Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV
Summary
Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.
Abstract
A microscopia crio-elétron (crio-EM) foi estabelecida como um método rotineiro para a determinação da estrutura proteica durante a última década, tomando uma parcela cada vez maior dos dados estruturais publicados. Os recentes avanços na tecnologia e automação TEM aumentaram tanto a velocidade de coleta de dados quanto a qualidade das imagens adquiridas, ao mesmo tempo em que diminuíram o nível de experiência necessário para a obtenção de mapas crio-EM em resoluções sub-3 Å. Embora a maioria dessas estruturas de alta resolução tenha sido obtida usando sistemas crio-TEM de última geração de 300 kV, estruturas de alta resolução também podem ser obtidas com sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente quando equipadas com um filtro de energia. Além disso, a automação de alinhamentos de microscópios e coleta de dados com avaliação da qualidade da imagem em tempo real reduz a complexidade do sistema e garante configurações ideais de microscópio, resultando em aumento do rendimento de imagens de alta qualidade e rendimento geral da coleta de dados. Este protocolo demonstra a implementação de recentes avanços tecnológicos e recursos de automação em um microscópio eletrônico criotransiência de 200 kV e mostra como coletar dados para a reconstrução de mapas 3D suficientes para a construção do modelo atômico de Novo . Focamos nas melhores práticas, variáveis críticas e questões comuns que devem ser consideradas para permitir a coleta rotineira de tais conjuntos de dados crio-EM de alta resolução. Particularmente os seguintes tópicos essenciais são revisados em detalhes: i) automação de alinhamentos de microscópio, ii) seleção de áreas adequadas para aquisição de dados, iii) parâmetros ópticos ideais para coleta de dados de alta qualidade, coleta de dados de alto rendimento, iv) ajuste de filtro de energia para imagem de perda zero e v) gerenciamento de dados e avaliação da qualidade. A aplicação das melhores práticas e melhoria da resolução alcançável usando um filtro de energia será demonstrada no exemplo da apo-ferritin que foi reconstruída a 1,6 Å, e thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstruída à resolução 2.1-Å usando um TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto.
Introduction
A determinação da estrutura proteica é fundamental para entender a arquitetura molecular, a função e a regulação dos complexos proteicos envolvidos nos principais processos celulares, como metabolismo celular, transdução de sinais ou interações hospedeiro-patógeno. A microscopia crio-elétron (crio-EM) emergiu como uma técnica poderosa capaz de resolver a estrutura 3D de muitas proteínas e seus complexos que eram muito desafiadores para as técnicas estruturais tradicionais, como difração de raios-X e espectroscopia de NMR. Particularmente, a crio-EM tem sido comprovada como o método de escolha para proteínas de membrana, que não podem ser prontamente cristalizadas ou preparadas em quantidades suficientes para as técnicas estruturais tradicionais, e forneceu novas percepções sobre a estrutura e função de importantes receptores celulares e canais de íons 1,2,3,4,5 . Mais recentemente, a crio-EM desempenhou um papel importante no combate à pandemia Covid-19, determinando o mecanismo da infecção pelo SARS-CoV-2 no nível molecular, que elucidou as origens da doença de Covid-19 e forneceu a base para o rápido desenvolvimento de vacinas eficientes e terapêuticas 6,7,8,9,10.
Normalmente, microscópios eletrônicos de transmissão de 300 kV high-end (TEM) são usados para determinação de estrutura de alta resolução de biomoléculas por análise de partículas únicas crio-EM (SPA) para revelar sua conformação e interações. Recentemente, a técnica SPA atingiu uma nova fronteira quando a amostra de referência comum crio-EM apo-ferritin foi reconstruída em resolução atômica (1.2 Å)11,12 usando um TEM de 300 kV equipado com a pistola de emissão de campo frio (E-CFEG), um detector de elétrons direto e um filtro de energia. Nesta resolução, foi possível resolver inequivocamente posições de átomos individuais na estrutura, conformação de cadeias laterais de aminoácidos individuais, bem como ligação de hidrogênio e outras interações, que abrem novas possibilidades para a descoberta de medicamentos baseado em estrutura de novos alvos e otimização de candidatos a medicamentos existentes.
