Bu yazıda, kanserli ürotelyal hücrelerden kaynaklanan hücre dışı veziküllerin (EV’ler) izolasyonu ve donma-kırılması için bir protokol sunulmaktadır. Dondurarak kırılma tekniği, EV’lerin çapını ve şeklini ve benzersiz bir özellik olarak EV membranlarının iç organizasyonunu ortaya çıkardı. Bunlar, EV’lerin alıcı membranlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamada büyük önem taşımaktadır.
Hücre dışı veziküller (EV’ler), hücrelerden hücre dışı boşluğa salınan membranla sınırlı yapılardır ve hücreler arası iletişimde rol oynarlar. EV’ler, mikro-parçacıklar (MV’ler), eksozomlar ve apoptotik cisimler olmak üzere üç vezikül popülasyonundan oluşur. EV’lerin sınırlayıcı zarı, alıcı hücrelerle etkileşimlerde çok önemlidir, bu da biyolojik olarak aktif moleküllerin alıcı hücrelere aktarılmasına yol açabilir ve sonuç olarak davranışlarını etkileyebilir. Donma-kırık elektron mikroskobu tekniği, biyolojik membranların iç organizasyonunu incelemek için kullanılır. Burada, kültürlenmiş kanserli ürotelyal hücrelerden MV izolasyonu ve MV’lerin donma-kırılması için hızlı donma, kırılma, replikaların yapılması ve temizlenmesi ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilmesi adımlarında bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, izolasyon protokolünün, MV’lerin şekline ve boyutuna karşılık gelen homojen bir EV popülasyonu verdiğini göstermektedir. Bu nedenle, dondurarak kırılma, MV’lerin çapını, şeklini ve membran proteinlerinin dağılımını karakterize etmek için tercih edilen tekniktir. Sunulan protokol diğer EV’ler popülasyonları için geçerlidir.
Hücre dışı veziküller (EV’ler), hücrelerden hücre dışı boşluğa salınan membran sınırlı veziküllerdir. EV’lerin üç ana popülasyonu, kökenleri, büyüklükleri ve moleküler bileşimleri 1,2,3 bakımından farklılık gösteren eksozomlar, mikro-parçacıklar (MV’ler) ve apoptotik cisimlerdir. EV’lerin bileşimi, donör hücrenin moleküler profilini ve fizyolojik durumunu (yani, sağlıklı veya hastalıklı) yansıtır4,5. Bu, EV’lere insan hastalıklarının teşhisi, prognozu ve tedavisinde muazzam bir potansiyel verir ve kişiselleştirilmiş tıpta kullanım için umut verici tıbbi uygulamalara sahiptirler 6,7,8.
EV’ler hücreler arası iletişimin aracılarıdır. Alıcı hücredeki biyolojik süreçlere müdahale eden ve davranışını değiştirebilen biyolojik olarak aktif proteinler, lipitler ve RNA’lar içerirler 9,10. Bununla birlikte, EV sınırlayıcı membranın bileşimi, alıcı hücre zarı ile etkileşim için çok önemlidir.
EV’lerin kaynakları vücut sıvıları ve şartlandırılmış kültür ortamıdır. Bir EV popülasyonunu izole etmek için uygun bir izolasyon tekniği kullanılmalıdır. Örneğin, 10.000 × g’daki santrifüjleme , MV’lerde zenginleştirilmiş bir fraksiyon verirken, 100.000 ≥ g’lık × merkezkaç kuvvetleri, eksozomlarda zenginleştirilmiş bir fraksiyonverir 11,12. EV’lerin izole fraksiyonu saflık, boyut ve şekil açısından doğrulanmalıdır. Bu amaçla, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği 2018, üç sınıf yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği önerdi: elektron mikroskobu, atomik kuvvet mikroskobu ve ışık mikroskobu tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi13. Bu tekniklerin hiçbiri EV membran iç kısmı hakkında bilgi sağlayamaz.
