Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop
Summary
Hochauflösende Kryo-EM-Karten von Makromolekülen können auch mit 200-kV-TEM-Mikroskopen erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt die Best Practices für die Einstellung genauer optischer Ausrichtungen, Datenerfassungsschemata und Auswahl von Bildbereichen, die für die erfolgreiche Erfassung hochauflösender Datensätze mit einem 200-kV-TEM unerlässlich sind.
Abstract
Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich in den letzten zehn Jahren als Routinemethode zur Bestimmung der Proteinstruktur etabliert und nimmt einen immer größeren Anteil der veröffentlichten Strukturdaten ein. Jüngste Fortschritte in der TEM-Technologie und -Automatisierung haben sowohl die Geschwindigkeit der Datenerfassung als auch die Qualität der aufgenommenen Bilder erhöht und gleichzeitig das erforderliche Maß an Fachwissen für die Beschaffung von Kryo-EM-Karten mit Auflösungen unter 3 Å verringert. Während die meisten dieser hochauflösenden Strukturen mit modernsten 300-kV-Kryo-TEM-Systemen erhalten wurden, können hochauflösende Strukturen auch mit 200-kV-Kryo-TEM-Systemen erhalten werden, insbesondere wenn sie mit einem Energiefilter ausgestattet sind. Darüber hinaus reduziert die Automatisierung der Mikroskopausrichtung und Datenerfassung mit Echtzeit-Bildqualitätsbewertung die Systemkomplexität und gewährleistet optimale Mikroskopeinstellungen, was zu einer erhöhten Ausbeute an qualitativ hochwertigen Bildern und einem Gesamtdurchsatz der Datenerfassung führt. Dieses Protokoll demonstriert die Implementierung der jüngsten technologischen Fortschritte und Automatisierungsfunktionen auf einem 200-kV-Kryo-Transmissionselektronenmikroskop und zeigt, wie Daten für die Rekonstruktion von 3D-Karten gesammelt werden können, die für die Erstellung von De-novo-Atommodellen ausreichen. Wir konzentrieren uns auf Best Practices, kritische Variablen und häufige Probleme, die berücksichtigt werden müssen, um die routinemäßige Erfassung solcher hochauflösenden Kryo-EM-Datensätze zu ermöglichen. Insbesondere werden folgende wesentliche Themen im Detail behandelt: i) Automatisierung der Mikroskopausrichtung, ii) Auswahl geeigneter Bereiche für die Datenerfassung, iii) optimale optische Parameter für eine qualitativ hochwertige Datenerfassung mit hohem Durchsatz, iv) Energiefilter-Tuning für verlustfreie Bildgebung und v) Datenmanagement und Qualitätsbewertung. Die Anwendung der Best Practices und die Verbesserung der erreichbaren Auflösung unter Verwendung eines Energiefilters werden am Beispiel von Apoferritin demonstriert, das auf 1,6 Å rekonstruiert wurde, und Thermoplasma acidophilum 20S Proteasom, das mit einem 200-kV-TEM, das mit einem Energiefilter und einem direkten Elektronendetektor ausgestattet ist, auf eine Auflösung von 2,1 Å rekonstruiert wurde.
Introduction
Die Bestimmung der Proteinstruktur ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Architektur, Funktion und Regulation von Proteinkomplexen, die an wichtigen zellulären Prozessen wie Zellstoffwechsel, Signaltransduktion oder Wirt-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind. Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, die in der Lage ist, die 3D-Struktur vieler Proteine und ihrer Komplexe zu lösen, die für die traditionellen Strukturtechniken wie Röntgenbeugung und NMR-Spektroskopie zu herausfordernd waren. Insbesondere hat sich Kryo-EM als Methode der Wahl für Membranproteine erwiesen, die für die traditionellen Strukturtechniken nicht ohne weiteres kristallisiert oder in ausreichenden Mengen hergestellt werden können, und lieferte neue Einblicke in die Struktur und Funktion wichtiger zellulärer Rezeptoren und Ionenkanäle 1,2,3,4,5 . In jüngster Zeit hat Kryo-EM eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung der Covid-19-Pandemie gespielt, indem es den Mechanismus der SARS-CoV-2-Infektion auf molekularer Ebene bestimmte, was die Ursprünge der Covid-19-Krankheit aufklärte und die Grundlage für die schnelle Entwicklung effizienter Impfstoffe und Therapeutika bildete 6,7,8,9,10.
