المجهر الإلكتروني لكسر التجميد لتحليل الحويصلة خارج الخلية
Summary
نقدم بروتوكولا لعزل وتكسير الحويصلات خارج الخلية (EVs) الناشئة عن الخلايا البولية اللثولية السرطانية. كشفت تقنية كسر التجميد عن قطر المركبات الكهربائية وشكلها – وكميزة فريدة من نوعها – التنظيم الداخلي لأغشية المركبات الكهربائية. هذه لها أهمية كبيرة في فهم كيفية تفاعل المركبات الكهربائية مع الأغشية المتلقية.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل محدودة الغشاء تطلق من الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية وتشارك في الاتصال بين الخلايا. تتكون المركبات الكهربائية من ثلاث مجموعات من الحويصلات ، وهي الحويصلات الدقيقة (MVs) ، والإكسوسومات ، والأجسام المستنفدة. يشارك الغشاء المحدد للمركبات الكهربائية بشكل حاسم في التفاعلات مع الخلايا المتلقية ، مما قد يؤدي إلى نقل الجزيئات النشطة بيولوجيا إلى الخلايا المتلقية ، وبالتالي يؤثر على سلوكها. تستخدم تقنية المجهر الإلكتروني لكسر التجميد لدراسة التنظيم الداخلي للأغشية البيولوجية. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل MV من الخلايا البولية الظهارية السرطانية المستزرعة وكسر التجميد ل MVs في خطوات التجميد السريع والتكسير وصنع وتنظيف النسخ المتماثلة ، وتحليلها باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. تظهر النتائج أن بروتوكول العزل ينتج عنه مجموعة متجانسة من المركبات الكهربائية ، والتي تتوافق مع شكل وحجم MVs. توجد الجسيمات داخل الغشاء بشكل رئيسي في الوجه البروتوبلازمي للغشاء المحدد. وبالتالي ، فإن كسر التجميد هو التقنية المفضلة لتوصيف قطر MVs وشكلها وتوزيع بروتينات الغشاء. ينطبق البروتوكول المقدم على مجموعات أخرى من المركبات الكهربائية.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي حويصلات محدودة الغشاء يتم إطلاقها من الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية. المجموعات الثلاث الرئيسية للمركبات الكهربائية هي الإكسوسومات والحويصلات الدقيقة (MVs) والأجسام الماصة ، والتي تختلف في أصلها وحجمها وتركيبها الجزيئي1،2،3. يعكس تكوين المركبات الكهربائية الملامح الجزيئية للخلية المانحة وحالتها الفسيولوجية (أي صحية أو مريضة)4,5. هذا يعطي EVs إمكانات هائلة في تشخيص الأمراض البشرية وتشخيصها وعلاجها ، ولها تطبيقات طبية واعدة لاستخدامها في الطب الشخصي6،7،8.
EVs هي وسطاء الاتصالات بين الخلايا. أنها تحتوي على البروتينات النشطة بيولوجيا والدهون والحمض النووي الريبي ، والتي تتداخل مع العمليات البيولوجية في الخلية المتلقية ويمكن أن تغير سلوكها 9,10. ومع ذلك ، فإن تكوين غشاء الحد من EV أمر بالغ الأهمية للتفاعل مع غشاء الخلية المتلقية.
مصادر المركبات الكهربائية هي سوائل الجسم ووسائط الثقافة المكيفة. لعزل سكان EV ، يجب استخدام تقنية عزل مناسبة. على سبيل المثال، ينتج عن الطرد المركزي عند 10,000 × g جزءا مخصب في MVs، في حين أن قوى الطرد المركزي التي تبلغ ≥100,000 × g تنتج جزءا مخصب في الإكسوسومات11,12. يجب التحقق من صحة الجزء المعزول من المركبات الكهربائية من حيث النقاء والحجم والشكل. ولهذا الغرض، أوصت الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية 2018 بثلاث فئات من تقنيات التصوير عالية الدقة: المجهر الإلكتروني، ومجهر القوة الذرية، والمجهر فائق الدقة القائم على المجهر الضوئي13. لا يمكن لأي من هذه التقنيات توفير معلومات عن غشاء EV الداخلي.
