JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63519
, , , , , , , , ,
1Materials and Structural Analysis Division,Thermo Fisher Scientific, 2Max Planck Institute of Biochemistry, Molecular Structural Biology, 3Materials and Structural Analysis Division,Thermo Fisher Scientific

Summary

يمكن أيضا تحقيق خرائط cryo-EM عالية الدقة للجزيئات الكبيرة باستخدام مجاهر TEM 200 kV. يعرض هذا البروتوكول أفضل الممارسات لوضع محاذاة بصريات دقيقة ، ومخططات الحصول على البيانات ، واختيار مناطق التصوير التي تعد جميعها ضرورية للجمع الناجح لمجموعات البيانات عالية الدقة باستخدام TEM 200 كيلو فولت.

Abstract

تم إنشاء المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) كطريقة روتينية لتحديد بنية البروتين خلال العقد الماضي ، مع أخذ حصة متزايدة باستمرار من البيانات الهيكلية المنشورة. أدت التطورات الحديثة في تكنولوجيا TEM والأتمتة إلى تعزيز كل من سرعة جمع البيانات وجودة الصور التي تم الحصول عليها مع تقليل المستوى المطلوب من الخبرة للحصول على خرائط cryo-EM بدقة sub-3 Å. في حين تم الحصول على معظم هذه الهياكل عالية الدقة باستخدام أحدث أنظمة التبريد 300 كيلو فولت ، يمكن أيضا الحصول على هياكل عالية الدقة باستخدام أنظمة التبريد TEM 200 كيلو فولت ، خاصة عندما تكون مجهزة بمرشح طاقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن أتمتة محاذاة المجهر وجمع البيانات مع تقييم جودة الصورة في الوقت الفعلي تقلل من تعقيد النظام وتضمن إعدادات المجهر المثلى، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية الصور عالية الجودة والإنتاجية الإجمالية لجمع البيانات. يوضح هذا البروتوكول تنفيذ التطورات التكنولوجية الحديثة وميزات الأتمتة على مجهر إلكتروني لنقل التبريد بجهد 200 كيلو فولت ويوضح كيفية جمع البيانات لإعادة بناء الخرائط ثلاثية الأبعاد التي تكفي لبناء نموذج ذري جديد . نحن نركز على أفضل الممارسات والمتغيرات الحرجة والقضايا الشائعة التي يجب مراعاتها لتمكين الجمع الروتيني لمجموعات بيانات cryo-EM عالية الدقة. يتم استعراض الموضوعات الأساسية التالية بالتفصيل على وجه الخصوص: i) أتمتة محاذاة المجهر ، ii) اختيار المناطق المناسبة للحصول على البيانات ، iii) المعلمات البصرية المثلى لجمع البيانات عالية الجودة وعالية الإنتاجية ، iv) ضبط مرشح الطاقة للتصوير بدون خسارة ، و v) إدارة البيانات وتقييم الجودة. سيتم عرض تطبيق أفضل الممارسات وتحسين الدقة القابلة للتحقيق باستخدام مرشح الطاقة على مثال apo-ferritin الذي أعيد بناؤه إلى 1.6 Å ، و Thermoplasma acidophilum 20S proteasome المعاد بناؤه إلى دقة 2.1-Å باستخدام TEM 200 kV المجهز بمرشح طاقة وكاشف إلكترون مباشر.

