哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

翻訳後修飾(PTM)は、細胞の恒常性に不可欠なタンパク質調節に関する重要なメカニズムです。タンパク質ユビキチル化は、真核生物においていくつかの細胞転帰をもたらす異なるシグナルの集合体を作り出す動的で複雑な修飾である。ユビキチル化は、76個のアミノ酸を含むユビキチンタンパク質の基質への結合からなる可逆的なプロセスであり、3つの異なる反応1によって構成される酵素カスケードで^起こる。第1のステップは、ユビキチンC末端とE1酵素の活性部位に存在するシステイン残基との間に高エネルギーチオエステル結合ユビキチンを形成するATP加水分解に依存するユビキチン活性化によって特徴付けられる。続いて、ユビキチンはE2酵素に転移し、ユビキチンとのチオエステル様複合体を形成する。その後、ユビキチンは、E2によって、またはより頻繁には、基質^2,3を認識して相互作用するE3酵素によって^基質に共有結合^される。時折、E4酵素(ユビキチン鎖伸長因子)がマルチユビキチン鎖集合を促進するために必要である³。

ユビキチンは7つのリジン残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、およびK63)を有し、いくつかのエフェクタータンパク質によって認識されるであろう異なる三次元構造を生成するために別個の結合を生成するポリユビキチン鎖の形成を可能にする^4,5。したがって、基質に導入されるポリユビキチン鎖の種類は、その細胞運命を決定するために不可欠である⁶、^7、8。さらに、基板は、N-デグロンと呼ばれるN末端残基を介してユビキチン化することもできる。特定のE3ユビキチンリガーゼはN-degron認識に関与し、近くのリジン残基⁹のポリユビキチル化を可能にする。

今日では、40種類以上のSCF特異的基質が特徴付けられています。その中で、細胞の分化および発生ならびに細胞の生存および死を含むいくつかの生物学的経路の主要な調節因子が見出され得る^{10、11、12、13}。したがって、各E3ユビキチンリガーゼの特異的基質の同定は、様々な生物学的事象の包括的なマップを設計するために不可欠である。真の基質の同定は生化学的に困難ですが、生化学ベースの方法の使用は、鎖特異性およびモノユビキチル化とポリユビキチル化の区別を評価するのに非常に適しています¹⁴。この研究は、基質UXT-V2(ユビキタス発現プレフォールディン様シャペロンアイソフォーム2)を過剰発現する哺乳動物細胞株HEK293TとE3ユビキチンリガーゼ複合体SCF(Fbxo7)を用いたユビキチル化アッセイのための完全なプロトコールを記載する。UXT-V2はNF-κBシグナル伝達に不可欠な補助因子であり、このタンパク質が細胞内でノックダウンされると、TNF-α誘導NF-κB活性化を阻害する¹¹。したがって、ポリユビキチル化UXT-V2を検出するために、プロテアソーム複合体¹⁵の26Sサブユニットのタンパク質分解活性を遮断する能力を有することから、プロテアソーム阻害剤MG132が使用される。さらに、細胞抽出液を小規模IPに提出して基質を精製し、アガロース樹脂に固定化された特異的抗体を利用して、選択した抗体を用いたWBによるその後の検出を行う。このプロトコルは、細胞環境における基質ユビキチル化を検証するのに非常に有用であり、異なるタイプの哺乳動物細胞および他のE3ユビキチンリガーゼ複合体にも適合させることができる。しかし、両方のプロトコールが真の基質の同定に関して互いに補完し合うため、in vitroユビキチル化アッセイを通じて試験された基質を検証することも必要です。