المجهر الإلكتروني لكسر التجميد هو تقنية لكسر العينات المجمدة للكشف عن هياكلها الداخلية ، وخاصة إعطاء نظرة على الغشاء الداخلي. خطوات تحضير العينة هي (1) التجميد السريع ، (2) التكسير ، (3) صنع النسخة المتماثلة ، و (4) تنظيف النسخة المتماثلة14. في الخطوة 1 ، تكون العينة (اختياريا) ثابتة كيميائيا ، محمية بالتبريد مع الجلسرين ، ومجمدة في الفريون السائل. في الخطوة 2 ، يتم كسر العينة المجمدة في وحدة كسر التجميد ، والتي تكشف عن الجزء الداخلي من الطبقة الثنائية للغشاء. في الخطوة 3 ، يتم تظليل الوجوه المكسورة المكشوفة بالبلاتين (Pt) والكربون (C) لإنتاج نسخ متماثلة. في الخطوة 4 ، تتم إزالة المواد العضوية. يتم تحليل النسخة المتماثلة في المجهر الإلكتروني الناقل (TEM). للحصول على تفسير دقيق للرسوم البيانية المجهرية ، يجب على المرء اتباع الإرشادات الخاصة بتوجهها الصحيح14,15. باختصار ، اتجاه الظلال في المجهر هو مرجع لتوجيه المجهر (أي لتحديد اتجاه تظليل Pt) ، وبالتالي تحديد الأشكال المحدبة والمقعرة (الشكل 1). يمكن رؤية وجهين داخليين يطلق عليهما الوجوه المكسورة للطبقة الثنائية الغشائية نتيجة لتقسيم الغشاء عن طريق التكسير بالتجميد: الوجه البروتوبلازمي (P-face) والوجه الخارجي (E-face). يمثل الوجه P نشرة الغشاء المجاورة لبروتوبلازم الخلية ، بينما يمثل الوجه E نشرة الغشاء المجاورة للفضاء خارج الخلية. ينظر إلى بروتينات الغشاء المتكاملة وارتباطاتها على أنها جزيئات بارزة داخل الغشاء14,15.
هنا ، الهدف هو تطبيق تقنية كسر التجميد لتوصيف MVs من حيث الحجم والشكل وبنية غشاء الحد منها. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتكسير التجميد ل MVs الناشئة عن الخلايا البولية اللثولية السرطانية الغازية للمثانة البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن توصيف MVs ، أو أي مجموعة أخرى من المركبات الكهربائية المعزولة ، له أهمية قصوى للبدء به قبل البدء في التحليلات النهائية مثل دراسات “omics” أو الدراسات الوظيفية11,18. هنا ، تم عزل EVs من خلايا T24 البولية الغازية لسرطان المثانة البشرية عن طريق الطرد المركزي ، وبعد البروتوكول المقدم للتحليل بواسطة المجهر الإلكتروني لكسر التجميد ، أثبتنا أن الجزء المعزول تم إثراؤه في MVs11,13. كان عزل MVs خاليا من حطام الخلايا أو العضيات ، مما يؤكد نجاح بروتوكول العزل والتنقية.
واحتفظ الجمع بين التثبيت الكيميائي والتجميد، وهما خطوتان حاسمتان في البروتوكول، بالشكل الكروي للمركبات الكهربائية12. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى احتياطات عند تقييم قطر EV عن طريق تكسير التجميد17. نظرا لأن الكسر يمر عبر العينة بشكل عشوائي ، يتم تقسيم أغشية MV إلى مستوياتها الاستوائية وغير الاستوائية. لتوفير طريقة صارمة لتحليل صور العينات المكسورة والمظللة بالتجميد ، أظهر Hallett et al. أن متوسط قطر الحويصلة هو 4/π أضعاف الحجم الفعلي للقطر الحويصلي على الصورة17. مع الأخذ في الاعتبار ذلك ، تم حساب EVs من خلايا T24 على أن قطرها 304 نانومتر ، وهو ما يتناسب مع نطاق توزيع الحجم النظري ل MV من 100-1000 نانومتر19.