Introduction

يعد تحديد بنية البروتين أمرا بالغ الأهمية لفهم البنية الجزيئية والوظيفة وتنظيم مجمعات البروتين المشاركة في العمليات الخلوية الرئيسية ، مثل استقلاب الخلايا أو نقل الإشارة أو التفاعلات بين المضيف والممرض. برز المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) كتقنية قوية قادرة على حل بنية 3D للعديد من البروتينات ومجمعاتها التي كانت صعبة للغاية بالنسبة للتقنيات الهيكلية التقليدية ، مثل حيود الأشعة السينية والتحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي. على وجه الخصوص ، تم إثبات cryo-EM كطريقة مفضلة لبروتينات الغشاء ، والتي لا يمكن تبلورها بسهولة أو إعدادها بكميات كافية للتقنيات الهيكلية التقليدية ، وقدمت رؤى جديدة في بنية ووظيفة المستقبلات الخلوية الهامة والقنوات الأيونية1،2،3،4،5 . وفي الآونة الأخيرة، لعب نظام cryo-EM دورا مهما في مكافحة جائحة كوفيد-19 من خلال تحديد آلية عدوى SARS-CoV-2 على المستوى الجزيئي، والتي أوضحت أصول مرض كوفيد-19 ووفرت الأساس للتطوير السريع للقاحات والعلاجات الفعالة6،7،8،9،10.

عادة ما يتم استخدام المجاهر الإلكترونية الناقلة المتطورة 300 كيلو فولت (TEM) لتحديد بنية عالية الدقة للجزيئات الحيوية عن طريق تحليل الجسيمات المفردة بالتبريد EM (SPA) للكشف عن تشكيلها وتفاعلاتها. في الآونة الأخيرة ، وصلت تقنية SPA إلى حدود جديدة عندما أعيد بناء عينة التبريد EM القياسية الشائعة apo-ferritin بدقة ذرية (1.2 Å) 11,12 باستخدام TEM 300-kV المجهز بمسدس انبعاث المجال البارد (E-CFEG) ، وكاشف إلكترون مباشر ، ومرشح طاقة. في هذا القرار ، كان من الممكن حل مواقع الذرات الفردية في الهيكل بشكل لا لبس فيه ، وتشكيل سلاسل جانبية فردية من الأحماض الأمينية ، وكذلك الترابط الهيدروجيني والتفاعلات الأخرى ، والتي تفتح إمكانيات جديدة لاكتشاف الأدوية القائمة على الهيكل لأهداف جديدة وتحسين الأدوية المرشحة الحالية.

غالبا ما تستخدم مجاهر TEM متوسطة المدى 200 كيلو فولت لفحص العينات وتحسين العينات قبل جمع البيانات النهائية عالية الدقة باستخدام مجاهر TEM المتطورة ، خاصة في مرافق التبريد EM الأكبر. عادة ، يمكن حل العينات المصورة في نطاق الدقة 3-4 Å الكافي للانتقال إلى TEM متطور 300 كيلو فولت لجمع البيانات النهائية. وبالتالي ، فإن جمع البيانات باستخدام TEM 200 كيلو فولت غالبا ما لا يتم تحسينه بشكل أكبر للحصول على أعلى نتائج دقة ممكنة. علاوة على ذلك ، يمكن بالفعل الإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية المثيرة للاهتمام ونشرها في هذه القرارات حيث تم بالفعل حل جميع سلاسل الأحماض الأمينية الجانبية ، ويمكن أيضا تحديد شغل مواقع ربط الليغاند بشكل موثوق13. وقد تبين بالفعل أن TEMs 200-kV يمكن أن تصل إلى دقة تتجاوز 3 Å للعديد من العينات14،15،16،17،18. تظهر الصور الملتقطة عند 200 كيلو فولت تباينا أعلى بطبيعته للجسيمات المصورة، مما قد يسهل حتى المحاذاة الأولية الأكثر دقة للجسيمات على الرغم من الإشارة الأكثر ضعفا بدقة عالية مقارنة بصور TEM 300 كيلو فولت. ومن المهم ملاحظة أن الدقة المحققة لخرائط التبريد EM المعاد بناؤها محدودة أيضا بالمرونة الهيكلية وعدم التجانس التوافقي للعينات المصورة، مما يؤثر على كل من عمليات إعادة الإعمار بجهد 200 كيلوفولت و300 كيلوفولت. في الواقع ، تم حل المزيد من عمليات إعادة بناء cryo-EM التي تم الحصول عليها باستخدام أنظمة 300-kV في نطاق الدقة 3-4 Å مقارنة بالدقة الأعلى19. نظرا لأن مجاهر TEM 200 kV أقل تعقيدا وتتناسب مع غرف أصغر ، فإن هذه المجاهر تمثل خيارا جيدا وأقل تكلفة لتحديد بنية الجزيئات البيولوجية الكبيرة بواسطة cryo-EM مع الحفاظ على أتمتة مجموعات البيانات الطويلة من عينات متعددة مخزنة داخل نظام Autoloader المجهري.

