JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63559
, , , , ,
1Oxidative Stress Group, Dept. Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, College of Arts and Sciences,University of South Florida, 2Cepheid (Danaher Corp.),US Technical Operations, 3Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences,King Saud University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Environment,Florida International University, 5Leicester School of Allied Health Sciences, Faculty of Health and Life Sciences,De Montfort University

Summary

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Abstract

Hücreler sürekli olarak iç ve dış ortamlardan kaynaklanan ve DNA’ya zarar verebilecek ajanlara maruz kalırlar. Bu hasar anormal hücre fonksiyonuna neden olabilir ve bu nedenle DNA hasarı, kanser, nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalık ve yaşlanma gibi tüm önemli insan hastalıklarının gelişiminde kritik bir rol oynayabilir. Tek hücreli jel elektroforezi (yani, kuyruklu yıldız testi), çok çeşitli DNA hasarı türlerinin (örneğin, tek ve çift iplikli kırılmalar, alkali-kararsız bölgeler, DNA-DNA çapraz bağları ve belirli onarım enzimleri, oksitlenmiş pürinler ve pirimidinlerle birlikte) oluşumunu ve onarımını incelemek için en yaygın ve hassas yöntemlerden biridir. Sistemleri. Bununla birlikte, geleneksel tahlilin düşük numune verimi ve zahmetli numune çalışması, mümkün olan en geniş uygulama için sınırlayıcı faktörlerdir. Kuyruklu yıldızların “puanlanması” giderek daha otomatik hale geldiğinden, sınırlama artık önemli sayıda kuyruklu yıldız slaytını işleme yeteneğidir. Burada, kuyruklu yıldız testinin (HTP kuyruklu yıldız testi) yüksek verimli (HTP) bir varyantı geliştirilmiştir, bu da analiz edilen numune sayısını önemli ölçüde artırır, tahlil çalışma süresini, bireysel slayt manipülasyonlarının sayısını, reaktif gereksinimlerini ve jellere fiziksel hasar riskini azaltır. Ayrıca, elektroforez tankının ayak izi, kızakların dikey yönü ve entegre soğutma nedeniyle önemli ölçüde azalır. Burada ayrıca kuyruklu yıldız jellerinin katılaşmasını uygun ve verimli bir şekilde kolaylaştıran kuyruklu yıldız tahlil slaytlarını soğutmaya yönelik yeni bir yaklaşım da bildirilmiştir. Burada, bu cihazların temsili kuyruklu yıldız tahlil yöntemlerine uygulanması açıklanmıştır. Bu basit yenilikler, kuyruklu yıldız testinin kullanımını ve maruziyet biyolojisi, ekotoksikoloji, biyomonitörizasyon, toksisite taraması / testi gibi çalışma alanlarına uygulanmasını ve patogenezi anlamayı büyük ölçüde desteklemektedir.

Introduction

Hücreler sürekli olarak iç ve dış ortamlardan kaynaklanan ve DNA 1,2’ye zarar verebilecek ajanlara maruz kalırlar. Bu hasar anormal hücre fonksiyonuna neden olabilir3 ve bu nedenle DNA hasarı, kanser, nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalık ve yaşlanma4 gibi birçok büyük insan hastalığının gelişiminde kritik bir rol oynayabilir. Kuyruklu yıldız tahlili (tek hücreli jel elektroforezi olarak da adlandırılır), hücresel DNA hasarını tespit etmek ve ölçmek için giderek daha popüler bir yöntemdir.

En basit haliyle, alkali kuyruklu yıldız testi (ACA), her ikisi de alkali koşullar altında tek iplikçik kırılmalar haline gelen apurinik / apirimidinik bölgeler ve alkali-kararsız bölgeler (ALS) ile birlikte iplik kırılmalarını (SB; hem tek hem de çift) tespit eder5. Nötr pH kuyruklu yıldız testi, açık tek ve çift iplikçikli kırılmalarıdeğerlendirebilir 6. Ayrıca, ACA, bir dizi DNA onarım enzimi ile birlikte, örneğin oksitlenmiş pürinler (insan 8-oksoguanin DNA glikozilaz 1; hOGG17 kullanımı ile tanımlanan) gibi önemli bir dizi DNA hasarı türünü tespit edebilir; oksitlenmiş pirimidinler (Endonükleaz III kullanılarak; EndoIII) ve siklobütan pirimidin dimerleri (T4 endonükleaz V kullanarak; T4endoV)8. Kuyruklu yıldız testi, cisplatin9,10,11 gibi çapraz bağlama ajanları tarafından indüklenen DNA lezyonlarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Tahlilin resmi adıyla, yani tek hücreli jel elektroforeziyle belirtildiği gibi, tahlil, analiz edilen hücrelerin tek bir hücre süspansiyonu olmasına dayanır; En yaygın olarak, bunlar kültürlenmiş hücrelerdir, ancak tam kandan izole edilebilir 12,13 veya tam kanın kendisi 14,15 kullanılabilir. Alternatif olarak, katı dokulardan tek hücreli bir süspansiyon üretilebilir.

Birkaç istisna dışında, özellikle de Engleward laboratuvarı16’dan CometChip raporları, genel kuyruklu yıldız tahlil protokolü, tahlilin mucitleri tarafından orijinal olarak tanımlanandan önemli ölçüde değişmemiştir (Östling ve Johansson 17 ve Singh veark.18). Kuyruklu yıldız testi çok sayıda adım içerir (Şekil 1). Bu adımların çoğu, ince, hücre içeren agaroz jellerinin, her seferinde bir slaytın transferini içerir ve bu nedenle, deneyin başarısını tehlikeye atarak jelin hasar görmesi veya kaybolması riskini taşır. Sonuç olarak, kuyruklu yıldız tahlili, özellikle önemli sayıda slayt çalıştırılıyorsa, zaman alıcı olabilir. Tipik olarak, soğutma için ıslak buz içeren daha büyük bir tepside oturan büyük (33 cm x 59 cm x 9 cm) bir elektroforez tankında maksimum 40 slayt çalıştırılır. Son zamanlarda, lizis adımının süresini azaltarak ve19’u boyamadan önce slaytları kurutmayarak tahlil çalışma süresinin 1 güne kısaltılabileceği bildirilmiştir.

