pour des complexes protéiques étalons de streptavidine exemplaires diffusant sur une bicouche lipidique supportée contenant un faible pourcentage de lipides biotinylés (rapport DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE de 70:29,99:0,01 mol%). En tant que modèles d’étalons de poids moléculaire, la streptavidinemonovalente 28 (STP uniquement) ou la streptavidinedivalente 28 en complexe avec l’albumine sérique bovine biotinylée (BSA), la protéine A biotinylée (prA), la phosphatase alcaline biotinylée (AP) ou la fibronectine biotinylée (FN) sont montrées. Les taches candidates sont surlignées en orange (cercles pointillés) et les détections de particules réussies sont surlignées en rouge (cercles pleins). Les barres d’échelle représentent 1 μm. (B) Distributions de densité de probabilité des valeurs de contraste obtenues pour les cinq protéines standard du modèle. Toutes les données affichées représentent des distributions groupées de trois expériences indépendantes par condition : STP seulement n = 82 719 ; BSA n = 9 034; prA n = 22 204; AP n = 69 065 et FN n = 71 759 trajectoires. Par rapport au nombre de particules déterminé pour les membranes contenant des protéines, le nombre de particules détectées sur une bicouche vide est négligeable à des densités membranaires modérées (figure supplémentaire 1). Les pics de contraste pris en compte pour l’étalonnage de masse sont marqués par des lignes continues tandis que les pics en pointillés représentent des états oligomères non pris en compte. (C) Courbe d’étalonnage contraste-masse dérivée des contrastes de crête dans le panneau D et des masses de séquence respectives des complexes. Les barres d’erreur affichent l’erreur-type des emplacements de pointe estimés par amorçage (100 rééchantillons de 1 000 trajectoires chacun). Pour l’analyse des données (voir bloc-notes Jupyter ; étape 9), les paramètres suivants ont été utilisés : taille médiane de la fenêtre (window_length) = 1 001 images, seuil de détection (thresh) = 0,00055, plage de recherche (dmax) = 4 pixels, mémoire (max_frames_to_vanish) = 0 images, longueur de trajectoire minimale (minimum_trajectory_length) = 7 images (STP uniquement), 9 images (BSA/FN), 15 images (prA), 10 images (AP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Déchiffrement des états oligomères des protéines associées à la membrane. (A) Estimations 2D de la densité du noyau de la masse et du coefficient de diffusion de la streptavidine tétravalente en complexe avec de l’aldolase biotinylée (panneau de gauche) ou avec un anticorps IgG de chèvre modifié par la biotine (panneau de droite). La reconstitution des deux complexes a été réalisée sur une bicouche lipidique supportée contenant du DOPC, du DOPG et du Biotinyl Cap PE dans un rapport de 70:29,99:0,01 mol%, respectivement. Au total, 116 787 trajectoires de trois réplicats indépendants ont été incluses pour le complexe streptavidine-aldolase (densité de particules de 0,1 μm-2) et 348 405 pour le composite streptavidine-IgG (densité de particules de 0,1 μm-2). Seules les particules d’une longueur de piste d’au moins cinq images ont été incluses. Les distributions de probabilité marginale de la masse moléculaire (en haut) et du coefficient de diffusion (à droite) sont présentées. Le x noir dans les deux panneaux marque les maxima locaux respectifs du KDE. (B) Comparaison des masses oligomères déterminées pour le complexe de streptavidine tétravalente avec l’aldolase modifiée par la biotine (panneau de gauche) ou les IgG biotinylées (panneau de droite) avec, selon les masses de séquence, les poids moléculaires attendus. L’abréviation SU est introduite au nom de la sous-unité de la protéine des intérêts. Les barres d’erreur affichent l’erreur-type des emplacements de pointe estimés par amorçage (100 rééchantillons de 1 000 trajectoires chacun). Pour l’analyse des données (voir bloc-notes Jupyter accompagné; étape 9), les paramètres suivants ont été utilisés : taille médiane de la fenêtre (window_length) = 1 001 images, seuil de détection (thresh) = 0,00055, plage de recherche (dmax) = 4 pixels, mémoire (max_frames_to_vanish) = 0 images, longueur de trajectoire minimale (minimum_trajectory_length) = 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Dissolution du comportement diffusif des protéines natives interagissant avec la membrane annexine V (AnV) et sous-unité B (CTxB) de la toxine cholérique. (A) Estimations 2D de la densité du noyau de la masse et du coefficient de diffusion de l’annexine V (panneau de gauche) et de la sous-unité B de la toxine cholérique (panneau de droite). Pour la reconstitution des membranes AnV et CTxB, des compositions lipidiques de 80:20 mol% DOPC à DOPS et de 99,99:0,01 mol% DOPC à GM1 ont été utilisées, respectivement. Au total, 206 819 trajectoires de trois réplicats indépendants ont été incluses pour AnV (densité de particules de 0,1 μm-2) et 142 895 trajectoires pour CTxB (densité de particules de 0,2 μm-2). (B) Estimations 2D de la densité du noyau des mélanges CTxB et AnV dans un rapport de 1:1 (panneau de gauche) ou de 2:1 (panneau de droite), respectivement. La reconstitution des mélanges de protéines a été réalisée sur une bicouche lipidique supportée contenant des lipides DOPC, DOPS et GM1 dans