Microscópios TEM de médio alcance de 200 kV são frequentemente usados para triagem de amostras e otimização de amostras antes da coleta final de dados de alta resolução usando os microscópios TEM high-end, particularmente em instalações maiores crio-EM. Normalmente, amostras de imagem podem ser resolvidas na faixa de resolução de 3-4 Å que é suficiente para mover-se para um TEM de 300 kV high-end para coleta final de dados. Consequentemente, a coleta de dados usando o TEM de 200 kV muitas vezes não é mais otimizada para os resultados de resolução mais altos possíveis. Além disso, muitas questões biológicas interessantes já podem ser respondidas e publicadas nessas resoluções, pois todas as cadeias laterais de aminoácidos já estão resolvidas, e a ocupação de locais de ligação de ligantes também pode ser determinada de forma confiável13. Já foi demonstrado que tems de 200 kV podem alcançar resoluções além de 3 Å para inúmeras amostras 14,15,16,17,18. Imagens tiradas a 200 kV exibem contraste inerentemente maior de partículas de imagem, o que pode até facilitar um alinhamento inicial mais preciso das partículas, apesar do sinal mais atenuado em alta resolução em comparação com as imagens TEM de 300 kV. É importante notar que a resolução alcançada de mapas crio-EM reconstruídos também é limitada pela flexibilidade estrutural e heterogeneidade conformacional das amostras imagens, o que impacta tanto as reconstruções de 200 kV quanto de 300 kV. Na verdade, muito mais reconstruções crio-EM obtidas usando os sistemas de 300 kV foram resolvidas na faixa de resolução 3-4 Å do que em resoluções mais altas19. Como os microscópios TEM de 200 kV são menos complexos e se encaixam em salas menores, esses microscópios representam uma boa opção de menor custo para a determinação da estrutura de macromoléculas biológicas por crio-EM, preservando a automação de coleções de dados longas de várias amostras armazenadas dentro do sistema de microscópio Autoloader.
A coleta de conjuntos de dados crio-EM para determinação da estrutura de alta resolução requer um alinhamento preciso da óptica do microscópio. Os alinhamentos das colunas prosseguem sistematicamente da fonte eletrônica até o sistema de lentes condensadoras, a lente objetiva e o filtro de energia com um detector de elétrons. A sequência completa de alinhamentos normalmente não é necessária. Quando necessário, o usuário é guiado por procedimentos semi-automatizados com uma descrição adequada de cada etapa em uma janela de ajuda consciente do contexto durante todo o procedimento de alinhamento na interface do usuário do microscópio (painel de controle de Alinhamentos Diretos). Uma vez que o microscópio está totalmente alinhado, a óptica eletrônica permanece estável, e os alinhamentos não precisam ser alterados por pelo menos alguns meses. Apenas os alinhamentos mais sensíveis, como a iluminação paralela do plano amostral, o astigmatismo objetivo e o alinhamento sem coma, devem ser refinados pouco antes de iniciar a coleta de cada conjunto de dados. A qualidade dos dados coletados pode então ser monitorada durante a coleta de dados usando diferentes pacotes de software, como EPU Quality Monitor, crioSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 ou Appion24.
Além de alinhamentos precisos do microscópio, a alta qualidade de amostras bem purificadas com heterogeneidade conformacional e composicional mínima também é um pré-requisito para a coleta de conjuntos de dados de alta resolução e resolução de estruturas de alta resolução. Mais detalhes sobre protocolos típicos, desafios frequentes e possíveis remédios podem ser encontrados em outras revisões dedicadas a este tópico 25,26,27. Essencialmente, é fundamental encontrar áreas em uma determinada grade crio-EM que tenha gelo suficientemente fino para preservar informações de alta resolução, e partículas individuais são densamente distribuídas em orientações aleatórias sem sobreposições. No entanto, as grades crio-EM típicas têm espessura de gelo não uniforme e, portanto, é importante encontrar e selecionar as áreas ideais para imagens. Diferentes meios para estimativa de espessura de gelo na rede estão disponíveis em pacotes de software dedicados à coleta automatizada de conjuntos de dados crio-EM, como EPU 2, Leginon28 ou SerialEM29.