Mevcut yazarlar daha önce, kuyruklu yıldız tahlil süreci20,21,22 boyunca birden fazla (25 parti) kuyruklu yıldız tahlili mikroskop slaytlarının aynı anda manipüle edilebildiği yüksek verimli alkali kuyruklu yıldız testine (HTP ACA) yeni bir yaklaşım bildirmişlerdir. Bu patentli yaklaşım, mikroskop slaytlarını ayrı ayrı manipüle etme ihtiyacını ortadan kaldırarak numune içeren jellerin hasar görme veya kaybolma riskini en aza indirir ve mikroskop slaytlarını kullanan kuyruklu yıldız testinin tüm varyantlarına uygulanabilir. Slayt içeren raflar, manipülasyonlar sırasında jelleri korur ve sonuç olarak, numune işleme daha hızlı ve daha verimlidir. Slaytlar ayrıca, yatay yönde değil, dikey yönde tutulan raflarda elektroforeze maruz kalabilir. Bu ve entegre soğutma, elektroforez tankının ayak izini önemli ölçüde azaltır ve ıslak buz ihtiyacını ortadan kaldırır. Birlikte ele alındığında, bu geleneksel prosedüre göre önemli bir gelişmeyi temsil eder. Kullanılan ekipman Şekil 2’de gösterilmiştir. Burada açıklanan protokoller, bu yeni yaklaşımı kullanarak, alkali-kararsız bölgelerin (ALS), DNA iplikler arası çapraz bağların (ICL) ve çeşitli DNA onarım enzimlerinin substratlarının tespiti için kültürlenmiş hücrelere ve tam kan14’e temsili uygulamayı göstermektedir.