un rapport de 80:19,99:0,01 mol%. Au total, 42 696 trajectoires de trois répétitions indépendantes ont été incluses pour le mélange 1:1 (densité de particules de 0,1 μm-2) et 264 561 trajectoires pour le rapport 2:1 (densité de particules de 0,3 μm-2). Pour (A) et (B), seules les particules d’une longueur de piste d’au moins cinq images ont été incluses. Les distributions de probabilité marginale de la masse moléculaire (en haut) et du coefficient de diffusion (à droite) sont présentées. Le x blanc dans chaque panneau marque le maximum global respectif du KDE. Pour l’analyse des données (voir bloc-notes Jupyter accompagné; étape 9), les paramètres suivants ont été utilisés : taille médiane de la fenêtre (window_length) = 1 001 images, seuil de détection (thresh) = 0,00055, plage de recherche (dmax) = 4 pixels, mémoire (max_frames_to_vanish) = 0 images, longueur de trajectoire minimale (minimum_trajectory_length) = 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7: Complications potentielles au cours des mesures MSPT ou lors de l’analyse des données. (A) Images représentatives de la rugosité de surface affichées à la fois dans la vue ratiométrique native et traitée (suppression médiane de l’arrière-plan) d’une lame de verre de couverture non nettoyée. Dans les deux cas, les points lumineux constituent des impuretés de surface résiduelles qui entravent les mesures sans artefacts. (B) Images exemplaires de vésicules résiduelles dans le champ de vision après un lavage insuffisant de la membrane. Les vésicules statiques (surlignées en bleu) et diffusantes (surlignées en orange) nuiront à la qualité de mesure, soit en raison de pulsations et de remuements, soit en raison de leur mouvement directionnel, respectivement. (C) En tant que technique monoparticulaire, la MSPT nécessite de faibles densités de particules (image représentative, panneau supérieur) pour permettre une liaison et une détermination de masse appropriées de chaque particule. Dans le cas de densités de particules membranaires élevées (panneau central), l’ajustement des particules est altéré, ce qui affecte la détermination de la masse (voir panneau inférieur). (D) Images ratiométriques représentatives de particules diffusant sur une interface membranaire après élimination de fond basée sur la moyenne (panneau supérieur) ou sur la médiane. Pour les particules diffusantes, la stratégie d’élimination de l’arrière-plan basée sur la moyenne produit des images déformées du PSF de la particule, comme on peut le voir dans les petits encarts entre le panneau supérieur et le panneau central. En revanche, les PSF de particules non déformées peuvent être obtenues grâce à l’approche basée sur la médiane. Panneau inférieur : Comparaison des profils de ligne à travers le centre de la FSP obtenue après suppression de l’arrière-plan moyen ou médian. Pour toutes les images natives et ratiométriques affichées dans cette figure, les barres d’échelle représentent 1 μm. Pour l’analyse des données (voir bloc-notes Jupyter accompagné; étape 9), les paramètres suivants ont été utilisés : taille médiane de la fenêtre (window_length) = 1 001 images, seuil de détection (thresh) = 0,00055, plage de recherche (dmax) = 4 pixels, mémoire (max_frames_to_vanish) = 0 images, longueur de trajectoire minimale (minimum_trajectory_length) = 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire 1 : Comparaison des membranes exemptes de protéines et occupées. Images représentatives d’une bicouche lipidique soutenue intacte avant (A) et après (B) l’ajout de streptavidine purifiée (STP). Les taches candidates qui ont été ajustées avec succès au modèle PSF sont encerclées en rouge. (C) Distributions de probabilité de contraste des particules détectées sur une membrane vide (fond membranaire, gris) et sur une bicouche avec des particules de streptavidine diffusantes (bleu). Les deux distributions de probabilité représentent les données regroupées de trois expériences indépendantes avec des paramètres d’acquisition et d’analyse de films identiques. Pour l’analyse des données (voir bloc-notes Jupyter accompagné; étape 9), les paramètres suivants ont été utilisés : taille médiane de la fenêtre (window_length) = 1 001 images, seuil de détection (thresh) = 0,00055, plage de recherche (dmax) = 4 pixels, mémoire (max_frames_to_vanish) = 0 images, longueur de trajectoire minimale (minimum_trajectory_length) = 7 images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Film supplémentaire 1 : Film exemplaire montrant la rupture et la fusion des vésicules en une membrane homogène enregistrée avec le photomètre de masse. Taille médiane de la fenêtre de traitement d’image (window_length) = 1 001 images. Barre d’échelle: 1 μm. Plage de comptage de la caméra: noir = 16 892; blanc = 65 408. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film. Film supplémentaire 2: Films exemplaires montrant la diffusion de complexes d’annexine V (en haut) et d’aldolase biotinylée (en bas) sur une bicouche obtenue à partir de mesures MSPT. Taille médiane de la fenêtre de traitement d’image (window_length) = 1 001 images. Barre d’échelle: 1 μm. Plage de contraste de diffusion interférométrique: noir = -0,0075; blanc = 0,0075. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.