O advento de detectores de elétrons diretos rápidos e sensíveis possibilitou a coleta de imagens em muitas frações como filmes que permitiram a compensação dos movimentos induzidos pelo feixe e resultaram em um aumento substancial na qualidade e quantidade de dados usados no processamento de imagens e na reconstrução 3D final30. Ao mesmo tempo, a automação e a coleta de dados de alto rendimento fornecem enormes conjuntos de dados com milhares de imagens/filmes que representam desafios para armazenamento e acesso de dados. O modelo adotado com grandes instalações crio-EM que atendem dezenas a centenas de usuários, especialmente solicita o gerenciamento de dados organizado com rastreamento adequado e compartilhamento de dados em dutos crio-EM estabelecidos31,32.
Este estudo descreve um protocolo para coleta de rotina de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando o microscópio DE 200 kV Glacios TEM. Os alinhamentos necessários da óptica do microscópio são descritos juntamente com procedimentos para avaliação de amostras crio-EM e seleção de áreas adequadas para coleta de dados de alta resolução. A organização de dados coletados e metadados relacionados com informações amostrais é demonstrada na Athena – uma plataforma de gerenciamento de dados que facilita a revisão das informações amostrais e dados coletados. Usando a amostra de apo-ferritina do mouse, foi possível alcançar uma reconstrução 3D a 1,6 Å resolução13. Usando o protocolo descrito, também reconstruímos o mapa de densidade 3D do proteasome 20S a partir de Thermoplasma acidophilum com resolução de 2,1 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito pressupõe que a óptica do microscópio TEM usado está em um estado bem alinhado. Para os 200 kV TEM utilizados neste Protocolo, tais alinhamentos de coluna são feitos, verificados e salvos por um engenheiro de serviço experiente após a instalação do microscópio ou qualquer intervenção significativa do serviço. Essas configurações de alinhamento podem ser retiradas a qualquer momento na interface do microscópio. Os usuários podem usar os procedimentos de Alinhamento Direto na interface do microscópio UI para reejustar parâmetros críticos. Alguns alinhamentos, como inclinação de arma e troca de armas, são estáveis e não precisam ser ajustados pelos usuários diariamente. Verificações e re-alinhamentos (se necessário) de inclinação de arma e mudança pelo supervisor de microscópio são aconselhados duas vezes por ano. Por outro lado, alguns alinhamentos são críticos e devem ser alinhados antes de cada coleta de dados, conforme descrito no protocolo acima (como astigmatismo objetivo e alinhamento sem coma). Se a função Autocoma no software de análise não convergir, o alinhamento dos pontos de pivô de inclinação do feixe e/ou centro de rotação deve ser verificado e ajustado, e o centro correto da abertura C2 deve ser confirmado. Posteriormente, a função Autostigmate deve ser executada à medida que os estigmas objetivos também são usados para correção de coma. Esses alinhamentos devem ser iterados até que tanto o Autostigmate quanto o Autocomafunctions tenham sucesso em sua primeira iteração. Se necessário, outra área pode ser selecionada (por exemplo, suporte a folha de carbono sem gelo), desfoco ajustado por imagem ou tempo de aquisição de imagem aumentado para otimizar a relação sinal-ruído em imagens adquiridas e a visibilidade de múltiplos anéis Thon na transformação Fourier das imagens adquiridas.
