細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

本研究では市販の血液サンプルを使用した。当院では、市販の血液の使用に治験審査委員会の承認は必要ありません。 1. コメットアッセイ用材料の準備 顕微鏡スライドの準備1%(w/v)の標準融点アガロース[二重蒸留水(ddH 2 O)に溶解]を50 mLチューブに注ぎ、マイクロ波でアガロースをddH2Oに溶解します。 コーティングスライドの前に固化を防ぐために37°Cで保存してください。固化が発生した場合は、廃棄して新鮮なものを準備してください。 プレコート顕微鏡は、1%(w/v)の標準融点アガロースを含む50 mLチューブにスライドを浸漬してスライドさせます。 スライドを浸した後、スライドの背面をすばやく拭きます。注意: スライドの背面を適切に拭かないと、顕微鏡による分析ステップ中にスライドのバックグラウンドノイズが増加します。 つや消しセクションの右下隅にある油性マーカーでコーティングされたスライドにラベルを付けます(図3A)。これは、スライドのどちら側が事前にコーティングされているかを示しています。 アガロースを固め、室温で一晩乾燥させます。 乾燥したスライドをティッシュペーパーで包み、箱に保管します。 2. サンプルの調製 培養細胞注:まず、コメットアッセイを開始する前に、細胞を損傷剤で処理します。次に、以下を実行します。細胞が接着している場合は、細胞をトリプシン処理して、細胞の適切なコンフルエントで細胞培養フラスコまたは細胞培養ペトリ皿からそれらを放出します。血清含有培地を添加してトリプシンを中和します。 細胞を50 mLチューブに移し、遠心分離機(HaCaTの場合は、室温で5分間300 x g で遠心分離機)、上清を穏やかに取り除き、1 mLのPBSを細胞ペレットに加えます。 細胞カウントを実行します。 30,000個の細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、7,607 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を静かに取り除き、コメットアッセイを実行する前に、暗所で氷上に細胞ペレットを保存します。注:他の場所で報告されているように、コメットアッセイを実行する前に、細胞を定期的にマイコプラズマ汚染についてテストして、他の影響の中でも、人工的なDNA損傷の形成とDNA損傷応答の変化を防ぐ必要があります23。遠心分離条件は、使用する細胞の種類に応じて、必要に応じて変更することができる。 修復アッセイのための培養細胞の調製細胞培養フラスコまたはシャーレで細胞を培養する。 細胞を損傷剤で処理する前に、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄します(例:BE-M17細胞の場合は、50 μMのH2O2 で20分間処理します)処理中に修復が起こらないようにします。 細胞を1 mLのPBSで2回穏やかに洗浄し、残留損傷剤を取り除きます。 細胞培養培地を再導入し、加湿インキュベーター(37°C、5%CO2)でさまざまな期間(0分、30分、2時間、6時間、24時間、30時間など)細胞を修復します。 各時点で、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)含有細胞培養培地で30,000個の細胞を収集し、-80°Cで保存します。 コメットアッセイを実行する前に、細胞を水浴中で37°Cで素早く解凍し、7,607 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 アッセイを実行する前に(すなわち、ステップ3から)上清を除去し、細胞ペレットを氷上に保管する。 全血の調製注:以下の方法は、(i)血液サンプルを取得するための低侵襲アプローチであること、(ii)コメットアッセイの前にPBMCを分離する必要がないこと、および(iii)血液サンプル(容量<250μL)を-80°Cで最大1か月間保存できることから恩恵を受けます(ただし、最近の証拠では、より長い保存が可能であることが示唆されています)。 凍結保存剤を必要とせず、リスクや人工的な損傷の形成もありません14。患者または動物から血液サンプルを採取する前に、倫理的承認または同等の承認が必要になる場合があります。あるいは、市販の血液試料を本試験のように使用することができる。当院では、市販の血液の使用に治験審査委員会の承認は必要ありません。ピペットを使用して、全血サンプル(<250 μL)(材料表)を、0.4 mgのEDTA(血液250 μLあたり)を含む最小容量の収集チューブに移します。 HTPコメットアッセイを実行する前に、血液サンプルを-80°Cで凍結してください。 保存した血液サンプル(<250μL)を室温で加熱せずに解凍した。 コメットアッセイを実行する前に、5 μLの全血をマイクロ遠心チューブに移します(ステップ3を参照)。 3.細胞溶解 注意: すべての手順を氷上で実行してください。 ゲルあたり12,000細胞または2.5μLの全血を使用します。 