Protocol

Bu çalışmada ticari olarak temin edilebilen kan örnekleri kullanılmıştır. Kurumumuzda ticari olarak temin edilebilen kanın kullanımı için Kurumsal İnceleme Kurulu onayına gerek yoktur. 1. Kuyruklu yıldız testi için malzemelerin hazırlanması Mikroskop slaytlarının hazırlanmasıKaplama slaytlarından önce katılaşmanın önlenmesi için agarozu ddH 2 O. Deposunda 37 °C’de çözmek için 50 mL’lik bir tüp ve mikrodalga fırında %1 (w/v) normal erime noktası agarozu [çiftdamıtılmış suda (ddH2O)] dökün. Katılaşma meydana gelirse, atın ve taze hazırlayın. Ön kat mikroskobu, kızakları %1 (w/v) normal erime noktası agarozu içeren 50 mL tüpe batırarak kayar. Slaytları daldırdıktan sonra slaytların arkasını hızlıca silin.NOT: Slaytların arkasının düzgün bir şekilde silinmemesi, mikroskopla adım adım analiz sırasında slaytların arka plan gürültüsünü artıracaktır. Kaplamalı slaytı, buzlu bölümün sağ alt köşesinde kalıcı bir işaretleyici ile etiketleyin (Şekil 3A). Bu, slaytın hangi tarafının önceden kaplanmış olduğunu gösterir. Agarozun oda sıcaklığında gece boyunca ayarlanmasına ve kurumasına izin verin. Kurutulmuş slaytları kağıt mendile sarın ve bir kutuda saklayın. 2. Numunelerin hazırlanması Kültürlenmiş hücrelerNOT: İlk olarak, kuyruklu yıldız testine başlamadan önce hücreleri zararlı ajanlarla tedavi edin. Ardından, aşağıdakileri gerçekleştirin.Hücreler yapışkan ise, hücrelerin uygun akıtılmasında, hücre kültürü şişesinden veya hücre kültürü Petri kaplarından serbest bırakmak için hücreleri tripsinize edin. Serum içeren ortamlar ekleyerek tripsin nötralize edin. Hücreleri 50 mL’lik bir tüpe aktarın, santrifüj yapın (örneğin, HaCaT’ler için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj), süpernatanı yavaşça çıkarın ve hücre peletine 1 mL PBS ekleyin. Hücre sayımı gerçekleştirin. 30.000 hücreyi 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C’de 5 dakika boyunca 7.607 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı nazikçe çıkarın ve kuyruklu yıldız testini yapmadan önce hücre peletini karanlıkta buz üzerinde saklayın.NOT: Hücreler, diğer etkilerin yanı sıra, başka bir yerde bildirildiği gibi, artefakt DNA hasarının oluşumunu ve değiştirilmiş DNA hasar tepkisini önlemek için kuyruklu yıldız testini yapmadan önce düzenli olarak Mikoplazma kontaminasyonu açısından test edilmelidir23. Santrifüjleme koşulları, kullanılan hücre tipine bağlı olarak gerektiğinde değiştirilebilir. Onarım testi için kültürlenmiş hücrelerin hazırlanmasıHücre kültürü şişesindeki veya Petri tabaklarındaki kültür hücreleri. Tedavi sırasında onarımın gerçekleşmesini önlemek için hücreleri zararlı maddelerle (örneğin, BE-M17 hücreleri için,20dakika boyunca 50 μM H 2 O2 ile muamele edin) tedavi etmeden önce hücreleri iki kez 1 mL PBS ile yıkayın. Artık zararlı maddeleri gidermek için hücreleri iki kez 1 mL PBS ile nazikçe yıkayın. Hücre kültürü ortamını yeniden tanıtın ve hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 ° C, % 5 CO 2) değişen sürelerde (örneğin, 0 dakika, 30 dakika, 2 saat, 2 saat, 6 saat, 24 saat ve 30 saat) onarılmasına izinverin. Her zaman noktasında,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren hücre kültürü ortamında 30.000 hücre toplayın ve bunları -80 ° C’de saklayın. Kuyruklu yıldız testini yapmadan önce, hücreleri bir su banyosunda 37 ° C’de hızlı bir şekilde çözün ve 4 ° C’de 5 dakika boyunca 7.607 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve tahlili yapmadan önce hücre peletini buz üzerinde saklayın (yani, adım 3’ten). Tam kanın hazırlanmasıNOT: Aşağıdaki yöntem, (i) bir kan örneği elde etmek için minimal invaziv bir yaklaşım olmaktan, (ii) kuyruklu yıldız tahlilinden önce PBMC’nin izolasyonunu gerektirmemekten ve (iii) kan örneklerinin (hacmi 250 μL'<) -80 ° C'de 1 aya kadar saklanmasına izin vermekten (daha yeni kanıtlar daha uzun süre depolamanın mümkün olduğunu göstermesine rağmen) yararlanmaktadır. kriyopreservatif gerekmeksizin ve risk veya artefakt hasar oluşumuolmadan 14. Hastalardan veya hayvanlardan kan örnekleri almadan önce etik onay veya eşdeğeri gerekebilir. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen kan örnekleri bu çalışmada olduğu gibi kullanılabilir. Kurumumuzda ticari olarak temin edilebilen kanın kullanımı için Kurumsal İnceleme Kurulu onayına gerek yoktur.Bir pipet kullanarak, tam kan örneklerini (<250 μL) (Malzeme Tablosu) 0.4 mg EDTA (250 μL kan başına) içeren minimum hacim içeren bir toplama tüpüne aktarın. HTP kuyruklu yıldız testini yapmadan önce kan örneklerini -80 ° C’de dondurun. Çözülme, kan örneklerini (<250 μL) oda sıcaklığında, ısıtmadan sakladı. Kuyruklu yıldız tahlili yapılmadan önce tüm kanın 5 μL’sini mikrosantrifüj tüplerine aktarın (bkz. adım 3). 