Typischerweise werden High-End-300-kV-Transmissionselektronenmikroskope (TEM) zur hochauflösenden Strukturbestimmung von Biomolekülen durch Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse (SPA) verwendet, um ihre Konformation und Wechselwirkungen aufzudecken. Vor kurzem erreichte die SPA-Technik eine neue Grenze, als das gemeinsame Benchmark-Kryo-EM-Probenapoferritin mit atomarer Auflösung (1,2 Å) 11,12 unter Verwendung eines 300-kV-TEM, das mit der Kaltfeldemissionskanone (E-CFEG), einem direkten Elektronendetektor und einem Energiefilter ausgestattet war, rekonstruiert wurde. Bei dieser Auflösung war es möglich, Positionen einzelner Atome in der Struktur, die Konformation einzelner Aminosäureseitenketten sowie Wasserstoffbrückenbindungen und andere Wechselwirkungen eindeutig aufzulösen, die neue Möglichkeiten für die strukturbasierte Wirkstoffentdeckung neuer Ziele und die Optimierung bestehender Wirkstoffkandidaten eröffnen.
200-kV-TEM-Mikroskope mittlerer Reichweite werden häufig für das Probenscreening und die Probenoptimierung vor der endgültigen hochauflösenden Datenerfassung mit den High-End-TEM-Mikroskopen verwendet, insbesondere in größeren Kryo-EM-Einrichtungen. Typischerweise können abgebildete Proben im Auflösungsbereich von 3-4 Å aufgelöst werden, der ausreicht, um zur endgültigen Datenerfassung zu einem High-End-TEM mit 300 kV überzugehen. Folglich wird die Datenerfassung mit dem 200-kV-TEM oft nicht weiter optimiert, um Ergebnisse mit höchstmöglicher Auflösung zu erzielen. Darüber hinaus können bei diesen Auflösungen bereits viele interessante biologische Fragen beantwortet und veröffentlicht werden, da alle Aminosäure-Seitenketten bereits gelöst sind und auch die Belegung von Ligandenbindungsstellen zuverlässig bestimmt werdenkann 13. Es wurde bereits gezeigt, dass 200-kV-TEMs für zahlreiche Proben 14,15,16,17,18 Auflösungen jenseits von 3 Å erreichen können. Bilder, die mit 200 kV aufgenommen wurden, weisen von Natur aus einen höheren Kontrast der abgebildeten Partikel auf, was trotz eines gedämpfteren Signals bei hoher Auflösung im Vergleich zu 300-kV-TEM-Bildern sogar eine genauere anfängliche Ausrichtung der Partikel ermöglichen kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die erreichte Auflösung rekonstruierter Kryo-EM-Karten auch durch strukturelle Flexibilität und Konformationsheterogenität der abgebildeten Proben begrenzt ist, was sich sowohl auf 200-kV- als auch auf 300-kV-Rekonstruktionen auswirkt. Tatsächlich wurden viel mehr Kryo-EM-Rekonstruktionen, die mit den 300-kV-Systemen erhalten wurden, im Auflösungsbereich von 3-4 Å aufgelöst als bei höheren Auflösungen19. Da 200-kV-TEM-Mikroskope weniger komplex sind und in kleinere Räume passen, stellen diese Mikroskope eine gute, kostengünstigere Option für die Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle durch Kryo-EM dar, während die Automatisierung langer Datensammlungen aus mehreren im Mikroskop-Autoloader-System gespeicherten Proben erhalten bleibt.
Die Sammlung von Kryo-EM-Datensätzen zur hochauflösenden Strukturbestimmung erfordert eine genaue Ausrichtung der Mikroskopoptik. Säulenausrichtungen verlaufen systematisch von der Elektronenquelle bis hinunter zum Kondensatorlinsensystem, der Objektivlinse und dem Energiefilter mit einem Elektronendetektor. Die vollständige Abfolge der Ausrichtungen ist in der Regel nicht erforderlich. Bei Bedarf wird der Benutzer über halbautomatische Verfahren mit einer korrekten Beschreibung jedes Schritts in einem kontextsensitiven Hilfefenster während des gesamten Ausrichtungsvorgangs in der Benutzeroberfläche des Mikroskops (Direct Alignments Control Panel) geführt. Sobald das Mikroskop vollständig ausgerichtet ist, bleibt die Elektronenoptik stabil und die Ausrichtung muss für mindestens einige Monate nicht geändert werden. Nur die empfindlichsten Ausrichtungen, wie parallele Beleuchtung der Probenebene, objektiver Astigmatismus und komafreie Ausrichtung, müssen kurz vor Beginn der Sammlung jedes Datensatzes verfeinert werden. Die Qualität der gesammelten Daten kann dann während der Datenerfassung mit verschiedenen Softwarepaketen wie EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live 20, Relion 21, Scipion 22, WARP 23 oder Appion 24 überwacht werden.