يتطلب جمع مجموعات بيانات cryo-EM لتحديد البنية عالية الدقة محاذاة دقيقة لبصريات المجهر. تنتقل محاذاة الأعمدة بشكل منهجي من مصدر الإلكترون وصولا إلى نظام عدسة المكثف والعدسة الموضوعية ومرشح الطاقة باستخدام كاشف الإلكترون. التسلسل الكامل للمحاذاة ليس مطلوبا عادة. عند الحاجة، يتم توجيه المستخدم عبر إجراءات شبه آلية مع وصف مناسب لكل خطوة في نافذة مساعدة واعية بالسياق طوال إجراء المحاذاة في واجهة مستخدم المجهر (لوحة تحكم المحاذاة المباشرة). بمجرد محاذاة المجهر بالكامل ، تظل البصريات الإلكترونية مستقرة ، ولا تحتاج المحاذاة إلى تغيير لبضعة أشهر على الأقل. يجب فقط تنقيح المحاذاة الأكثر حساسية، مثل الإضاءة المتوازية لمستوى العينة، والاستجماتيزم الموضوعي، والمحاذاة الخالية من الغيبوبة، قبل البدء في جمع كل مجموعة بيانات. يمكن بعد ذلك مراقبة جودة البيانات التي تم جمعها أثناء جمع البيانات باستخدام حزم برامج مختلفة ، مثل EPU Quality Monitor أو cryoSPARC Live 20 أو Relion 21 أو Scipion 22 أو WARP 23 أو Appion 24.

إلى جانب المحاذاة الدقيقة للمجهر ، فإن الجودة العالية للعينات النقية جيدا مع الحد الأدنى من عدم التجانس التوافقي والتركيبي هي أيضا شرط أساسي لجمع مجموعات البيانات عالية الدقة وحل الهياكل عالية الدقة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول البروتوكولات النموذجية والتحديات المتكررة والعلاجات المحتملة في مراجعات أخرى مخصصة لهذا الموضوع 25،26،27. في الأساس ، من الأهمية بمكان العثور على مناطق على شبكة cryo-EM معينة تحتوي على جليد رقيق بما فيه الكفاية للحفاظ على معلومات عالية الدقة ، ويتم توزيع الجسيمات الفردية بكثافة في اتجاهات عشوائية دون تداخلات. ومع ذلك ، فإن شبكات cryo-EM النموذجية لها سمك جليد غير موحد ، وبالتالي من المهم العثور على المناطق المثلى للتصوير واختيارها. تتوفر وسائل مختلفة لتقدير سمك الجليد على الشبكة في حزم البرامج المخصصة للجمع الآلي لمجموعات بيانات cryo-EM ، مثل EPU 2 أو Leginon28 أو SerialEM29.

مكن ظهور كاشفات الإلكترونات المباشرة السريعة والحساسة من جمع الصور في العديد من الكسور كأفلام مكنت من تعويض الحركات التي يسببها الحزم وأدت إلى زيادة كبيرة في جودة وكمية البيانات المستخدمة في معالجة الصور وإعادة الإعمار النهائي ثلاثي الأبعاد30. وفي الوقت نفسه، توفر الأتمتة وجمع البيانات عالية الإنتاجية مجموعات بيانات ضخمة مع آلاف الصور/الأفلام التي تمثل تحديات لتخزين البيانات والوصول إليها. النموذج المعتمد مع مرافق cryo-EM الكبيرة التي تخدم عشرات إلى مئات المستخدمين يدعو بشكل خاص إلى إدارة البيانات المنظمة مع التتبع السليم ومشاركة البيانات في خطوط أنابيب cryo-EM المنشأة31,32.