3. Hücre lizisi NOT: Tüm prosedürleri buz üzerinde uygulayın. Jel başına 12.000 hücre veya 2.5 μL tam kan kullanın. Bir mikrodalga kullanarak PBS’de çözünmüş% 0.6 (w / v) düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve katılaşmasını önlemek için 37 ° C’de bir su banyosuna yerleştirin. Önceden kaplanmış slaytların buzlu ucunu, kalıcı bir işaretleyici veya kalem kullanarak araştırmacının adı, tarihi ve tedavi bilgileriyle etiketleyin. Düz bir tezgah üzerine bir soğutma plakası yerleştirin ve iki dondurulmuş soğutma paketini metal yüzeyin altındaki sürgülü çekmeceye yerleştirin ( Şekil 4’te gösterildiği gibi)21. Slaytları soğutma plakasına yerleştirin ve %0,6 (w/v) düşük erime noktalı agaroz içeren hücreleri eklemeden önce slaytların 1-2 dakika önceden soğutulmasına izin verin (adım 3.7).NOT: Kızakların soğutma plakası üzerinde 1-2 dakikadan fazla bırakılması, ortam nemi nedeniyle kızak yüzeyinde yoğuşmanın oluşmasına neden olabilir. Bu, düşük erime noktası agaroz jellerini slaytlarda daha az kararlı hale getirebilir. Pelet’i (adım 2.2.7) vorteks yaparak dağıtın. Tüm süpernatantın peletten çıkarıldığından emin olun. Numune tüplerini (pelet edilmiş hücreleri içeren) hemen buzun üzerine yerleştirin.NOT: Numune içeren tüpleri santrifüje yerleştirirken, pelet tüpün bu tarafında toplanacak şekilde menteşe dışa bakacak şekilde yerleştirin. Bazen peleti görmek zordur ve süpernatanı çıkarırken yerinden çıkarmak kolaydır. Bu yönde tüp kapağı ile santrifüjleme, hücre peletinin nerede olacağını bilmesini sağlayacaktır. Hücre peletini 200 μL% 0.6 düşük erime noktalı agaroz (LMP agaroz) ile yeniden askıya alın ve kabarcıklar oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın. Daha sonra, 80 μL LMP agaroz içeren hücreleri soğutulmuş bir slayta hızlı bir şekilde aktarın ve jel üzerine hızlı bir şekilde bir kapak parçası yerleştirin. Jelin soğutma plakasına 1-2 dakika boyunca oturmasına izin verin. Bu arada, 500 mL’lik bir çalışma lizis tamponu çözeltisi hazırlayın (Tablo 1) ve lizis kabına dökün (Şekil 2). Jeller ayarlandıktan sonra, baş parmak ve işaret parmağı arasındaki sürgüyü hafifçe tutarak ve kapak kaymasını jelden kaydırarak kapak kapaklarını hızlı bir şekilde çıkarın. Numune içeren slaytları slayt taşıyıcısının içine yerleştirin (slaytlardaki tüm siyah “nokta” işaretleri bir taşıyıcıya yerleştirildiklerinde aynı yöne bakmalıdır) (Şekil 3B) ve ardından slayt taşıyıcısını lizis kabının içine yerleştirin (Şekil 2). Lizis kabının kapağını kapatın ve lizis kabını gece boyunca buzdolabında 4 ° C’de veya oda sıcaklığında 30 dakika (operatörün zaman çizelgesi19’a en uygun olanı) saklayın. 4. Elektroforez Sürgü taşıyıcıyı lizis kabından dikkatlice çıkarın. Jelleri rahatsız etmemeye özen gösterin. Sürgü taşıyıcıyı buz gibi soğuk ddH 2 O ile önceden yüklenmiş bir çamaşır kabına yavaşça yerleştirin ve slaytlarınddH2O ile tamamen kaplandığından emin olmak için 30 dakika bekletin. Optimum tampon sıcaklığını korumak için elektroforez tankının altındaki sürgülü çekmecenin içine dondurulmuş bir soğutma paketi yerleştirin. Elektroforez tankına buz gibi soğuk elektroforez çalışma solüsyonunu (Tablo 1) dikkatlice ekleyin ve sürgü taşıyıcıyı elektroforez tankına aktarın. Slaytları, hücre içeren jellerle (yani, buzlu / etiketleme uçları DEĞİL) berrak kısımları katotu (kırmızı elektrot) işaret edecek şekilde yönlendirin. Slaytların elektroforez tankında 20 dakika oturmasına izin verin, böylece DNA gevşer ve gevşer. Bu adım sırasında güç kaynağını kapalı tutun. Gerekirse, soğutmayı en üst düzeye çıkarmak için yeni bir dondurulmuş soğutma paketi takın. 1,19 V/cm’de 20 dakika boyunca elektroforez yapın veya koşullar optimize edilmiş olursa olsun.NOT: Her laboratuvar24 için elektroforez çalışma koşullarının ve tampon hacminin optimizasyonu önerilir. Elektroforez sırasında sadece tek bir slayt taşıyıcısı kullanmak, slaytların elektroforez tamponunun direnci üzerinde herhangi bir etkiye neden olmaz ve yazarlar, slaytların sayısı değiştiğinde voltaj veya akımda önemli bir etki görmemişlerdir. Güç kaynağını kapatın, sürgü taşıyıcısını elektroforez tankından dikkatlice çıkarın ve 30 saniye boyunca kağıt mendil üzerinde boşalmasına izin verin. Sürgü taşıyıcıyı nötralizasyon tamponu içeren kabın içine yerleştirin (Tablo 1). 20 dakika bekletin. Sürgü taşıyıcıyı nötralizasyon kabından çıkarın, buz gibi soğuk ddH2O içeren çamaşır kabına yerleştirin ve 20 dakika bekletin. Sürgü taşıyıcıyı sudan çıkarın ve kızakların bir inkübatörde 1 saat boyunca 37 °C’de veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin veya operatörün programına bağlı olarak kurumayın19.NOT: Adım 4.11’de kurutma yoksa, 5.2’den itibaren boyama adımını gerçekleştirin. 5. Propidium iyodür (PI) boyama Slaytları yeniden sulandırmak için slayt taşıyıcısını buz gibi soğuk ddH2O içeren bir çamaşır kabına aktarın ve 30 dakika bekletin. Sürgü taşıyıcıyı 2,5 μg/mL propidium iyodür çözeltisi içeren bir boyama kabına yerleştirin.NOT: Propidium iyodür ışığa duyarlıdır, bu nedenle karanlık bir alanda tutun. Aynı zamanda zehirlidir. Boyama kabının kapağını kapatın ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. Slayt taşıyıcısını ayrı bir kaba aktarın ve20dakika boyunca buz gibi soğuk ddH 2 O ile yıkayın. Sürgü taşıyıcıyı çanaktan çıkarın ve operatörün programına veya tercihine bağlı olarak karanlıkta, 37 °C’lik bir inkübatörde veya oda sıcaklığında tamamen kurulayın. Slaytlar tamamen kuruduktan sonra, slayt taşıyıcısından çıkarın ve görüntü analizine hazır olana kadar karanlıkta bir slayt kutusunda saklayın.NOT: Slaytlar süresiz olarak okunabilir durumda kalır ve gerekirse yeniden boyanabilir. 