Dondurarak kırılmış elektron mikroskobu, donmuş numunelerin iç yapılarını ortaya çıkarmak için kırılması, özellikle de membranın iç kısmının bir görünümünü vermesi tekniğidir. Numune hazırlama adımları (1) hızlı dondurma, (2) kırılma, (3) replikanın yapılması ve (4) replikanın temizlenmesi14’tür. 1. adımda, numune (isteğe bağlı olarak) kimyasal olarak sabitlenir, gliserol ile kriyo-korumalı ve sıvı freonda dondurulur. 2. adımda, dondurulmuş numune, membran çift katmanının içini açığa çıkaran bir dondurarak kırılma ünitesinde kırılır. 3. adımda, açıkta kalan kırık yüzler, kopyalar üretmek için platin (Pt) ve karbon (C) ile gölgelenir. 4. adımda, organik madde çıkarılır. Replika, transmisyon elektron mikroskobunda (TEM) analiz edilir. Mikrografların doğru yorumlanması için, doğru yönelimleri için kılavuz ilkelere uyulmalıdır14,15. Kısaca, mikrograftaki gölgelerin yönü, mikrografı yönlendirmek (yani, Pt gölgelemesinin yönünü belirlemek için) ve sonuç olarak dışbükey ve içbükey şekilleri belirlemek için bir referanstır (Şekil 1). Membran çift katmanının kırık yüzleri olarak adlandırılan iki iç görünüm, membranın donma-kırılma yoluyla bölünmesinin bir sonucu olarak görülebilir: protoplazmik yüz (P-yüzü) ve ekzoplazmik yüz (E-yüz). P-yüzü, hücre protoplazmasına bitişik membran broşürünü temsil ederken, E-yüzü, hücre dışı boşluğa bitişik membran broşürünü temsil eder. İntegral membran proteinleri ve bunların birliktelikleri çıkıntılı membran içi parçacıklar olarak görülür14,15.
Burada amaç, MV’leri boyut, şekil ve sınırlayıcı membranlarının yapısı açısından karakterize etmek için dondurarak kırılma tekniğini uygulamaktır. Burada, insan invaziv mesane kanserli ürotelyal hücrelerden kaynaklanan MV’lerin izolasyonu ve dondurarak kırılması için bir protokol sunuyoruz.
MV’lerin veya izole EV’lerin diğer popülasyonlarının karakterizasyonu, “omik” çalışmaları veya fonksiyonel çalışmalar11,18 gibi aşağı akış analizlerine başlamadan önce başlamak için birincil öneme sahiptir. Burada, insan invaziv mesane kanseri ürotelyal T24 hücrelerinden EV’ler santrifüjleme ile izole edildi ve dondurucu-kırık elektron mikroskobu ile analiz için sağlanan protokolü takiben, izole fraksiyonun MVs11,13’te zenginleştirildiğini gösterdik. MV’lerin izolatı hücre kalıntılarından veya organellerden yoksundu ve bu da başarılı bir izolasyon ve saflaştırma protokolünü doğruladı.
Protokolün kritik adımları olan kimyasal fiksasyon ve donma kombinasyonu, EVs12’nin küresel şeklini korudu. Bununla birlikte, EV çapını dondurarak kırarak değerlendirirken önlemler alınması gerekmektedir17. Kırık numuneden rastgele geçtiğinden, MV membranları ekvatoral ve ekvator olmayan düzlemlerine ayrılır. Dondurularak kırılmış ve gölgelenmiş örneklerin görüntülerini analiz etmek için titiz bir yöntem sağlamak için, Hallett ve ark. ortalama vezikül çapının, görüntü17’deki veziküler çapın gerçek boyutunun 4 / π katı olduğunu göstermiştir. Bunu hesaba katarak, T24 hücrelerinden EV’lerin, MV’nin 100-1000 nm19 teorik boyut dağılım aralığına uyan 304 nm çapa sahip olduğu hesaplandı.
