نهج فحص المذنب عالي الإنتاجية لتقييم تلف الحمض النووي الخلوي
Summary
فحص المذنب هو وسيلة شائعة للكشف عن تلف الحمض النووي. تصف هذه الدراسة نهجا لتشغيل الشرائح في المتغيرات التمثيلية لفحص المذنب. أدى هذا النهج إلى زيادة كبيرة في عدد العينات مع تقليل وقت تشغيل الفحص ، وعدد التلاعب بالشرائح ، وخطر تلف المواد الهلامية.
Abstract
تتعرض الخلايا باستمرار للعوامل الناشئة عن البيئات الداخلية والخارجية ، والتي قد تلحق الضرر بالحمض النووي. يمكن أن يسبب هذا الضرر وظيفة خلوية شاذة ، وبالتالي قد يلعب تلف الحمض النووي دورا حاسما في تطور جميع الأمراض البشرية الرئيسية ، مثل السرطان والأمراض العصبية التنكسية وأمراض القلب والأوعية الدموية والشيخوخة. يعد الرحلان الكهربائي الهلامي أحادي الخلية (أي فحص المذنب) أحد أكثر الطرق شيوعا وحساسية لدراسة تكوين وإصلاح مجموعة واسعة من أنواع تلف الحمض النووي (على سبيل المثال ، الفواصل أحادية ومزدوجة الخيط ، والمواقع القلوية ، والروابط المتقاطعة بين الحمض النووي والحمض النووي ، وبالاقتران مع بعض إنزيمات الإصلاح ، والبيورينات المؤكسدة ، والبيريميدين) ، في كل من المختبر وفي الجسم الحي نظم. ومع ذلك ، فإن إنتاجية العينة المنخفضة للفحص التقليدي وعمل العينة الشاق يحدان من العوامل إلى أوسع تطبيق ممكن. مع “تسجيل” المذنبات بشكل متزايد الآلي ، فإن القيد هو الآن القدرة على معالجة أعداد كبيرة من شرائح المذنبات. هنا ، تم تطوير متغير عالي الإنتاجية (HTP) لفحص المذنب (HTP comit) ، مما يزيد بشكل كبير من عدد العينات التي تم تحليلها ، ويقلل من وقت تشغيل الفحص ، وعدد التلاعب الفردي بالشرائح ، ومتطلبات الكاشف ، وخطر حدوث أضرار مادية للمواد الهلامية. علاوة على ذلك ، يتم تقليل بصمة خزان الرحلان الكهربائي بشكل كبير بسبب الاتجاه الرأسي للشرائح والتبريد المتكامل. كما تم الإبلاغ هنا عن نهج جديد لشرائح فحص المذنبات المرعبة ، والتي تسهل بسهولة وكفاءة تصلب المواد الهلامية للمذنبات. هنا ، تم وصف تطبيق هذه الأجهزة على طرق فحص المذنبات التمثيلية. تدعم هذه الابتكارات البسيطة إلى حد كبير استخدام فحص المذنب وتطبيقه على مجالات الدراسة مثل بيولوجيا التعرض ، وعلم السموم البيئية ، والرصد البيولوجي ، وفحص / اختبار السمية ، إلى جانب فهم الإمراض.
Introduction
تتعرض الخلايا باستمرار للعوامل الناشئة عن البيئات الداخلية والخارجية ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بالحمض النووي 1,2. يمكن أن يسبب هذا الضرر وظيفة الخلية الشاذة3 ، وبالتالي قد يلعب تلف الحمض النووي دورا حاسما في تطور العديد من الأمراض البشرية الرئيسية ، مثل السرطان والأمراض العصبية التنكسية وأمراض القلب والأوعية الدموية والشيخوخة4. يعد فحص المذنب (ويسمى أيضا الرحلان الكهربائي الهلامي أحادي الخلية) طريقة شائعة بشكل متزايد للكشف عن تلف الحمض النووي الخلوي وقياسه كميا.
في أبسط صوره ، يكتشف فحص المذنب القلوي (ACA) فواصل الخيوط (SB ؛ مفردة ومزدوجة على حد سواء) ، جنبا إلى جنب مع المواقع apurinic / apyrimidinic والمواقع القلوية (ALS) وكلاهما يصبح فواصل أحادية الخيط في ظل الظروف القلوية5. يمكن لفحص مذنب الأس الهيدروجيني المحايد تقييم الفواصل الصريحة أحادية ومزدوجةالخيط 6. وعلاوة على ذلك، يمكن ل ACA، بالاشتراك مع عدد من إنزيمات إصلاح الحمض النووي، الكشف عن مجموعة كبيرة من أنواع تلف الحمض النووي، على سبيل المثال، البيورينات المؤكسدة (التي تم تحديدها باستخدام الحمض النووي البشري 8-oxoguanine glycosylase 1؛ hOGG17)؛ البيريميدين المؤكسد (باستخدام Endonuclease III; EndoIII) و سيكلوبوتان بيريميدين ديمرز (باستخدام T4 endonuclease V ؛ T4endoV)8. يمكن أيضا استخدام فحص المذنب لتقييم آفات الحمض النووي الناجمة عن عوامل الربط المتبادلة ، مثل سيسبلاتين9،10،11. وكما هو مبين في الاسم الرسمي للفحص، أي الرحلان الكهربائي الهلامي أحادي الخلية، يعتمد الفحص على الخلايا قيد التحليل كونها معلقة خلية واحدة؛ الأكثر شيوعا ، هذه هي الخلايا المستزرعة ولكن يمكن عزلها من الدم الكامل 12,13 ، أو يمكن استخدام الدم الكامل نفسه 14,15. بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء تعليق خلية واحدة من الأنسجة الصلبة.