6. Enzim modifiye alkali kuyruklu yıldız testi NOT: Enzim modifiye alkali kuyruklu yıldız testi, lizisten sonra ancak elektroforezden önce bir enzim tedavi adımı kullanır. Enzimin aktivitesi, enzim için substrat olan bölgelerde DNA’da kırılmalara neden olur. Bu testi yapmadan önce, enzim konsantrasyonu ve enzim inkübasyon süresi optimize edilmelidir. Hücre lizisinden sonra (adım 3), slaytları her biri20dakika boyunca buz gibi soğuk ddH 2 O ile iki kez yıkayın. Sürgü taşıyıcıyı sudan çıkarın ve slaytları kağıt havlularla kaplı bir tepsiye aktarın. Optimize edilmiş konsantrasyonda enzimin 80 μL’sini ekleyin (örneğin, enzim reaksiyon tamponunda seyreltilmiş BE-M17 hücreleri için 3.2 U / mL hOGG1) ve enzimi jel içeren numunenin üzerine yaymak için bir kapak kapağı ile örtün. Optimize edilmiş süre boyunca kızakları 37 °C’de inkübe edin (örneğin, hOGG1 için 45 dakika). Kuluçkadan sonra, kapak kapaklarını yavaşça çıkarın ve slaytları taşıyıcıya aktarın.NOT: Enzim işleminden sonra slaytları yıkamayın; doğrudan adım 4.3’ten itibaren elektroforez yapın. 7. DNA inter-strand crosslinks (ICL)-modifiye alkali kuyruklu yıldız testi NOT: ICL-ACA’nın bu varyantının konsepti, DNA’daki ICL’nin varlığının, oksidatif olarak üretilen bir hakarete maruz kaldıktan sonra indüklenen hasarlı DNA’nın elektroforetik göçünü geciktireceğidir. Bu durumda, kuyruklu yıldız kuyruğu ne kadar kısa olursa, ICL25,26,27,28 sayısı o kadar büyük olur. Hücreleri ICL’yi indükleyen bir reaktifle tedavi edin (örneğin, sisplatin; Ek Dosya’ya bakınız). Uygun büyüklükte bir kuyruklu yıldız kuyruğu (~% 20 kuyruk DNA’sı) oluşturmak için yeterli iplik kırılmalarını indüklemek için tedavi edilen hücreleri aşağıdaki ajanlardan biriyle maruz bırakın: hidrojen peroksit (30 dakika boyunca 50 μM H2O 2), iyonlaştırıcı radyasyon (2-5 Gy) veya Ultraviyole B (UVB) (0.5 J /cm2). Ek olarak, bir grup hücreyi adım 7.2’de kullanıldığı gibi aynı ajan ve dozla tedavi ederek pozitif kontrolü kırın (yani, ICL’yi indükleyen ajanla tedavi edilmez). Hücreleri 5 dakika boyunca 7.607 x g’de santrifüj edin, süpernatanı atın, hücre peletini 1 mL PBS ile üç kez yıkayın ve alkali kuyruklu yıldız testine gelince işleyin (adım 3-5). Aşağıdaki formülü kullanarak DNA iplikçikler arası çapraz bağlanma seviyelerini hesaplayın.NOT: MOTM (Ortalama Zeytin Kuyruğu Ansı), ICL modifiye kuyruklu yıldız testini tanımlarken yaygın olarak kullanılan bir kuyruklu yıldız testi bitiş noktasıdır ve kuyruk uzunluğunun ürünü ve kuyruktaki toplam DNA’nın fraksiyonu olarak tanımlanır (yani, kuyruk momenti = kuyruk uzunluğu x kuyruktaki DNA’nın% ‘si)29; TMdi: Hem çapraz bağlama maddesi hem de H2O2(veya diğer iplik kırıcı indükleyici) ile muamele edilen numunelerin kuyruk momenti; TMcu: çapraz bağlama ajanı ile muamele edilmeyen ve H2 O2 ile muamele edilmeyennumunelerin kuyruk momenti (işlem yapılmamış) ve TMci: çapraz bağlama ajanı ile muamele edilmemiş ancakH2O2ile muamele edilmiş numunelerin kuyruk momenti. 8. Kuyruklu yıldız puanlaması ve veri analizi NOT: “Kuyruklu yıldız” terimi, tahlil yapıldıktan sonra mikroskop altında bakıldığında hasarlı hücrelerin görüntülerinden türemiştir (Şekil 5). Elektroforez koşulları altında, hasarsız hücrelerdeki DNA büyük ölçüde göç etmez, ancak kuyruklu yıldız “kafası” olarak adlandırılan bir sferoidde kalır. Bununla birlikte, iplik kopmalarının varlığı, hücrenin DNA’sının kafadan dışarı göç etmesine ve bir “kuyruk” oluşturmasına izin verir, böylece bir kuyruklu yıldız gibi bir görünüme yol açar (Şekil 5). Kuyrukta ne kadar çok DNA olursa, o kadar fazla hasar oluşur. PI (kırmızı) filtre (λ = 536/617 nm) ve kuyruklu yıldız tahlili puanlama yazılımı ile floresan mikroskobu açın. Jele bir Pasteur pipeti kullanarak bir damla su ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün. Slaytları floresan mikroskobuna yerleştirin ve kuyruklu yıldızları “puanlayın”.NOT: Puanlama, her kuyruklu yıldızda bulunan hasar miktarını belirlemek için kuyruklu yıldızların değerlendirildiği bir araçtır. Genel olarak, bu, kullanıcının seçtiği tercihe göre, ya gözle (kuyruklu yıldızların boyutunu sıfırdan dörde kadar bir ölçekte ölçmek) ya da serbestçe veya ticari olarak temin edilebilen yazılım30 kullanılarak iki yaklaşım kullanılarak elde edilebilir. Genel olarak, her iki yaklaşım da kuyruklu yıldız kuyruğunun boyutunu değerlendirir, ancak kuyruklu yıldızla ilgili çeşitli uç noktalar belirlenebilir. Yazılımı kullanıyorsanız, kuyruklu yıldız kafasının ortasına tıklayın ve yazılım kuyruklu yıldızı otomatik olarak algılayana kadar bekleyin ve ardından seçilen uç noktayı değerlendirin (Şekil 5). Jel başına 50 kuyruklu yıldız ve numune başına 100 kuyruklu yıldız puan alın (yani, farklı DNA zarar verici tedavilere veya bunların replikalarına karşılık gelen her örnek). Deneyleri çoğaltın (n = 2) veya deneyleri üçe katlayın (n = 3).NOT: Yalnızca n=2 çoğaltma deneyleri yapılırsa, istatistiksel analiz yapılamaz, ancak n=3 ise D’agostino normallik testini gerçekleştirin. Çoğu kuyruklu yıldız tahlili verisi normallik testini geçmez. Bu durumda, parametrik olmayan bir test kullanın (Dunn’un çoklu karşılaştırma testi ile Kruskal-Wallis testi ve Mann-Whitney, p < 0.05 olarak ayarlanmış anlamlılığı test eder).