Donma-kırılma, EV’leri görselleştirmek için en yaygın kullanılan TEM tekniği olan negatif boyamayı destekleyebilir. Negatif boyama ile, numune genellikle kimyasal olarak sabitlenir, kurutulur ve bir TEM ızgarasına bağlanır ve uranil çözeltisi ile kontrast oluşturur. Destekleyici medya olmadan, EV’ler çökme eğilimindedir, bu da onlara fincan şeklinde bir görünüm verir. Donma-kırılma yoluyla, MV’lerin hücre dışı boşluklarda ve vücut sıvılarında şekillerini yansıtan küreler olduğunu gösteriyoruz12. Bu sayede, sonuçlarımız kriyo-ultra ince bölüm20’deki EV’lerin gözlemleriyle de uyumludur.
Dondurarak kırılma tekniğinin önemli bir avantajı, EV’lerin alıcı membranlara nasıl hedeflendiğini ve onlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamada kilit bir faktör olan sınırlayıcı membranın iç organizasyonunu çözme gücüdür. Burada, MV’lerin membranlarını analiz ettik, ancak donma-kırılma, diğer EV’lerin popülasyonlarının membran organizasyonunu ortaya çıkarabilir. MV’ler plazma membran tomurcuklanması ile oluşur; bu nedenle plazma membran proteinleri ve protein kümelerinin MV membranında bulunması beklenir. Sonuçlarımız, T24 hücrelerinden MV’lerin membran içi parçacıklar içerdiğini ve integral membran proteinleri sunduğunu destekledi. E-yüz ve P-yüzü arasındaki partikül dağılımına dayanarak, MV’lerde gözlenen parçacıkların, ürotelyal hücreye özgü21,24 olan transmembran proteinleri üroplakinler olmasını beklemek mantıklıdır. Gözlenen parçacıklar seyrekti, bu da ürotelyal karsinogenez21,22,23 sırasında üroplakinlerde bir azalma bildiren önceki çalışmalara göre. Bununla birlikte, MV membranlarının protein bileşimini daha fazla araştırmak için, dondurarak kırık replikası immün etiketleme (FRIL) tekniğinin kullanılması önerilir. FRIL, sunulan dondurucu kırık tekniğinin bir yükseltmesidir ve antikor tanıma24,25 ile replikalardaki proteinlerin kimliğini ortaya çıkarmaya adanmıştır. Özetlemek gerekirse, donma-kırılma tekniği, EV sınırlayıcı membranın karakterizasyonunun yanı sıra izole edilmiş EV fraksiyonlarının şekli, boyutu ve saflığı için uygun bir elektron mikroskobu tekniğidir. Sunulan protokol, izole EV’lerin diğer popülasyonlarının değerlendirilmesi için de kullanılabilir; Bu nedenle, donma-kırma tekniği, EV sınırlayıcı membranların organizasyonunu araştıran çalışmalar için Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği kılavuzlarına dahil edilmeyi hak etmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Slovenya Araştırma Ajansı tarafından finanse edilmiştir (araştırma çekirdek fonu no. P3-0108 ve proje J7-2594) ve MRIC UL IP-0510 Altyapı programı. Bu çalışma, COST (Bilim ve Teknolojide Avrupa İşbirliği) tarafından desteklenen COST Action CA17116 Perinatal Türevler Üzerine Araştırmaları Terapötik Yaklaşımlara (SPRINT) Çevirmek için Uluslararası Ağ’a katkıda bulunmaktadır. Yazarlar, Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič ve Sabina Železnik’e hücre kültürü ve numunelerin hazırlanmasında teknik yardım için ve Marko Vogrinc, Ota Širca Roš ve Nejc Debevec’e videonun hazırlanmasında teknik yardım için teşekkür eder.
A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
Tweezers | SPI, United States |