تصف هذه الدراسة بروتوكولا للجمع الروتيني لمجموعات بيانات cryo-EM عالية الدقة باستخدام مجهر Glacios TEM 200 كيلو فولت. يتم وصف المحاذاة اللازمة لبصريات المجهر جنبا إلى جنب مع إجراءات تقييم عينات cryo-EM واختيار المناطق المناسبة لجمع البيانات عالية الدقة. يتم عرض تنظيم البيانات التي تم جمعها والبيانات الوصفية ذات الصلة مع معلومات العينة في أثينا – وهي منصة لإدارة البيانات تسهل مراجعة معلومات العينة والبيانات التي تم جمعها. باستخدام عينة الماوس apo-ferritin ، كان من الممكن تحقيق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد بدقة 1.6 Å13. باستخدام البروتوكول الموصوف ، قمنا أيضا بإعادة بناء خريطة الكثافة ثلاثية الأبعاد للبروتيازوم 20S من Thermoplasma acidophilum بدقة 2.1 Å.

Protocol

يتم وصف جميع خطوات البروتوكول لنظام Glacios TEM 200 kV (المشار إليه فيما يلي باسم 200 kV TEM) المجهز بمرشح الطاقة Selectris-X (المشار إليه فيما يلي باسم مرشح الطاقة) وكاشف Falcon 4 (المشار إليه فيما يلي باسم كاشف الإلكترون المباشر). خطوات البروتوكول محددة لتطبيق EPU ، وهو برنامج جمع بيانات SPA الافتراضي المثبت مسبقا على كل نظام Glacios. تتوافق خطوات البروتوكول أدناه مع الإصدار 2.14 من EPU ومن المتوقع إجراء تعديلات صغيرة عند استخدام إصدار EPU مختلف. المتطلبات الأساسية لهذا البروتوكول هي: i) محاذاة البندقية والأعمدة بشكل جيد ، ii) معايرات EM صحيحة و iii) يتم معايرة الوظائف التلقائية EPU بشكل صحيح. 1. تحميل الشبكات في المجهر ملاحظة: يمكن ل TEM 200 kV المستخدم في هذه التجربة أن يحمل ما يصل إلى 12 شبكة أوتوماتيكية (أي شبكات TEM تقليدية مقطوعة في خرطوشة خاصة) داخل كاسيت يتم تحميله داخل المحمل التلقائي للمجهر ويتم الاحتفاظ به باستمرار في درجات حرارة أقل من -170 درجة مئوية لمنع انحراف العينة. أدخل autogrids في كاسيت Autoloader تحت ظروف النيتروجين السائل. أدخل الكاسيت مع autogrids في كبسولة نقل مبردة بالنيتروجين السائل. أدخل الكبسولة في المجهر وانقر على زر Dock في واجهة مستخدم المجهر لتحميل الكاسيت من الكبسولة إلى المحمل التلقائي للمجهر. انقر فوق الزر ” المخزون” للتحقق من وجود autogrids في الكاسيت المحمل. انقر فوق الزرين تحميل وإلغاء تحميل لإدراج autogrids في العمود لتصوير TEM. 2. إعداد مشروع في منصة لإدارة البيانات (اختياري) ملاحظة: يمكن تنظيم عينة المعلومات والبيانات المجمعة في النظام الأساسي لإدارة البيانات المقدم الذي يسمح بتخزين البيانات المنظمة لجميع الأدوات المتصلة. يمكن إنشاء مشروع يمكن من خلاله تحديد أي خطوات سير عمل لالتقاط الصور والبيانات الوصفية بطريقة منظمة للمراجعة والتصدير. ابدأ تشغيل تطبيق بوابة إدارة البيانات وقم بتسجيل الدخول باستخدام اسم مستخدم وكلمة مرور. في اللوحة اليمنى من واجهة مستخدم البوابة الإلكترونية، انقر فوق الزر إضافة مشروع لإنشاء مشروع جديد أو انقر فوق زر لمشروع موجود في القائمة أدناه لفتح مشروع . انقر فوق الزر إضافة تجربة لإنشاء تجربة جديدة داخل المشروع المفتوح. املأ الوصف في لوحة البيانات الأولية للتجربة الجديدة وانقر على زر إضافة سير عمل لإنشاء سير عمل جديد داخل التجربة (على سبيل المثال، تحليل جسيمات واحدة). اختياريا، انقر فوق الزر “إضافة خطوة” في اللوحة الوسطى لإنشاء سير عمل مخصص أو إضافة خطوات إضافية إلى سير عمل SPA المحدد مسبقا (الشكل 1 والشكل 2).