Neben der genauen Ausrichtung des Mikroskops ist auch die hohe Qualität gut gereinigter Proben mit minimaler Konformations- und Zusammensetzungsheterogenität eine Voraussetzung für die Sammlung hochauflösender Datensätze und die Lösung hochauflösender Strukturen. Weitere Details zu typischen Protokollen, häufigen Herausforderungen und möglichen Abhilfemaßnahmen finden Sie in anderen Rezensionen zu diesem Thema25,26,27. Im Wesentlichen ist es wichtig, Bereiche auf einem bestimmten Kryo-EM-Gitter zu finden, das ausreichend dünnes Eis hat, um hochauflösende Informationen zu erhalten, und einzelne Partikel sind dicht verteilt in zufälligen Orientierungen ohne Überlappungen. Typische Kryo-EM-Gitter haben jedoch eine ungleichmäßige Eisdicke, und es ist daher wichtig, die optimalen Bereiche für die Bildgebung zu finden und auszuwählen. Verschiedene Mittel zur Abschätzung der Eisdicke im Netz sind in Softwarepaketen für die automatisierte Erfassung von Kryo-EM-Datensätzen wie EPU 2, Leginon28 oder SerialEM29 verfügbar.
Das Aufkommen schneller und empfindlicher direkter Elektronendetektoren ermöglichte die Sammlung von Bildern in vielen Fraktionen als Filme, die die Kompensation strahleninduzierter Bewegungen ermöglichten und zu einer erheblichen Steigerung der Qualität und Quantität der in der Bildverarbeitung und der endgültigen 3D-Rekonstruktion verwendeten Datenführten 30. Gleichzeitig bieten Automatisierung und Datenerfassung mit hohem Durchsatz riesige Datensätze mit Tausenden von Bildern / Filmen, die Herausforderungen für die Datenspeicherung und den Datenzugriff darstellen. Das angenommene Modell mit großen Kryo-EM-Einrichtungen, die Dutzende bis Hunderte von Benutzern bedienen, erfordert insbesondere ein organisiertes Datenmanagement mit ordnungsgemäßer Nachverfolgung und Datenaustausch in etablierten Kryo-EM-Pipelines31,32.
Diese Studie beschreibt ein Protokoll für die routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit dem 200 kV Glacios TEM-Mikroskop. Notwendige Ausrichtungen der Mikroskopoptik werden zusammen mit Verfahren zur Auswertung von Kryo-EM-Proben und Auswahl geeigneter Bereiche für die hochauflösende Datenerfassung beschrieben. Die Organisation der gesammelten Daten und der zugehörigen Metadaten mit Beispielinformationen wird in Athena demonstriert – einer Datenmanagementplattform, die die Überprüfung von Probeninformationen und gesammelten Daten erleichtert. Mit der Maus-Apoferritin-Probe konnte eine 3D-Rekonstruktion bei 1,6 Å Auflösung13 erreicht werden. Mit dem beschriebenen Protokoll haben wir auch die 3D-Dichtekarte des 20S-Proteasoms aus Thermoplasma acidophilum mit einer Auflösung von 2,1 Å rekonstruiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll geht davon aus, dass sich die Optik des verwendeten TEM-Mikroskops in einem gut ausgerichteten Zustand befindet. Für das in diesem Protokoll verwendete 200-kV-TEM werden solche Säulenausrichtungen von einem erfahrenen Servicetechniker nach der Installation des Mikroskops oder einem wesentlichen Serviceeingriff durchgeführt, verifiziert und gespeichert. Diese Ausrichtungseinstellungen können jederzeit in der Mikroskop-Benutzeroberfläche abgerufen werden. Benutzer können die Direct Alignment-Verfahren in