Representative Results

HTP ACA için elektroforez voltajının optimizasyonuİnsan keratinositleri (HaCaTs; Malzeme Tablosu) farklı dozlarda ultraviyole A radyasyonu (UVA) ile ışınlandı (5 veya 10 J/cm2; Şekil 6A), UVB (0,5 veya 1 J/cm2; Şekil 6B) veya hasara neden olmak için 50 μM H2O2 (Şekil 6C) ile muamele edilir. Elektroforez için en uygun voltajı belirlemek için elektroforezin üç farklı voltajı test edildi. Her üç DNA hasarlı tedaviden elde edilen sonuçlar, tüm voltajlar doğrusal doz yanıtları üretirken, en hassas yanıtın 1.19 V / cm ile elde edildiğini ortaya koymuştur. HaCaT’ler, elektroforez sırasında 1 V / cm ve 1.09 V / cm ile karşılaştırıldığında 1.19 V / cm kullanarak en yüksek başlangıç DNA hasarını gösterdi (Şekil 6A-C). Ek olarak, 1.19 V / cm kullanılarak, tüm zararlı tedavilerin ardından en büyük % kuyruk DNA’sı görülür (Şekil 6)31. Fpg modifiye HTP ACA kullanılarak insan tam kanındaki DNA hasarının tespitiİnsan whold kanı (Malzeme Tablosu), hasara neden olmak için farklı dozlarda 10 J /cm2 UVA ile ışınlandı. HTP ACA’da enzim tedavisi için optimal konsantrasyonu belirlemek için dört farklı Fpg konsantrasyonu (1, 2, 4 veya 8 U / mL) kullanıldı. Sonuçlar, optimal DNA hasarı seviyelerinin 4 U / mL Fpg ile ortaya çıktığını göstermiştir (Şekil 7A). UVA ışınlanmış kan örneklerinden temsili kuyruklu yıldız görüntüleri (Şekil 7B). ICL modifiye HTP ACA kullanılarak temsili bir yumurtalık kanseri hücre hattında DNA ICL’nin tespitiBir yumurtalık kanseri hücre hattı (SKOV-3; Malzeme Tablosu) 200 μM sisplatin kombinasyonları ve / veya daha sonra buz üzerinde 30 dakika boyunca 50 μM H2 O2 ilemuamele edildi. Maruz kalmamış hücrelerde kayda değer bir hasar kaydedilmemiştir (Şekil 8A). Tek başınaH2 O2’yemaruz kalmak önemli bir MOTM oluşturmuştur (Şekil 8B). Buna karşılık, ICL’nin indüklendiği hücreler azalmış bir MOTM göstermiştir (Şekil 8C)28. Temsili, yumurtalık kanseri hücre hattında sisplatin kaynaklı DNA ICL’nin oluşumu ve onarımıICL modifiye HTP ACA, bir yumurtalık kanseri hücre hattında sisplatin tarafından indüklenen DNA ICL oluşumu ve onarımı için zaman seyrini belirlemek için kullanıldı (A2780; Malzeme Tablosu). Hücreler 1 saat boyunca 100 μM sisplatin ile tedavi edildi ve daha sonra bir süre boyunca sisplatin içermeyen ortamlarda (RPMI 1640 ortamı% 10 (v / v) fetal sığır serumu (FBS) ile desteklendi) inkübe edildi. Çeşitli zaman noktalarında, ICL seviyelerini belirlemek için ICL modifiye HTP ACA uygulanmıştır (Şekil 9)28. Sisplatin tedavisinden önce ICL saptanmadı. Bununla birlikte, 100 μM sisplatin ile yapılan tek bir tedaviden sonra, ICL seviyeleri önemli ölçüde artmış, 12 saatte zirveye ulaşmış, daha sonra seviyeler 30 saat sonra sıfıra düşmüştür. DNA ICL ve DNA platin seviyeleri arasındaki korelasyonÜç yumurtalık kanseri hücresi, ICL modifiye HTP ACA ve endüktif olarak bağlanmış kütle spektrometrisi (ICP-MS; ayrıntılar için Ek Dosyaya bakınız) tarafından analiz edilmeden önce, farklı seviyelerde DNA-ICL’yi indüklemek için 100 μM sisplatin ile tedavi edildi. Şekil 10’da gösterildiği gibi, DNA’daki farklı Pt seviyeleri ile birlikte üç hücre hattında farklı DNA-ICL seviyeleri indüklenmiştir. DNA ICL seviyeleri ile platin konsantrasyonları arasında pozitif bir korelasyon(R 2 = 0.9235) gözlendi ve DNA platin seviyeleri ile karşılık gelen ICL28 arasındaki ilişkiyi gösterdi. Mikoplazma ile enfekte olmuş ve enfekte olmamış BE-M17 hücrelerinde baz eksizyon onarımıMikoplazma ile enfekte olmuş ve enfekte olmamış BE-M17 hücreleri, 30 dakika boyunca 50 μMH2 O2 ile muamele edildi ve hücrelerin onarılmasına izin verilen farklı süreler boyunca (0 dakika, 30 dakika, 1 saat, 2 saat, 6 saat, 24 saat veya 30 saat) tam ortam (Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle ortamı% 10 (v / v) FBS ile desteklenmiş) ile inkübe edildi. Her zaman noktasında, hücreler hOGG1 modifiye HTP ACA (adım 6) gerçekleştirilmeden önce% 10 DMSO içeren bir ortamda, -80 ° C’de toplandı ve donduruldu. 30 dakika sonra, enfekte olmamış hücrelerde SB / ALS seviyeleri% 21 TD’ye (yüzde kuyruk DNA’sı) düşmüşken, enfekte olmuş hücreler% 49 TD göstermiştir (Şekil 11A). ~ 15 saat sonra, SB / ALS seviyeleri hem enfekte olmuş hem de enfekte olmamış hücrelerde taban çizgisine geri dönmüştür. Oksitlenmiş pürinler için, enfekte olmamış BE-M17, 30 saat içinde taban çizgisine dönmeden önce başlangıçta hasarda küçük bir artış gösterdi (Şekil 11B). Buna karşılık, enfekte olmuş hücreler, yüksek kalan ve 30 saat sonra bile taban çizgisi seviyelerine geri dönmeyen oksitlenmiş pürinlerde sürekli, anlamlı bir artış gösterdi (Şekil 11B)23. Şekil 1: Geleneksel alkali kuyruklu yıldız testi prosedürüne genel bakış . (i) Kültürlenmiş hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonu veya tam kan örneği% 0.6 (w / v) LMP agarozu ile karıştırılır. (ii) Hücre/agaroz karışımı önceden kaplanmış mikroskop kızaklarına uygulanır ve katılaşıncaya kadar örtü ile kaplanır. (iii) Hücreler, (iv) ddH2O ile yıkanmadan önce, nükleoid cisimler oluşturan yüksek pH lizis tamponu kullanılarak gece boyunca lize edilir. (v) Hücresel DNA, yüksek pH elektroforez tamponunda gevşer. İplik kırılmalarının varlığı, DNA’nın gevşemesine ve gevşemesine izin verir ve elektroforez altında, DNA nükleoid gövdeden çekilerek bir kuyruk oluşturur. Slaytlar daha sonra (vi) boşaltılır, kurutulur, (vii) nötralize edilir ve (viii) gece boyunca kurutulmadan önce ddH2O ile yıkanır. Slaytlar daha sonra (x) ddH2O ile rehidre edilir, (xi) boyanır, (xii) yıkanır ve son olarak (xiii) tipik olarak floresan mikroskopi ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak puanlanır ve analiz edilir. Bu rakam önceki bir yayındançoğaltılmıştır 20. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Resim 2: Yüksek verimli kuyruklu yıldız elektroforez sistemini oluşturan malzemeler. HTP elektroforez tankı, HTP rafları ve lizis, yıkama, nötralizasyon ve boyama bulaşıkları gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Bir kuyruklu yıldız tahlil slaytının ve HTP rafının (mikroskop slayt taşıyıcısı) temsili görüntüleri. (A) Doğru yönlendirme için, mikroskop slaytının önceden kaplanmış yüzü, mikroskop slaytının sağ köşesindeki siyah bir nokta ile tanınır. (B) HTP rafının görüntüsü, slaytların elektroforez tankı içindeki yönünü sabitlemek için taşıyıcı üzerindeki tırnaklarla nasıl sıkı bir dikey yönde tutulduğunu göstermektedir. Her taşıyıcı en fazla 25 slayt barındırabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Soğutma plakasının örnek slaytlar ve dondurucu paketleri ile birlikte gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Puanlama sırasında alınan temsili kuyruklu yıldızların ekran görüntüsü. HaCaTs (A) tedavi edilmeden ve (B) HTP ACA uygulanmadan önce 1 J /cm2 UVB ile tedavi edilir. Çoğu yazılım paketi çeşitli kuyruklu yıldız uç noktalarını hesaplayabilir, ancak en yaygın olanları bu görüntülere dayanan % kuyruk DNA’sı (tercih edilen) veya kuyruk momentidir (mavi: başın başlangıcı, yeşil: başın ortası ve mor: kuyruğun sonu). Ölçek çubuğu 10 μm’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: HTP ACA kullanılarak belirlenen elektroforez voltajının yüzde kuyruk DNA’sı üzerindeki etkisini gösteren temsili grafikler. Hücreler, HTP ACA’dan önce (A) 5 veya 10 J / cm 2 UVA, (B) 0.5 veya 1.0 J / cm 2 UVB veya (C) 50 μM H2O 2’ye maruz bırakıldı ve elektroforez voltajı 1, 1.09 veya 1.19 V / cm’de idi. Veriler, n = 2 yinelenen deneyden31 200 belirlemenin ortalamasını temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Fpg modifiye HTP ACA tarafından analiz edilen insan kanının temsili grafiği ve kuyruklu yıldız görüntüleri. İnsan kan örnekleri, lizis adımından önce buz üzerinde 10 J /cm2 UVA veya sahte ışınlanmış (‘ctrl’) ile ışınlandı. Elektroforezden önce enzim tedavisi için farklı Fpg konsantrasyonları (1, 2, 4 veya 8 U / mL) kullanılmıştır. (A) Veriler, n = 3 deneylerinden elde edilen 300 belirlemenin ortalama ± SEM’ini temsil eder. (B) 10 J/cm2 UVA ışınlanmış kan örneklerinde her bir Fpg konsantrasyonu için kuyruklu yıldızların temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu 10 μm’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Sisplatin tedavisini takiben ICL tespitini gösteren temsili kuyruklu yıldız görüntüleri. (A) Herhangi bir tedavi olmaksızın kontrol hücreleri, (B) sadece H2O2 (50 μM) ile tedavi edilen hücreler, (C)H2O2(50 μM) ve sisplatin (200 μM) ile tedavi edilen hücreler, ICL28’in varlığı nedeniyle kuyruğun (B)’den daha kısa olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu 10 μm’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Sisplatin kaynaklı ICL oluşumu ve onarımının kinetiğinin gösterilmesi. A2780 hücreleri, kültür ortamında 1 saat boyunca 100 μM sisplatin ile tedavi edildi. Cisplatin içeren ortam daha sonra çıkarıldı ve hücreler ICL modifiye HTP ACA tarafından analiz edilmeden önce çeşitli zaman noktaları için kültürlendi. Veriler, n = 3 deneyden SEM’± ortalamasını temsileder 28. P < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: DNA ICL ve platin konsantrasyonu arasındaki korelasyon. DNA ICL, ICL modifiye HTP ACA tarafından belirlendi ve platin seviyeleri üç yumurtalık kanseri hücre hattında ICP-MS (Tek Dörtlü Kinetik Enerji Ayrımcılığı, SQ-KED ile) ile ölçüldü. R2 = 0,9235. DNA28’deki platin seviyelerini ölçmek için ICP-MS metodolojisi için Ek Dosya’ya bakınız. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: Enfekte olmuş BE-M17 hücrelerine karşı enfekte olmuş Mycoplasma’da hOGG1 modifiye kuyruklu yıldız testi ile belirlenen DNA hasarını ve onarımını gösteren temsili bir grafik. 30 dakika boyunca 50 μM H2O 2 ile tedaviden sonra, hücrelerin farklı süreler boyunca (0, 30 dakika, 1 saat,2 saat, 6 saat, 24 saat veya 30 saat) onarılmasına izin verildi. hOGG1 modifiye HTP ACA, enfekte (kırmızı veri noktaları) ve enfekte olmamış (siyah veri noktaları) BE-M17 hücrelerinde (A) SB / ALS ve (B) oksitlenmiş pürinleri ölçmek için kullanıldı. Veriler, n = 2 yinelenen deneyden elde edilen 200 belirlemenin ortalamasını temsil eder. Bu rakam önceki bir yayının izniyle çoğaltılmıştır23. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Reaktif Stok Çözümü Çalışma çözümü Lizis tamponu ddH2O’da 100 mM Na 2 EDTA,2,5M NaCl ve 10 mM Tris Tabanı; 10 M NaOH ile pH’ı 10’a ayarlayın Lizis stoğu çözeltisinde %1 Triton X-100 Elektroforez tamponu ddH 2 O’da 10 M NaOH ve200mM Na2EDTA 300 mM NaOH ve 1 mM Na2EDTA; pH > 13 Nötralizasyon tamponu ddH2O’da 0,4 M Tris Tabanı; HCl ile pH’ı 7,5’e ayarlayın Boyama tamponu 1 mg/mL propidium iyodür ddH 2 O içinde2,5μg/mL propidium iyodür Tablo 1: HTP ACA’da kullanılan reaktiflerin bileşimi. Lizis, elektroforez, nötralizasyon ve boyama tamponlarının stok ve çalışma konsantrasyonları gösterilmiştir. Ek Dosya. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin çeşitli temsili, yaygın varyantlarıyla (yani, alkali, enzim modifiye edilmiş, kan ve ICL ve diğer varyantlar da uygun olacaktır) yüksek verim elde etmek için kullanılabilecek mevcut ekipman tarafından sağlanan çok yönlülüğü göstermektedir. Ek olarak, mevcut yaklaşım beraberinde çeşitli faydalar getirmektedir 20,21: (a) birden fazla slaytın paralel olarak manipüle edilmesi nedeniyle tahlil çalışma süresi azalır (işleme süresi%60 azalır); (b) Jellerin zarar görme riski ve dolayısıyla deneye ilişkin riskin azaltılması; (c) Reaktif gereksinimleri azalır (örneğin, elektroforez tankının hacmi geleneksel tanktan daha küçüktür); (d) çalıştırılan slaytların sayısı artırılır. Bir tank, tek bir geleneksel tanka kıyasla çalıştırılan kızak sayısında %20’lik bir artış sağlayabilir; Bununla birlikte, aynı güç kaynağından paralel olarak birden fazla elektroforez tankı çalıştırılabilir veya köleleştirilebilir (yani, tek bir güç kaynağı tarafından kontrol edilen birden fazla tank), ve yine de buz tepsili tek bir geleneksel tanktan daha küçük bir tezgah üstü ayak izi gerektirir; ve (e) kızakların dikey yönlendirilmesi ve entegre soğutma (laboratuvar alanından tasarruf sağlar) nedeniyle tank ayak izi azalır; HTP tankı, işlemi soğuk bir odada gerçekleştirmek zorunda kalmadan optimum tampon sıcaklığını korumak için bir dondurulmuş soğutma paketine sığabilen sürgülü çekmeceli yüksek performanslı bir seramik soğutma tabanından oluşur.