Microscópios crio-EM modernos geram grandes quantidades de dados que muitas vezes excedem 1 TB por conjunto de dados para alcançar reconstruções 3D de alta resolução, particularmente para proteínas com baixa simetria. Os dados e os resultados crio-EM também são tipicamente complementados por dados e resultados de métodos ortogonais para entender completamente as relações estrutura-função em cada projeto científico. A organização dos dados coletados, sua transferência para um pipeline de processamento de imagens e o compartilhamento de uma reconstrução crio-EM resultante entre os colaboradores colocam requisitos adicionais sobre novos adotantes da metodologia crio-EM para configurar sua infraestrutura local de TI. Softwares de gerenciamento de dados, como o Athena, facilitam o armazenamento centralizado de dados adquiridos por qualquer instrumento ou software conectado operado por um usuário registrado. Dados e metadados armazenados são acessíveis usando uma interface simples do navegador da Web por vários usuários, que podem ter diferentes funções no projeto com diferentes direitos de acesso (seja como proprietário, colaborador ou visualizador) com base em suas credenciais de login e definição de compartilhamento de dados na configuração do Experimento. Essa digitalização dos fluxos de trabalho experimentais fornece meios para o compartilhamento de dados e metadados entre colaboradores sem duplicação desnecessária e aumenta a produtividade e rastreabilidade dos fluxos de trabalho usados. A implementação de uma estrutura geral e personalizável de projetos, experimentos e fluxos de trabalho em softwares de gerenciamento de dados é universal e permite a personalização e integração de experimentos ortogonais usando métodos complementares em um único banco de dados de projetos.
A seleção de áreas para a coleta de dados em uma grade crio-EM é fundamental para a aquisição bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução. As grades Crio-EM produzidas com dispositivos tradicionais de congelamento de mergulho, como o Vitrobot (um sistema de vitrificação totalmente automatizado), normalmente exibirão um gradiente de espessura de gelo sobre a superfície da grade (Figura 4). Isso pode ser benéfico, pois a rede contém áreas com diferentes espessuras de gelo; no entanto, áreas com a espessura ideal do gelo para coleta de dados devem ser identificadas conforme descrito no protocolo acima. Uma grade crio-EM ideal deve conter o mínimo possível de contaminação de gelo de transferência e conter quadrados de grade suficientes com papel alumínio de suporte furado intacto. A coleta de dados em quadrados de grade que tenham rachaduras ou áreas quebradas não é recomendada, pois as imagens coletadas serão afetadas por uma deriva geral significativamente mais forte após a iluminação por um feixe de elétrons em comparação com os quadrados de grade com papel alumínio intacto. O excesso de gelo cristalino pode ocluir a maioria dos buracos de papel alumínio e/ou interferir no foco automático e tais quadrados de grade também devem ser evitados. Quadrados de grade com gelo fino geralmente exibem grandes áreas vítreas e muitos buracos de folha brilhante que são visíveis em uma imagem tirada usando a predefinição do Atlas. A ocorrência de gelo mais espesso perto de barras de grade é esperada e acrítica, pois os buracos de papel alumínio nessas áreas da grade quadrada são excluídos durante o processo de Seleção de Buracos. A presença de vários buracos vazios em um quadrado de grade pode significar que o gelo vítreo nos orifícios circundantes é extremamente fino e pode conter partículas danificadas ou nenhuma partícula. Geralmente, é sábio escolher quadrados de grade com uma variedade de espessuras de gelo em diferentes regiões da rede para triagem inicial e avaliação para entender quais áreas têm as melhores condições para coleta de dados de alta resolução e exibir a densidade ideal de partículas e distribuição de orientação. Para as amostras proteassentas apoF e 20S utilizadas neste estudo, as áreas com o gelo mais fino observável contêm as melhores condições para imagens de alta resolução dessas amostras.
Ao selecionar os orifícios automaticamente em todos os quadrados de grade selecionados usando o software de coleta de dados, é aconselhável executar a tarefa de execução de modelos em um orifício representativo em cada quadrado de grade para verificar e garantir que não foram escolhidos quadrados excessivamente grossos, nem excessivamente finos, nem inesperadamente não vitreous para coleta de dados. Durante a aquisição de dados, os principais indicadores de qualidade das imagens coletadas, como deriva de imagem e encaixe ctf, podem ser monitorados usando EQM. A coleta de dados pode então ser otimizada pulando áreas que produzem imagens de má qualidade. No entanto, imagens com ajustes ctf de alta resolução ainda podem conter imagens com partículas em algumas orientações preferidas ou partículas desnaturadas em uma camada de gelo muito fina. A colheita de partículas em tempo real e a classificação 2D de imagens coletadas forneceriam informações adicionais sobre a qualidade dos dados estruturais em partículas imagens e revelariam as orientações preferidas de partículas intactas no gelo ou estrutura inconsistente de partículas (parcialmente) desnaturadas. O cálculo das médias de classes pode, portanto, ajudar a refinar ainda mais regiões apropriadas para coleta de dados, como já foi implementado e mostrado em outros pacotesde software 23,28.