der Mikroskop-Benutzeroberfläche verwenden, um kritische Parameter erneut zu optimieren. Einige Ausrichtungen, wie z. B. Gun Tilt und Gun Shift, sind stabil und müssen von den Benutzern nicht täglich angepasst werden. Überprüfungen und Neuausrichtungen (falls erforderlich) der Pistolenneigung und -verschiebung durch den Mikroskop-Supervisor werden zweimal im Jahr empfohlen. Auf der anderen Seite sind einige Ausrichtungen kritisch und müssen vor jeder Datenerhebung ausgerichtet werden, wie im obigen Protokoll beschrieben (z. B. objektiver Astigmatismus und komafreie Ausrichtung). Wenn die Autocoma-Funktion in der Analysesoftware nicht konvergiert, sollte die Ausrichtung der Winkelpunkte der Strahlneigung und/oder des Drehzentrums überprüft und angepasst und die korrekte Zentrierung der C2-Blende bestätigt werden. Danach sollte die Autostigmate-Funktion ausgeführt werden, da objektive Stigmatatoren auch zur Komakorrektur verwendet werden. Diese Ausrichtungen sollten iteriert werden, bis sowohl Autostigmate als auch Autocomafunctions bei ihrer ersten Iteration erfolgreich sind. Bei Bedarf kann ein anderer Bereich ausgewählt werden (z. B. Carbonfolie ohne Eis unterstützen), die Bilddefokus angepasst oder die Bildaufnahmezeit erhöht werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis in aufgenommenen Bildern und die Sichtbarkeit mehrerer Thon-Ringe in der Fourier-Transformation der aufgenommenen Bilder zu optimieren.
Moderne Kryo-EM-Mikroskope erzeugen riesige Datenmengen, die oft 1 TB pro Datensatz überschreiten, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen, insbesondere für Proteine mit geringer Symmetrie. Kryo-EM-Daten und -Ergebnisse werden typischerweise auch durch Daten und Ergebnisse aus orthogonalen Methoden ergänzt, um die Struktur-Funktions-Beziehungen in jedem wissenschaftlichen Projekt vollständig zu verstehen. Die Organisation der gesammelten Daten, ihre Übertragung in eine Bildverarbeitungspipeline und die gemeinsame Nutzung einer resultierenden Kryo-EM-Rekonstruktion unter den Mitarbeitern stellen zusätzliche Anforderungen an neue Anwender der Kryo-EM-Methodik, um ihre lokale IT-Infrastruktur einzurichten. Datenverwaltungssoftware wie Athena erleichtert die zentrale Speicherung von Daten, die von einem angeschlossenen Gerät oder einer Software erfasst werden, die von einem registrierten Benutzer betrieben wird. Auf gespeicherte Daten und Metadaten können über eine einfache Webbrowser-Oberfläche mehrere Benutzer zugreifen, die unterschiedliche Rollen im Projekt mit unterschiedlichen Zugriffsrechten (entweder als Eigentümer, Mitarbeiter oder Zuschauer) basierend auf ihren Anmeldeinformationen und der Definition der Datenfreigabe im Testaufbau haben können. Diese Digitalisierung experimenteller Workflows bietet Möglichkeiten für den Daten- und Metadatenaustausch zwischen Mitarbeitern ohne unnötige Duplizierung und erhöht die Produktivität und Rückverfolgbarkeit der verwendeten Workflows. Die Implementierung einer allgemeinen und anpassbaren Struktur von Projekten, Experimenten und Workflows in Datenmanagement-Software ist universell und ermöglicht die Anpassung und Integration orthogonaler Experimente mit komplementären Methoden in eine einzige Projektdatenbank.