マイクロ波を用いてPBSに溶解した0.6%(w/v)低融点アガロースを調製し、固化しないように37°Cの水浴に入れます。 プレコートされたスライドのつや消しの端に、パーマネントマーカーまたは鉛筆を使用して、治験責任医師の名前、日付、および治療情報のラベルを付けます。 冷却プレートを平らなベンチに置き、2つの冷凍冷却パックを金属表面の下のスライド式引き出しに挿入します( 図4を参照)21。 スライドを冷却プレートに置き、スライドを1〜2分間プレチルしてから、0.6%(w / v)の低融点アガロース含有セルを追加します(ステップ3.7)。注意: スライドを冷却プレートに1〜2分以上置いておくと、周囲の湿度によりスライド面に結露が発生する可能性があります。これにより、低融点アガロースゲルがスライド上での安定性を低下させる可能性があります。 ボルテックスによってペレットを分散させる(ステップ2.2.7)。すべての上清がペレットから除去されていることを確認してください。サンプルチューブ(ペレットセルを含む)をすぐに氷上に戻します。注意: サンプル含有チューブを遠心分離機に入れるときは、ペレットがチューブのこちら側に集められるように、ヒンジを外側に向けて配置します。ペレットが見えにくい場合があり、上澄み液を取り除きながらペレットを取り除くのは簡単です。チューブの蓋をこの向きにして遠心分離すると、細胞ペレットがどこにあるかを知ることができます。 細胞ペレットを200 μLの0.6%低融点アガロース(LMPアガロース)で再懸濁し、気泡を発生させずに上下にピペッティングして混合します。次に、80 μLのLMPアガロース含有細胞を冷やしたスライドにすばやく移し、カバーガラスをゲルにすばやく置きます。 ゲルを冷却プレートに1〜2分間セットします。 その間、溶解バッファーの500 mL作業溶液を調製し(表1)、それを溶解皿に注ぎます(図2)。 ゲルをセットしたら、スライドを親指と人差し指でそっと持ち、カバーガラスをゲルからスライドさせて、カバーガラスをすばやく取り外します。 サンプルを含むスライドをスライドキャリア内に置き(スライドの黒い「ドット」マークはすべて、キャリアに配置するときに同じ方向を向いている必要があります)、次にスライドキャリアを溶解皿内に置きます(図2)。 溶解皿の蓋を閉め、溶解皿を冷蔵庫に4°Cまたは室温で30分、オペレーターのタイムスケジュール19に最も適した方で一晩保管します。 4. 電気泳動 スライドキャリアを溶解皿から慎重に取り外します。ゲルを乱さないように注意してください。 スライドキャリアを氷冷したddH2Oをあらかじめロードした洗浄皿にそっと置き、スライドがddH2Oで完全に覆われるように30分間放置します。 電気泳動タンクの下のスライド式引き出し内に凍結冷却パックを挿入して、最適なバッファー温度を維持します。 氷冷電気泳動作業溶液(表1)を電気泳動タンクに注意深く加え、スライドキャリアを電気泳動槽に移します。セル含有ゲルのある透明な部分(つまり、つや消し/ラベリングの端ではない)がカソード(赤い電極)に向くようにスライドを向けます。 スライドを電気泳動タンクに20分間置いて、DNAがリラックスしてほどけるようにします。この手順の間、電源装置をオフのままにします。 必要に応じて、冷却を最大化するために新しい冷凍冷却パックを挿入します。 1.19 V/cm、または最適化された条件で20分間電気泳動を実行します。注:電気泳動の実行条件とバッファーの量の最適化は、すべての実験室24に推奨されます。電気泳動中に単一のスライドキャリアのみを使用しても、電気泳動バッファーの抵抗に対するスライドの影響は発生せず、スライドの数が変化した場合の電圧または電流に有意な影響は見られませんでした。 電源を切り、スライドキャリアを電気泳動タンクから慎重に取り外し、ティッシュペーパーに30秒間排出させます。 中和バッファーを含むディッシュにスライドキャリアを置きます(表1)。20分間放置します。 中和皿からスライドキャリアを取り出し、氷冷ddH2Oを含む洗浄皿に入れ、20分間放置します。 スライドキャリアを水から取り出し、オペレーターのスケジュールに応じて、スライドを37°Cのインキュベーターで1時間、または室温で一晩乾燥させるか、乾燥させないでください19。注意: ステップ4.11で乾燥がない場合は、5.2から染色ステップを実行します。 5.ヨウ化プロピジウム(PI)染色 スライドキャリアを氷冷ddH2Oを含む洗浄皿に移してスライドを再水和し、30分間放置します。 スライドキャリアを、2.5 μg/mLのヨウ化プロピジウム溶液を含む染色皿に入れます。注意: ヨウ化プロピジウムは光に敏感なので、暗い場所で取り扱ってください。それはまた有毒です。 染色皿の蓋を閉め、室温で暗所で20分間インキュベートします。 スライドキャリアを別の皿に移し、氷冷したddH2Oで20分間洗浄します。 スライドキャリアをディッシュから取り出し、オペレーターのスケジュールや好みに応じて、37°Cのインキュベーター内または室温で暗所で完全に乾燥させます。 スライドが完全に乾いたら、スライドキャリアから取り出し、画像分析の準備ができるまで暗所のスライドボックスに保管します。