A seleção das configurações de imagem para aquisição de dados, como ampliação, taxa de dose de elétrons e intervalo de desfoco, depende de vários critérios, como a resolução de destino, tamanho da proteína, concentração de amostras, rendimento do microscópio desejado, etc. Para a câmera do detector de elétrons diretos usada nestes experimentos, a taxa de dose de elétrons foi escolhida na faixa de 4-5 e–/pix/s, selecionando um tamanho e intensidade SPOT apropriados para manter a iluminação paralela. Como mostrado na Tabela 1, um tamanho SPOT diferente pode ser usado na predefinição hole/eucentric Height para garantir a relação sinal-ruído suficiente na imagem para o centro de furos durante a coleta de dados. A ampliação deve ser escolhida de modo que o tamanho do pixel seja pelo menos 2-3x menor do que a resolução de destino para a reconstrução crio-EM. No entanto, a ampliação mais alta (ou seja, menor tamanho de pixel) é usada, o campo de visão menor é capturado em imagens, e há menos partículas por imagem, o que acaba levando a um tempo de coleta de dados mais longo para coletar imagens com partículas suficientes para reconstruir mapas 3D para uma alta resolução. Para a amostra apoF, utilizamos o tamanho do pixel de 0,43 Å, pois tínhamos concentração amostral suficiente para alta densidade de partículas em imagens e resolução sub-2 Å da reconstrução. Para a amostra proteasome 20S, usamos o tamanho do pixel de 0,68 Å para cobrir um campo de visão maior em imagens adquiridas. Normalmente para microscópios TEM de 200 kV, as imagens crio-EM são adquiridas na faixa de desfocus de 0,8 a 2,0 μm. No entanto, com a melhor relação contraste e sinal-ruído usando o filtro de energia, as aquisições de dados podem ser feitas muito mais perto de se concentrar para preservar melhor as informações de alta resolução em imagens adquiridas devido a aberrações menores e a decadência correspondentemente reduzida da função do envelope CTF. Também não usamos uma abertura objetiva, pois a abertura pode introduzir aberrações adicionais de imagem, enquanto o contraste de imagem já é suficientemente aprimorado usando o filtro de energia. Para as amostras proteassentas apoF e 20S, utilizou-se as configurações de desfoco de 0,5 μm, 0,7μm e 0,9 μm. Para proteínas menores (<200 kDa), utilizamos configurações de desfoco de -0,5 μm, -0,7 μm e -0,9 μm para melhorar o contraste das partículas e facilitar a colheita de partículas e alinhamento inicial grosseiro na etapa de refinamento 3D da reconstrução 3D, o que levou à resolução 3D de ~2,5 Å (resultados inéditos).
Já mostramos que a imagem com um filtro de energia melhora a relação sinal-ruído (SNR) em imagens crio-EM coletadas nos microscópios TEM de 300 kVhigh-end 11. De fato, quando os elétrons passam por uma amostra, dois tipos principais de interações ocorrem: i) Elétrons dispersos elásticos mantêm sua energia e contribuem para a formação de imagens por interferência com o feixe de incidentes não dispersos através do mecanismo de contraste de fase ii) elétrons inelasticamente dispersos perdem alguma energia na amostra e contribuem principalmente para o ruído nas imagens. Portanto, o SNR pode ser significativamente melhorado filtrando os elétrons inestaticamente dispersos, que têm energia menor do que o feixe de incidentes e elétrons dispersos esteticamente, usando uma fenda de energia estreita. No entanto, é fundamental usar um filtro de energia suficientemente estável, como o Selectris ou Selectris-X, para poder usar fendas muito estreitas (10 eV ou menores) ao longo (mais de 12 horas) de aquisição automatizada de dados de conjuntos de dados crioEM de alta resolução.