Die Auswahl der Bereiche für die Datenerhebung auf einem Kryo-EM-Grid ist entscheidend für die erfolgreiche Erfassung hochauflösender Datensätze. Kryo-EM-Gitter, die mit herkömmlichen Tauchgefriervorrichtungen wie dem Vitrobot (einem vollautomatischen Vitrifikationssystem) hergestellt werden, zeigen typischerweise einen Gradienten der Eisdicke über der Gitteroberfläche (Abbildung 4). Dies kann von Vorteil sein, da das Gitter Bereiche mit unterschiedlichen Eisdicken enthält; Bereiche mit der idealen Eisdicke für die Datenerhebung müssen jedoch wie im obigen Protokoll beschrieben identifiziert werden. Ein optimales Kryo-EM-Gitter sollte so wenig Transfereisverunreinigungen wie möglich enthalten und genügend Gitterquadrate mit intakter löchriger Stützfolie enthalten. Das Sammeln von Daten über Gitterquadrate, die Risse oder gebrochene Bereiche aufweisen, wird nicht empfohlen, da die gesammelten Bilder bei der Beleuchtung durch einen Elektronenstrahl im Vergleich zu den Gitterquadraten mit intakter Stützfolie durch eine deutlich stärkere Gesamtdrift beeinflusst werden. Ein Überschuss an kristallinem Eis kann die Mehrheit der Folienlöcher verschließen und / oder den Autofokus stören, und solche Gitterquadrate sollten ebenfalls vermieden werden. Gitterquadrate mit dünnem Eis weisen normalerweise große Glasflächen und viele helle Folienlöcher auf, die in einem mit der Atlas-Voreinstellung aufgenommenen Bild sichtbar sind. Das Auftreten von dickerem Eis in der Nähe von Gitterstäben ist zu erwarten und unkritisch, da Folienlöcher in diesen Bereichen des Gitterquadrats während des Lochauswahlverfahrens ausgeschlossen sind. Das Vorhandensein mehrerer leerer Löcher in einem Gitterquadrat kann bedeuten, dass Glaseis in den umgebenden Löchern extrem dünn ist und beschädigte Partikel oder gar keine Partikel enthalten kann. Im Allgemeinen ist es ratsam, Gitterquadrate mit einer Vielzahl von Eisdicken in verschiedenen Regionen des Gitters für die Erstabschirmung und -bewertung auszuwählen, um zu verstehen, welche Bereiche die besten Bedingungen für eine hochauflösende Datenerfassung haben und die ideale Partikeldichte und Orientierungsverteilung aufweisen. Für die in dieser Studie verwendeten apoF- und 20S-Proteasom-Proben enthalten Bereiche mit dem dünnsten beobachtbaren Eis die besten Bedingungen für eine hochauflösende Bildgebung dieser Proben.
Wenn Sie mit der Datenerfassungssoftware automatisch Bohrungen in allen ausgewählten Gitterquadraten auswählen, wird empfohlen, die Vorlagenausführungsaufgabe für eine repräsentative Bohrung in jedem Gitterquadrat auszuführen, um zu überprüfen und sicherzustellen, dass weder übermäßig dicke noch zu dünne oder unerwartet nicht glasige Quadrate für die Datenerfassung ausgewählt wurden. Während der Datenerfassung können wichtige Qualitätsindikatoren der gesammelten Bilder, wie Bilddrift und CTF-Anpassung, mit EQM überwacht werden. Die Datenerfassung kann dann optimiert werden, indem Bereiche übersprungen werden, die Bilder von schlechter Qualität liefern. Bilder mit hochauflösenden CTF-Anpassungen können jedoch immer noch Bilder mit Partikeln in einigen bevorzugten Ausrichtungen oder Partikeln, die in einer zu dünnen Eisschicht denaturiert sind, enthalten. Echtzeit-Partikelkommissionierung und 2D-Klassifizierung aus gesammelten Bildern würden zusätzliche Informationen über die Qualität der Strukturdaten in abgebildeten Partikeln liefern und sowohl bevorzugte Orientierungen intakter Partikel in Eis als auch inkonsistente Strukturen von (teilweise) denaturierten Partikeln aufdecken. Die Berechnung von Klassendurchschnitten kann daher dazu beitragen, geeignete Regionen für die Datenerhebung weiter zu verfeinern, wie dies bereits in anderen Softwarepaketen implementiert und gezeigt wurde23,28.