وبصرف النظر عن بعض الاستثناءات، وأبرزها تقارير CometChip من مختبر Engleward 16، لم يتغير بروتوكول فحص المذنب بشكل كبير عن ذلك الذي وصفه مخترعو الفحص في الأصل (Östling و Johansson17 و Singh etal.18). يتضمن فحص المذنب العديد من الخطوات (الشكل 1). تتضمن العديد من هذه الخطوات نقل جل الأغاروز الرقيق المحتوي على الخلايا ، شريحة واحدة في كل مرة ، وبالتالي ، تشكل خطر تلف أو فقدان الجل ، مما يعرض نجاح التجربة للخطر. وبالتالي ، يمكن أن يستغرق فحص المذنب وقتا طويلا ، خاصة إذا كان يتم تشغيل عدد كبير من الشرائح. عادة ، يتم تشغيل 40 شريحة كحد أقصى في خزان كبير (33 سم × 59 سم × 9 سم) ، والذي يقع داخل صينية أكبر تحتوي على ثلج رطب للتبريد. وقد أفيد مؤخرا أنه يمكن تقصير وقت تشغيل الفحص إلى يوم واحد عن طريق تقليل مدة خطوة التحلل وعدم تجفيف الشرائح قبل تلطيخ19.
أبلغ المؤلفون الحاليون سابقا عن نهج جديد لفحص المذنب القلوي عالي الإنتاجية (HTP ACA) ، حيث يمكن التلاعب بشرائح مجهر فحص المذنب المتعددة (دفعات من 25) في وقت واحد طوال عملية فحص المذنب 20،21،22. يقلل هذا النهج الحاصل على براءة اختراع من خطر تلف أو فقدان المواد الهلامية المحتوية على العينات عن طريق إزالة الحاجة إلى التعامل مع شرائح المجهر بشكل فردي ويمكن تطبيقه على جميع متغيرات فحص المذنب ، والتي تستخدم شرائح المجهر. تحمي الرفوف المحتوية على الشرائح المواد الهلامية أثناء التلاعب ، وبالتالي ، تكون معالجة العينات أسرع وأكثر كفاءة. يمكن أن تخضع الشرائح أيضا للرحلان الكهربائي في الرفوف ، التي يتم الاحتفاظ بها في الاتجاه الرأسي ، بدلا من الاتجاه الأفقي. هذا ، والتبريد المتكامل ، يقلل بشكل كبير من بصمة خزان الرحلان الكهربائي ويزيل الحاجة إلى الثلج الرطب. وهذا يمثل تحسنا كبيرا مقارنة بالإجراء التقليدي. ويوضح الشكل 2 المعدات المستخدمة. توضح البروتوكولات الموصوفة هنا ، باستخدام هذا النهج الجديد ، التطبيق التمثيلي للخلايا المستزرعة والدم الكامل14 للكشف عن المواقع القلوية الشفهية (ALS) ، والروابط المتقاطعة بين الخيوط (ICL) ، وركائز إنزيمات إصلاح الحمض النووي المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الدراسة التنوع الذي توفره المعدات الحالية ، والتي يمكن استخدامها لتحقيق إنتاجية عالية مع مجموعة متنوعة من المتغيرات التمثيلية الشائعة لفحص المذنب (أي القلوية ، المعدلة بالإنزيم ، الدم ، و ICL ، وغيرها من المتغيرات ستكون مناسبة أيضا). وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج الحالي يجلب معه عدة فوائد20،21: (أ) انخفاض وقت تشغيل الفحص بسبب التلاعب بشرائح متعددة بالتوازي (ينخفض وقت المعالجة بنسبة 60 في المائة)؛ (ب) انخفاض وقت إجراء الفحص بسبب التلاعب بشرائح متعددة بالتوازي (ينخفض وقت المعالجة بنسبة 60 في المائة)؛ (ب) انخفاض وقت إجراء الفحص بسبب التلاعب بشرائح متعددة بالتوازي (ينخفض وقت المعالجة بنسبة 60 في المائة)؛ (ب) انخفاض وقت إجراء الفحص بسبب التلاعب بشرائح متعددة بالتوازي (ينخفض وقت المعالجة بنسبة 60 في المائة)؛ (ب) انخفاض وقت إجراء الفحص بسبب التلاعب بشرائح متعددة بالتوازي (ينخفض وقت (ب) خطر تلف المواد الهلامية، وبالتالي تقليل المخاطر التي تتعرض لها التجربة؛ (ج) انخفاض الاحتياجات من الكواشف (على سبيل المثال، يكون حجم خزان الرحلان الكهربائي أصغر من الخزان التقليدي)؛ (د) زيادة عدد الشرائح التي يتم تشغيلها. يمكن أن يوفر خزان واحد زيادة بنسبة 20٪ في عدد الشرائح التي يتم تشغيلها مقارنة بخزان تقليدي واحد ؛ ومع ذلك ، يمكن تشغيل أو استعباد خزانات متعددة للرحلان الكهربائي (أي خزانات متعددة يتم التحكم فيها بواسطة مصدر طاقة واحد) ، بالتوازي مع نفس مصدر الطاقة ، ولا تزال تتطلب بصمة على الطاولة أصغر من خزان تقليدي واحد مع صينية ثلج ؛ و (ه) انخفاض بصمة الخزان بسبب الاتجاه الرأسي للشرائح والتبريد المتكامل (يوفر مساحة المختبر) ؛ يتكون خزان HTP من قاعدة تبريد سيراميك عالية الأداء مع درج منزلق يمكن أن يتسع لحزمة تبريد مجمدة واحدة للحفاظ على درجة حرارة التخزين المؤقت المثلى دون الحاجة إلى إجراء العملية في غرفة باردة.