As imagens Crio-EM adquiridas com microscópios TEM de 200 kV nas mesmas condições que com microscópios TEM de 300 kV exibem SNR menor em alta resolução (particularmente <4 Å) devido à decadência mais rápida das funções do envelope CTF. Consequentemente, um maior número de partículas (e, portanto, um maior número de imagens coletadas) é necessário para alcançar uma certa resolução ao usar TEMs de 200 kV. Além disso, a profundidade de campo (10-25 nm na faixa de resolução 2-3 Å) também é cerca de 20% menor em imagens de 200 kV35, o que significa que menos partículas na camada de gelo (tipicamente de 20-50 nm de espessura) estarão totalmente em foco e contribuirão construtivamente para todas as características de alta resolução de uma reconstrução 3D calculada, a menos que os valores de desfocto sejam refinados para cada partícula independentemente nos estágios posteriores do procedimento de reconstrução 3D. Para partículas maiores (como virões icosaedrais ou outros conjuntos macromoleculares), o tamanho das partículas pode exceder a profundidade do campo em altas resoluções e introduzir erros de fase devido à aproximação planar da esfera Ewald nos algoritmos de reconstrução 3D padrão36. Esses erros podem ser refinados por algoritmos avançados que já são implementados em pacotes comuns de processamento de imagens crio-EM 37,28,39. Como a esfera Ewald tem maior curvatura em dados de 200 kV do que os dados de 300 kV, a correção da esfera de Ewald é necessária em resoluções relativamente menores e/ou para conjuntos macromoleculares relativamente menores ao usar TEMs de 200 kV. Por outro lado, imagens de 200 kV exibem maior contraste de partículas em gelo fino (20-50 nm) que é significativamente mais fino que o elétron de 200-300 keV caminho livre médio (220-280 nm). O contraste maior ajuda a melhorar o alinhamento global correto das partículas individuais, particularmente para dispersar fracamente proteínas menores cuja estrutura ainda não é conhecida, e o modelo de referência 3D ainda não está bem estabelecido.
Aqui, demonstramos no exemplo de um proteasome 20S que o contraste e a qualidade da imagem poderiam ser igualmente melhorados com um filtro de energia ao usar um microscópio TEM de 200 kV. Utilizando o mesmo número de partículas, os dados coletados usando a fenda de 20 eV foram reconstruídos para resolução de 2,26 Å em comparação com os dados coletados com a fenda de energia totalmente aberta que foi reconstruída apenas para resolução de 2,34 Å. A melhor reconstrução foi obtida a partir de dados coletados utilizando a fenda de 10 eV que foi reconstruída para resolução de 2,14 Å. Esses resultados estão de acordo com a previsão teórica de que a filtragem dos elétrons inestaticamente dispersos aumenta o SNR em imagens coletadas e facilita maior resolução nas reconstruções crio-EM a partir do determinado número de partículas, como resumido na Tabela 4. Esses resultados foram ainda confirmados pelos fatores B calculados a partir desses conjuntos de dados que indicam maior qualidade das imagens nos conjuntos de dados filtrados por energia.
Podemos, portanto, concluir que, embora os microscópios TEM de 300 kV ofereçam o maior rendimento e a maior resolução possível em reconstruções crio-EM, os microscópios TEM de 200 kV também fornecem conjuntos de dados de alta qualidade para reconstruções crio-EM de alta resolução. Mostramos aqui que a qualidade das imagens adquiridas e, portanto, o tempo geral para estrutura, pode ser melhorada usando o TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto. O Protocolo apresentado descreve todas as etapas necessárias sobre como obter rotineiramente dados crio-EM de alta resolução usando esta configuração e revelar detalhes estruturais finos das estruturas 3D macromoleculares, que são essenciais para entender as principais relações estruturais-funções na biologia estrutural e no design de medicamentos baseados em estruturas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
| Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
| EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
| EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
| Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
| Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
| Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
| GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
| QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
| Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
| Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
| Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
| UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
| Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
| Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |
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