Ayrıca, bizim tarafımızdan geliştirilen soğutma plakası 26 kuyruklu yıldız slaytını barındırır, kuyruklu yıldız tahlil slaytları üzerindeki düşük erime noktası agarozunun hızlı bir şekilde katılaşmasını sağlar ve agaroz jeli katılaştıktan sonra slaytların kolay bir şekilde alınmasını kolaylaştırır. Yukarıdaki yenilikler kuyruklu yıldız tahlil sürecini daha basit ve daha kolay hale getirmektedir.

Diğer yüksek verimli yaklaşımlar geliştirilmiş olsa da (örneğin, 12 jelli kuyruklu yıldız tahlili, CometChip veya 96 mini jel formatı)25, birçok bilim adamı geleneksel mikroskop slaytlarını (ticari olarak temin edilebilen önceden kaplanmış slaytları veya diğer özel slaytları içerir) kullanmayı tercih etmektedir. Mevcut yaklaşım, her türlü mikroskop slaytını barındırabilir ve bu slaytları kullanan deneylerin daha hızlı slayt işleme ve işleme yoluyla ölçeklendirilmesine olanak tanır. Yukarıda belirtildiği gibi, HTP kuyruklu yıldız sistemi birçok avantaj getiriyor, ancak dikkate değer bir sınırlama var: mevcut yaklaşım, geleneksel bir yatay tanka kıyasla (slaytların işlenmesi çok daha hızlı olmasına rağmen) çalıştırılan numune sayısında sadece% 20’lik bir artış sağlıyor. CometChip ve 96 mini-jel formatı daha fazla sayıda numune çalıştırır. Bugüne kadar, mevcut yaklaşımın CometChip veya 96 mini jel formatlarını barındırıp barındıramayacağını bilmiyoruz, ancak olacağını tahmin ediyoruz. Yukarıda belirtildiği gibi, tankları tek bir güç kaynağına bağlayarak numune sayısı daha da artırılabilir. Tüm yaklaşımlarda olduğu gibi, numuneleri yüklerken ve mikroskop altında analiz ederken jelleri kaybetme veya zarar verme şansı hala vardır, ancak bu daha çok operatör hatasından kaynaklanmaktadır ve mevcut yaklaşımla bunun şansı en aza indirilmektedir.

HTP kuyruklu yıldız sisteminin kullanımı, DNA hasarının analiz edilmesine büyük ölçüde yardımcı olabilir ve kuyruklu yıldız testinin moleküler epidemiyoloji, erkek üreme bilimi, genotoksikoloji çalışmaları ve çevresel toksikoloji gibi çok çeşitli uygulamalarda kullanılmasını kolaylaştırır. Bu, özellikle tanıdık, uygun maliyetli, geleneksel mikroskop slaytlarından uzaklaşmadan gelişmiş verim ve kullanım kolaylığının tüm avantajlarından yararlanmak isteyen kullanıcılar için geçerlidir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayında bildirilen çalışma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü tarafından 1R41ES030274 ödül numarası altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.

Materials

22 x 22 mm glass coverslips Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 631-0124
A2780 ECACC, 
Louis, MO,
 USA		 93112519
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA A467-250
Fluorescence microscope equipped with a camera Zeiss, Jena, Germany
Fresh human whole blood Zen Bio Inc SER-WB10ML Commercial human whole blood sample
GraphPad Prism GraphPad Software, San Diego, California Data analysis software
HTP Comet Assay system Cleaver Scientific COMPAC- 50
Human Keratinocyte (HaCaTs) American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Discontinued Can be purchased from another company
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
Cat# T0020001
Hydrogen peroxide (H2O2)
30% in water		 Fisher Scientific, Hampton, NH, USA BP2633-500
ICP-MS
iCAP RQ ICP-MS system		 Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		 IQLAAGGAAQFAQKMBIT
Image and Data Analysis software Perceptive Instrument,
Bury St Edmunds, England,
UK		 125525 Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ
Internal Standard Mix SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		 CL-ISM1-500 Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3
Low melting point Agarose Invitrogen
Waltham, MA, USA		 P4864
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 E5134
NaCl (Sodium chloride) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 S7653
NanoDrop One Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		 701-058108 Nanodrop for measuring DNA concentration
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) Thermo Scientific, 
Waltham, MA,
USA		 D11901 Ultrapure water (16 MΩ cm-1)
NaOH (sodium Hydroxide) Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, USA		 E5134
Normal melting point Agarose Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 16520100 For pre-coating slides
OCI-P5X University of Miami,
Miami, FL,
USA		 N/A Live Tumor Culture Core facility provided the cells
Platinum (Pt) reference standard SPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		 PLPT3-2Y (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch
Propidium Iodide
(1.0 mg/mL in water)		 Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen
Valencia, CA,
USA		 51304 DNA extraction Kit
Single-frosted glass microscope slides Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 12-541B
SKOV3 ECACC,
Louis, MO,
USA		 91091004
Slide box Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 03-448-2 Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye
Slide Chilling plate Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 CSL-CHILLPLATE
Treatment dish Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 STAINDISH4X
Tris-base Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		 93362
Triton X-100 Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		 BP151-500
Trypsin EDTA (0.5%) Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, USA		 15400054
Vertical Slide Carrier Cleaver Scientific,
Rugby, England,
UK		 COMPAC-25
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  3. Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
  4. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
  5. Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
  6. Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
  7. Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
  8. Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
  9. Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
  10. Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
  11. Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
  12. Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
  13. Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
  14. Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
  15. Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
  16. Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607 (2014).
  17. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  18. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  19. Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072 (2019).
  20. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200 (2014).
  21. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , (2020).
  22. Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , (2019).
  23. Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054 (2019).
  24. Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
  25. Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
  26. Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
  27. Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
  28. Abdulwahed, A. M. S. . Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , (2020).
  29. Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
  30. Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
  31. Ji, Y. . Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , (2020).

Tags

Comet AssayDNA DamageGenotoxicityHigh-throughputCell SamplesLow-melting Point AgaroseLysis BufferElectrophoresisMicroscope SlidesCell PelletCooling PlateSlide Carrier

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ji, Y., Karbaschi, M., Abdulwahed, A., Quinete, N. S., Evans, M. D., Cooke, M. S. A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage. J. Vis. Exp. (183), e63559, doi:10.3791/63559 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image