注意: スライドは無期限に読み取り可能なままであり、必要に応じて再染色することができます。 6. 酵素修飾アルカリ彗星アッセイ 注:酵素修飾アルカリコメットアッセイは、溶解後、電気泳動前の酵素処理ステップを使用します。酵素の活性は、酵素の基質である部位でDNAの切断を引き起こします。このアッセイを実行する前に、酵素濃度と酵素インキュベーションの期間を最適化する必要があります。 細胞溶解(ステップ3)後、スライドを氷冷ddH 2 Oで2回ずつ20分間洗浄する。 スライドキャリアを水から取り出し、ペーパータオルで裏打ちされたトレイにスライドを移します。 最適な濃度で80 μLの酵素を加え(例:酵素反応バッファーで希釈したBE-M17細胞用のhOGG13.2 U/mL)、カバーガラスで覆い、ゲル含有サンプル上に酵素を広げます。 スライドを37°Cで最適化された持続時間(hOGG1の場合は45分など)インキュベートします。 インキュベーション後、カバーガラスをそっと取り外し、スライドをキャリアに移します。注:酵素処理後にスライドを洗わないでください。ステップ4.3の電気泳動を直接行います。 7. DNA鎖間架橋(ICL)修飾アルカリコメットアッセイ 注:ICL-ACAのこの変異体の概念は、DNA中のICLの存在が、酸化的に生成された侮辱にさらされた後に誘発される損傷したDNAの電気泳動移動を遅らせるというものです。この場合、彗星の尾が短いほど、ICL25,26,27,28の数が多くなります。 ICLを誘導する試薬(シスプラチンなど; 補足ファイルを参照)で細胞を処理します。 処理した細胞を次のいずれかの薬剤でさらして、適切なサイズの彗星の尾(~20%の尾DNA)を作成するのに十分な鎖切断を誘発します:過酸化水素(50 μM H 2O 2で30分間)、電離放射線(2-5 Gy)、または紫外線B(UVB)(0.5 J / cm2)。 さらに、ステップ7.2で使用したのと同じ薬剤および用量で細胞のバッチを処理することによって、ストランドブレークポジティブコントロールを生成する(すなわち、ICL誘導剤による処理なし)。 細胞を7,607 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのPBSで3回洗浄し、アルカリコメットアッセイと同様に処理します(ステップ3〜5)。 以下の式を使用して、DNA鎖間架橋のレベルを計算します。注:MOTM(平均オリーブテールモーメント)は、ICL修飾コメットアッセイを記述するときに広く使用されているコメットアッセイエンドポイントであり、テールの長さとテールの全DNAの割合の積として定義されます(つまり、テールモーメント=テールの長さxテールのDNAの%)29;TMdi:架橋剤およびH2O2(または他のストランドブレーカー誘導剤)の両方で処理した試料のテールモーメント;TMcu:架橋剤で処理されておらず、H2O2で処理されていない(処理されていない)サンプルのテールモーメント、およびTMci:架橋剤で処理されていないがH2O2で処理されたサンプルのテールモーメント。 8. 彗星のスコアリングとデータ分析 注:「彗星」という用語は、アッセイの実行後に顕微鏡で見たときの損傷細胞の画像に由来します(図5)。電気泳動条件下では、損傷を受けていない細胞のDNAはほとんど移動しませんが、彗星「頭」と呼ばれる回転楕円体に残ります。しかし、鎖切れの存在により、細胞のDNAが頭から移動して「尾」を形成し、彗星のような外観になります(図5)。尾のDNAが多いほど、より多くの損傷が存在します。 PI(赤)フィルター(λ = 536/617 nm)とコメットアッセイスコアリングソフトウェアを使用して蛍光顕微鏡の電源を入れます。 パスツールピペットを使用して一滴の水をゲルに加え、カバーガラスで覆います。 スライドを蛍光顕微鏡に入れ、彗星を「スコアリング」します。注:スコアリングは、各彗星に存在する損傷の量を決定するために、彗星を評価する手段です。大まかに言えば、これは、ユーザの選択した好みに応じて、目で(彗星のサイズを0〜4のスケールで測定する)か、または自由に、または市販のソフトウェア30を使用することによって、2つのアプローチを使用することによって達成することができる。一般に、どちらのアプローチも彗星の尾のサイズを評価しますが、さまざまな彗星関連のエンドポイントを決定することができます。ソフトウェアを使用する場合は、彗星の頭の中央をクリックし、ソフトウェアが彗星を自動的に検出するまで待ってから、選択したエンドポイントを評価します(図5)。 ゲルあたり50個の彗星、サンプルあたり100個の彗星をスコアリングします(つまり、各サンプルは異なるDNA損傷処理またはそれらの反復に対応します)。 実験を複製する(n = 2)か、実験を3回繰り返す(n = 3)。注:n=2回の反復実験のみを行う場合、統計分析は実行できませんが、n=3の場合はダゴスティーノ正規性検定を実行します。ほとんどの彗星アッセイデータは正規性検定に合格しません。この場合、ノンパラメトリック検定を使用します(クラスカル-ウォリス検定とダンの多重比較検定、およびマン-ホイットニー検定の有意性は p < 0.05に設定されています)。