ملاحظة: قد تمثل الخطوات إعداد العينة، وتوصيف العينة بواسطة تقنيات الكيمياء الحيوية، وتزجيج العينات، وفحص شبكات التبريد EM، وجلسات جمع البيانات، وتحليل البيانات. اختياريا، املأ الأوصاف في الملاحظات الخاصة بكل خطوة، والتي قد تتضمن صورا وصورا. قم بإنشاء خطوة مجموعة بيانات في سير العمل وحدد نوع مجموعة البيانات ك EPU.ملاحظة: سيسمح ذلك لبرنامج التحليل بوضع جميع بيانات النتائج / البيانات الوصفية في المكان الصحيح في بوابة إدارة البيانات تلقائيا أثناء الحصول على البيانات وتصدير البيانات تلقائيا إلى الوجهة المفضلة مع الاحتفاظ بسجل كامل لجميع الخطوات ونقل البيانات. املأ قوالب حول شبكتي العينة وEM في خطوة الكيمياء الحيوية وقم بإقران كل شبكة بعينة (لاحظ أنه يمكن إقران عينة واحدة بشبكات متعددة). قم بإقران مجموعات شبكات العينات في قسم بيانات التعريف من الخطوة مجموعة البيانات . 3. إعداد الإعدادات المسبقة للتصوير ومعايرة إزاحة الصورة في برنامج التحليل قم بتعيين معلمات التصوير لأوضاع التصوير الفردية كما هو موضح في الجدول 1. يتم وصف اعتبارات اختيار إعدادات معينة بالتفصيل في قسم المناقشة. تعيين إضاءة متوازية للتكبير المختار في الإعداد المسبق للحصول على البيانات لبرنامج التحليلملاحظة: لا يوجد سوى إعداد واحد لعدسة C2 للإضاءة المتوازية للعينة بحجم SPOT المحدد (أي نقاط القوة المحددة مسبقا لعدسة C1) على أنظمة TEM ذات المكثفين ، مثل TEM 200 kV المستخدم في هذه الدراسة. وبالتالي لا يمكن تعديل معدل جرعة الإلكترون لكل وحدة مساحة (e-/Å2/s) إلا عن طريق تغيير إعدادات حجم SPOT وإعادة ضبط قوة C2 (شدة الشعاع) وفقا للخطوات أدناه. انتقل إلى منطقة بها رقائق كربون داعمة وجليد رقيق أو معدوم. حدد فتحة العدسة الموضوعية 100 ميكرومتر أو 70 ميكرومتر في قائمة فتحة العدسة في واجهة مستخدم TEM. اضغط على زر الحيود الموجود على لوحات التحكم للتبديل إلى وضع الحيود . أدخل شاشة الفلورسنت وقم بتغيير وضع FluCam إلى دقة عالية. حرك بقعة الحيود المركزية إلى حافة فتحة العدسة. إذا كانت حافة الفتحة غير مرئية، فقم بزيادة طول الكاميرا (باستخدام مقبض التكبير). أدر مقبض التركيز البؤري بعناية على لوحة التحكم لتركيز المستوى البؤري الخلفي. يتم تركيز المستوى البؤري الخلفي عندما تكون حافة الفتحة حادة بشكل واضح. قلل حساسية FluCam إلى أدنى مستوى وانقل بقعة الحيود المركزية إلى وسط FluCam. قم بتصغير حجم البقعة المركزية باستخدام مقبض الكثافة الموجود على لوحة التحكم. اسحب فتحة العدسة الموضوعية في واجهة مستخدم TEM وقم بالتبديل مرة أخرى إلى وضع التصوير. انقر فوق الزر ” الحصول على” في برنامج التحليل لحفظ الإعدادات في الإعداد المسبق للحصول على البيانات. اضبط معدل جرعة الإلكترون في الإعداد المسبق للحصول على البيانات الأمثل للكاشف المستخدم: الانتقال