يمكن أن يكمل تكسير التجميد التلطيخ السلبي ، وهي تقنية TEM الأكثر استخداما على نطاق واسع لتصور المركبات الكهربائية. عن طريق التلطيخ السلبي ، عادة ما تكون العينة ثابتة كيميائيا ومجففة ومتصلة بشبكة TEM ، وتتناقض مع محلول اليورانيل. بدون دعم الوسائط ، تميل المركبات الكهربائية إلى الانهيار ، مما يمنحها مظهرا على شكل كوب. من خلال تكسير التجميد ، نظهر أن MVs عبارة عن كرات ، والتي تعكس شكلها في المساحات خارج الخلية وسوائل الجسم12. وبذلك، تتفق نتائجنا أيضا مع ملاحظات المركبات الكهربائية في الأقسام الرقيقة جدا المبردة20.
تتمثل إحدى المزايا الحاسمة لتقنية كسر التجميد في قدرتها على حل التنظيم الداخلي للغشاء المحدد ، وهو عامل رئيسي في فهم كيفية استهداف المركبات الكهربائية للأغشية المتلقية وتفاعلها معها. هنا ، قمنا بتحليل أغشية MVs ، ومع ذلك يمكن أن يكشف تكسير التجميد عن تنظيم الغشاء لأي مجموعة أخرى من المركبات الكهربائية. يتم تشكيل MVs عن طريق تبرعم غشاء البلازما. لذلك ، من المتوقع أن توجد بروتينات غشاء البلازما ومجموعات البروتين في غشاء MV. دعمت نتائجنا أن MVs من خلايا T24 تحتوي على جزيئات داخل الغشاء ، وتقدم بروتينات غشاء متكاملة. استنادا إلى توزيع الجسيمات بين E-face و P-face ، من المعقول أن نتوقع أن الجسيمات التي لوحظت في MVs هي بروتينات عبر الغشاء uroplakins ، وهي خلية عظمية خاصة21,24. كانت الجسيمات المرصودة متناثرة ، وهو ما يتوافق مع الدراسات السابقة التي أبلغت عن انخفاض في uroplakins أثناء التسرطن البولي 21،22،23. ومع ذلك ، لمزيد من التحقيق في تكوين البروتين لأغشية MV ، يوصى باستخدام تقنية وضع العلامات المناعية المقلدة لكسر التجميد (FRIL). FRIL هو ترقية لتقنية كسر التجميد المقدمة وهو مكرس للكشف عن هوية البروتينات في النسخ المتماثلة عن طريق التعرف على الأجسام المضادة24,25. باختصار ، فإن تقنية كسر التجميد هي تقنية مجهر إلكتروني مناسبة لتوصيف الغشاء المحدد لل EV ، وكذلك شكل وحجم ونقاء أجزاء EV المعزولة. ويمكن استخدام البروتوكول المقدم أيضا لتقييم المجموعات السكانية الأخرى من المركبات الكهربائية المعزولة؛ لذلك ، فإن تقنية تكسير التجميد تستحق إدراجها في إرشادات الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية للدراسات التي تستكشف تنظيم أغشية الحد من EV.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل وكالة البحوث السلوفينية (رقم التمويل الأساسي للبحوث. P3-0108 والمشروع J7-2594) وبرنامج البنية التحتية MRIC UL IP-0510. يساهم هذا العمل في الشبكة الدولية COST Action CA17116 لترجمة البحوث المتعلقة بمشتقات الفترة المحيطة بالولادة إلى نهج علاجية (SPRINT) ، بدعم من COST (التعاون الأوروبي في العلوم والتكنولوجيا). يود المؤلفون أن يشكروا ليندا ستروس وسانيا تشابراجا وندى بافليكا دوباريتش وسابينا زيليزنيك على المساعدة التقنية في زراعة الخلايا وإعداد العينات وماركو فوغرينك وأوتا سيركا روس ديبيفيك للمساعدة التقنية في إعداد الفيديو.
Materials
| A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
| Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
| CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
| Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
| Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
| Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
| F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
| FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
| Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
| Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
| Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
| GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
| Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
| Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
| Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
| Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
| Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
| Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
| Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
| Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
| Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
| Tweezers | SPI, United States |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
- Tricarico, C., Clancy, J., D’Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
- Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
- Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D’Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).
- Severs, N. J., Robenek, H. Freeze-fracture cytochemistry in cell biology. Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
- Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
- Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
- Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
- Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
- Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
- Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
- Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).