علاوة على ذلك ، فإن لوحة التبريد التي طورناها تستوعب 26 شريحة مذنب ، وتمكن من التصلب السريع للأغاروز منخفض درجة الانصهار على شرائح فحص المذنب وتسهل استرجاع الشرائح بسهولة بعد تصلب هلام الأغاروز. الابتكارات المذكورة أعلاه تجعل عملية فحص المذنب أبسط وأسهل.
وفي حين تم تطوير نهج أخرى عالية الإنتاجية (على سبيل المثال، فحص المذنبات المكونة من 12 هلام، أو CometChip، أو 96 شكلا من أشكال الهلام الصغير)25، يفضل العديد من العلماء استخدام شرائح المجهر التقليدية (التي تشمل الشرائح المغلفة مسبقا المتاحة تجاريا، أو غيرها من الشرائح المتخصصة). يمكن أن يستوعب النهج الحالي جميع أنواع شرائح المجهر ، مما يسمح بتوسيع نطاق التجارب التي تستخدم هذه الشرائح من خلال معالجة الشرائح ومعالجتها بشكل أسرع. كما ذكر أعلاه ، فإن نظام المذنب HTP يجلب العديد من المزايا ، ولكن هناك قيد واحد ملحوظ: النهج الحالي يوفر زيادة بنسبة 20٪ فقط في عدد العينات التي يتم تشغيلها ، مقارنة بالخزان الأفقي التقليدي (على الرغم من أن معالجة الشرائح أسرع بكثير). تعمل تنسيقات CometChip و 96 mini-gel على تشغيل عدد أكبر من العينات. حتى الآن ، لا نعرف ما إذا كان النهج الحالي يمكن أن يستوعب CometChip أو 96 تنسيقات هلام صغير ، على الرغم من أننا نتوقع أنه سيكون. كما ذكر أعلاه ، يمكن زيادة عدد العينات عن طريق استعباد الخزانات إلى مصدر طاقة واحد. كما هو الحال مع جميع الأساليب ، لا تزال هناك فرصة لفقدان أو إتلاف المواد الهلامية أثناء تحميل العينات وتحليلها تحت المجهر ، ولكن هذا يرجع أكثر إلى خطأ المشغل ، ويتم تقليل فرص ذلك مع النهج الحالي.
يمكن أن يساعد استخدام نظام المذنب HTP بشكل كبير في تحليل تلف الحمض النووي ، مما يسهل استخدام فحص المذنب في مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل علم الأوبئة الجزيئي ، والعلوم الإنجابية للذكور ، ودراسات السموم الوراثية ، وعلم السموم البيئية. وينطبق هذا بشكل خاص على المستخدمين الذين يرغبون في الحصول على جميع فوائد تحسين الإنتاجية وسهولة الاستخدام ، دون الابتعاد عن شرائح المجهر التقليدية المألوفة والفعالة من حيث التكلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل المبلغ عنه في هذا المنشور ، جزئيا ، من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة: 1R41ES030274. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
| A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
| Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
| Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
| Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
| HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
| Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
| Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
| ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
| Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
| Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
| Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
| Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
| Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
| NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
| Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
| OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
| Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
| Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
| Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
| SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
| Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
| Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
| Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
| Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
| Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
| Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
- Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
- Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
- Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
- Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
- Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
- Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
- Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
- Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
- Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
- Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
- Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
- Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
- Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
- Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607 (2014).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072 (2019).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200 (2014).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , (2020).
- Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , (2019).
- Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054 (2019).
- Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
- Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
- Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
- Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
- Abdulwahed, A. M. S. . Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , (2020).
- Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
- Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
- Ji, Y. . Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , (2020).