إلى منطقة فارغة على الشبكة (على سبيل المثال، مربع شبكة به رقائق كربون مكسورة) انقر على زر قياس الجرعة في برنامج التحليل لقياس معدل جرعة الإلكترون. قم بتغيير حجم SPOT لتحقيق معدل الجرعة الأمثل. في حالة كاشف الإلكترون المباشر المستخدم في هذا البروتوكول ، عادة ما يستخدم معدل جرعة يتراوح بين 4-5 e-/pixel/s للحصول على بيانات عالية الدقة. يتوافق هذا عادة مع حجم SPOT 4-6. تحقق من الإضاءة المتوازية واضبطها في إعداد حجم SPOT الجديد كما هو موضح أعلاه. حدد خيار EER ضمن الكسور لاستخدام وضع EER على كاشف الإلكترون المباشر33. انقر فوق الزر ” الحصول على” في برنامج التحليل لحفظ الإعدادات في الإعداد المسبق للحصول على البيانات. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للتركيز البؤري التلقائي واضغط على الزر Get (الحصول على) لحفظ إعدادات الإضاءة للتركيز البؤري. قم بتغيير وقت التعرض يدويا إلى 1 ثانية ووضع التثبيت 2. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق لحلقات Thon واضغط على الزر Get ( Get ) لحفظ إعدادات الإضاءة لهذا الإعداد المسبق. قم بتغيير وقت التعرض يدويا إلى 1-2 ثانية ووضع التثبيت 2. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق Zero Loss واضغط على الزر Get ( Get ) لحفظ إعدادات الإضاءة لهذا الإعداد المسبق. قم بتغيير وقت التعرض يدويا إلى 0.5 ثانية ووضع التثبيت 4. معايرة إزاحات الصورة بين الإعدادات البصرية المحددة كما هو موضح في دليل برنامج التحليل باستخدام مهمة معايرة إزاحة الصورة في علامة التبويب إعداد (الشكل التكميلي 1). الجدول 1: إعدادات التصوير النموذجية للحصول على بيانات عالية الدقة باستخدام وحدة تبريد TEM بقوة 200 كيلوفولت مزودة بمرشح طاقة وكاشف إلكترون مباشر. يتم عرض الإعدادات لكل إعداد مسبق بصري يستخدم في إعداد جمع البيانات الآلي (القسم 3 من البروتوكول). هذه الإعدادات خاصة بمجهر TEM 200 كيلو فولت وكاشف الإلكترون المباشر المستخدم في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. 4. رسم خرائط الشبكة واختيار أفضل شبكات التبريد EM لجمع البيانات حدد علامة التبويب أطلس وانقر على زر جلسة جديدة لفتح جلسة جديدة . املأ التفاصيل مثل اسم الجلسة وموقع تخزين البيانات وانقر فوق الزر تطبيق لفتح نافذة مهمة فحص جديدة ، والتي تعرض قائمة بجميع الشبكات في مخزون Autoloader. اختياريا، قم بتحرير أسماء الشبكات. حدد الشبكات ذات الأهمية عن طريق تحديد خانة اختيار بجوار رقم الشبكة المقابل. انقر فوق الزر ابدأ لبدء مجموعة مؤتمتة بالكامل من أطالس جميع الشبكات المحددة. عند اكتمال المجموعة ، انقر فوق ملصقات الشبكة لمراجعة الأطالس المكتسبة.