Die Auswahl der Bildgebungseinstellungen für die Datenerfassung, wie Vergrößerung, Elektronendosisleistung und Defokussierbereich, hängt von mehreren Kriterien ab, wie z.B. der Zielauflösung, der Größe des Proteins, der Probenkonzentration, dem gewünschten Mikroskopdurchsatz usw. Für die in diesen Experimenten verwendete direkte Elektronendetektorkamera wurde die Elektronendosisleistung im Bereich von 4-5 e-/pix/s gewählt, indem eine geeignete SPOT-Größe und –Intensität ausgewählt wurde, um eine parallele Beleuchtung aufrechtzuerhalten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, kann in der Voreinstellung Bohrung/Euzentrische Höhe eine andere SPOT-Größe verwendet werden, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis im Bild für die Zentrierung von Bohrungen während der Datenerfassung sicherzustellen. Die Vergrößerung sollte so gewählt werden, dass die Pixelgröße mindestens 2-3x kleiner ist als die Zielauflösung für die Kryo-EM-Rekonstruktion. Es wird jedoch die höhere Vergrößerung (d.h. kleinere Pixelgröße) verwendet, das kleinere Sichtfeld wird in Bildern erfasst und es gibt weniger Partikel pro Bild, was letztendlich zu einer längeren Datenerfassungszeit führt, um Bilder mit genügend Partikeln zu sammeln, um 3D-Karten mit einer hohen Auflösung zu rekonstruieren. Für die apoF-Probe verwendeten wir die Pixelgröße von 0,43 Å, da wir eine ausreichende Probenkonzentration für eine hohe Partikeldichte in Bildern hatten und eine Auflösung von Sub-2 Å der Rekonstruktion anstrebten. Für das 20S-Proteasom-Sample haben wir die Pixelgröße von 0,68 Å verwendet, um ein größeres Sichtfeld in aufgenommenen Bildern abzudecken. Typischerweise werden für 200-kV-TEM-Mikroskope Kryo-EM-Bilder im Defokusbereich von 0,8 bis 2,0 μm aufgenommen. Mit dem verbesserten Kontrast- und Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung des Energiefilters können Datenaufnahmen jedoch viel näher am Fokus durchgeführt werden, um hochauflösende Informationen in aufgenommenen Bildern aufgrund kleinerer Aberrationen und entsprechend reduziertem Zerfall der CTF-Hüllkurvenfunktion besser zu erhalten. Wir verwenden auch keine objektive Blende, da die Blende zusätzliche Bildaberrationen verursachen kann, während der Bildkontrast durch die Verwendung des Energiefilters bereits ausreichend verbessert wird. Für die apoF- und 20S-Proteasom-Proben verwendeten wir die Defokus-Einstellungen von 0,5 μm, 0,7 μm und 0,9 μm. Für kleinere Proteine (<200 kDa) verwendeten wir Defokussierungseinstellungen von -0,5 μm, -0,7 μm und -0,9 μm, um den Kontrast von Partikeln zu verbessern und eine einfachere Partikelkommissionierung und anfängliche grobe Ausrichtung im 3D-Verfeinerungsschritt der 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen, was zu 3D-Karten mit einer Auflösung von ~ 2,5 Å führte (unveröffentlichte Ergebnisse).
Wir haben bereits gezeigt, dass die Bildgebung mit einem Energiefilter das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in Kryo-EM-Bildern verbessert, die mit den High-End-300-kV-TEM-Mikroskopen11 gesammelt wurden. In der Tat, wenn Elektronen durch eine Probe gehen, treten zwei Hauptarten von Wechselwirkungen auf: i) Elastisch gestreute Elektronen behalten ihre Energie bei und tragen zur Bildbildung bei, indem sie den nicht gestreuten einfallenden Strahl über den Phasenkontrastmechanismus stören ii) inelastisch gestreute Elektronen verlieren etwas Energie in der Probe und tragen hauptsächlich zum Rauschen in Bildern bei. Daher kann SNR deutlich verbessert werden, indem die inelastisch gestreuten Elektronen, die eine geringere Energie als der einfallende Strahl und elastisch gestreute Elektronen haben, mit einem schmalen Energiespalt gefiltert werden. Es ist jedoch wichtig, einen ausreichend stabilen Energiefilter wie den Selectris oder Selectris-X zu verwenden, um sehr schmale (10 eV oder kleinere) Schlitze über lange (12+ Stunden) automatisierte Datenerfassung von hochauflösenden KryoEM-Datensätzen verwenden zu können.
Kryo-EM-Bilder, die mit 200-kV-TEM-Mikroskopen unter den gleichen Bedingungen wie mit 300-kV-TEM-Mikroskopen aufgenommen wurden, zeigen aufgrund des schnelleren Abfalls der CTF-Hüllkurvenfunktionen ein kleineres SNR bei hoher Auflösung (insbesondere <4 Å). Folglich ist eine höhere Anzahl von Partikeln (und damit eine höhere Anzahl gesammelter Bilder) erforderlich, um bei Verwendung von 200-kV-TEMs eine bestimmte Auflösung zu erreichen. Darüber hinaus ist die Schärfentiefe (10-25 nm im Auflösungsbereich von 2-3 Å) in 200-kV-Bildern35 auch etwa 20% kleiner, was bedeutet, dass weniger Partikel in der Eisschicht (typischerweise 20-50 nm dick) vollständig im Fokus sind und konstruktiv zu allen hochauflösenden Merkmalen einer berechneten 3D-Rekonstruktion beitragen, es sei denn, die Defokussierungswerte werden für jedes Partikel unabhängig voneinander in den späteren Phasen des 3D-Rekonstruktionsverfahrens verfeinert. Bei größeren Partikeln (wie ikosaedrischen Virionen oder anderen makromolekularen Anordnungen) kann die Partikelgröße die Schärfentiefe bei hohen Auflösungen überschreiten und Phasenfehler aufgrund der planaren Annäherung der Ewald-Kugel in den Standard-3D-Rekonstruktionsalgorithmen36 verursachen. Diese Fehler können durch fortschrittliche Algorithmen verfeinert werden, die bereits in gängigen Kryo-EM-Bildverarbeitungspaketen37,28,39 implementiert sind. Da die Ewald-Kugel bei 200-kV-Daten eine größere Krümmung aufweist als bei 300-kV-Daten, ist die Ewald-Kugelkorrektur bei relativ niedrigeren Auflösungen und/oder für relativ kleinere makromolekulare Anordnungen bei Verwendung von 200-kV-TEMs erforderlich. Auf der anderen Seite zeigen 200-kV-Bilder einen höheren Kontrast von Partikeln in dünnem Eis (20-50 nm), der deutlich dünner ist als der mittlere freie Weg von 200-300 keV Elektronen (220-280 nm). Der höhere Kontrast hilft, die korrekte globale Ausrichtung einzelner Partikel zu verbessern, insbesondere bei schwach streuenden kleineren Proteinen, deren Struktur noch nicht bekannt ist, und das 3D-Referenzmodell ist noch nicht gut etabliert.
Hier haben wir am Beispiel eines 20S-Proteasoms gezeigt, dass Bildkontrast und -qualität mit einem Energiefilter bei Verwendung eines 200-kV-TEM-Mikroskops ähnlich verbessert werden können. Unter Verwendung der gleichen Anzahl von Partikeln wurden die mit dem 20-eV-Spalt gesammelten Daten auf eine Auflösung von 2,26 Å rekonstruiert, verglichen mit Daten, die mit dem vollständig geöffneten Energiespalt gesammelt wurden, der nur mit einer Auflösung von 2,34 Å rekonstruiert wurde. Die beste Rekonstruktion wurde aus Daten erzielt, die mit dem 10-eV-Spalt gesammelt wurden, der auf eine Auflösung von 2,14 Å rekonstruiert wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit der theoretischen Vorhersage überein, dass die Filterung der inelastisch gestreuten Elektronen das SNR in gesammelten Bildern erhöht und eine höhere Auflösung bei Kryo-EM-Rekonstruktionen aus der gegebenen Anzahl von Teilchen ermöglicht, wie in Tabelle 4 zusammengefasst. Diese Ergebnisse wurden durch die aus diesen Datensätzen berechneten B-Faktoren bestätigt, die auf eine höhere Qualität der Bilder in den energiegefilterten Datensätzen hinweisen.
Wir können daher zu dem Schluss kommen, dass 300-kV-TEM-Mikroskope den höchsten Durchsatz und die höchstmögliche Auflösung bei Kryo-EM-Rekonstruktionen liefern, während die 200-kV-TEM-Mikroskope auch qualitativ hochwertige Datensätze für hochauflösende Kryo-EM-Rekonstruktionen liefern. Wir haben hier gezeigt, dass die Qualität der aufgenommenen Bilder und damit die Gesamtzeit bis zur Struktur durch den Einsatz des 200-kV-TEM, das mit einem Energiefilter und einem direkten Elektronendetektor ausgestattet ist, weiter verbessert werden kann. Das vorgestellte Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, wie mit diesem Setup routinemäßig hochauflösende Kryo-EM-Daten erhalten werden können, und enthüllt feine strukturelle Details makromolekularer 3D-Strukturen, die für das Verständnis der wichtigsten Struktur-Funktions-Beziehungen in der Strukturbiologie und im strukturbasierten Arzneimitteldesign unerlässlich sind.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
| Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
| EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
| EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
| Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
| Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
| Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
| GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
| QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
| Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
| Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
| Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
| UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
| Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
| Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |
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