ملاحظة: تصنف مربعات الشبكة الفردية وفقا لسمك الجليد النسبي الخاص بها، والذي يستند إلى تقييم قيمة التدرج الرمادي النسبي في كل أطلس. يتم تصوير مربعات الشبكة المصنفة في أنظمة ألوان مختلفة يمكن استخدامها لتوجيه اختيار مناطق الحصول على البيانات. عادة ما تعرض الشبكة المنتجة باستخدام Vitrobot Mk IV تدرج سمك الجليد على الشبكة بأكملها ، مما قد يساعد في تحديد سمك الجليد المثالي لجمع البيانات. يجب أن تحتوي الشبكة المثلى على أقل قدر ممكن من تلوث الجليد الناقل وأن تظهر ما يكفي من مربعات الشبكة غير المنقطعة والخالية من الشقوق (الشكل 3). يمكن إجراء مزيد من التحقيق في الشبكات ذات التوزيع المناسب للجليد لتقييم توزيع الجسيمات في الجليد عند التكبير العالي (أي كثافة واتجاهات الجسيمات الفردية). انقر فوق الزر تحميل عينة في القائمة العلوية لإدراج شبكة مختارة مع توزيع الجليد المناسب في عمود المجهر. حدد علامة التبويب أطلس، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع شبكة مناسب في صورة الأطلس وحدد الخيار نقل المرحلة هنا من القائمة المنسدلة لنقل المرحلة إلى مربع الشبكة. حدد علامة التبويب وظائف تلقائية لتعيين مربع الشبكة إلى ارتفاع Eucentric. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق لارتفاع Eucentric ، وانقر فوق الوظيفة التلقائية ل Eucentric by Beam Tilt في منتصف مربع الشبكة المختار وانقر فوق الزر “ابدأ “. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق ل Grid Square واحصل على صورة. انقل المرحلة إلى حفرة بها جليد ولا يوجد تلوث أو الحد الأدنى منها بالنقر بزر الماوس الأيمن وخيار نقل المرحلة هنا . قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق لارتفاع الثقب/Eucentric والحصول على صورة. انقل المرحلة إلى منطقة كربون بجوار ثقب الاهتمام بنقرة بزر الماوس الأيمن وخيار نقل المرحلة هنا. انقر فوق وظيفة التركيز التلقائي وقم بتعيين قيم لإلغاء التركيز البؤري المطلوب إلى 0 ميكرومتر والتكرار إلى -2 ميكرومتر. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للتركيز البؤري التلقائي وانقر فوق الزر ابدأ . حدد علامة التبويب إعداد مرة أخرى وقم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للارتفاع الثقبي/Eucentric . في صورة الثقب التي تم الحصول عليها مسبقا، حدد منطقة اهتمام داخل الثقب وانقل المرحلة إلى هذا الموضع بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد خيار نقل المرحلة هنا . قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للحصول على البيانات واضبط وقت الانتظار بعد إزاحة الشعاع على 0.5 ثانية ووقت الانتظار بعد المرحلة على 20 ثانية. احصل على صورة باستخدام إلغاء التركيز البؤري بين -3 ميكرومتر و-5 ميكرومتر لتعزيز التباين منخفض الدقة للحصول على تصور أفضل للجسيمات الفردية. اختياريا، كرر الخطوات من 4.7 إلى 4.13 لتصوير الجسيمات في ثقوب مختلفة ومربعات شبكة مختلفة بسماكات جليد مختلفة حسب الحاجة. بمجرد تحديد الشبكة الأكثر ملاءمة لجمع البيانات عالية الدقة وتحديدها، انقر فوق الزر تحميل عينة في القائمة العلوية لتحميل الشبكة المحددة في TEM.ملاحظة: بدلا من ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من المعلومات و/أو إذا كانت هناك حاجة إلى أتمتة عملية الفحص هذه، فقم بإجراء القسم 5. 5. إعداد جلسة جمع البيانات في برنامج تحليل الجسيمات المفردة ملاحظة: في حالة استخدام شبكات رقائق الذهب ، قد لا يعمل تحسين الاستجماتيزم الموضوعي ومحاذاة الغيبوبة (القسم 6) بشكل موثوق. ينصح بتحميل شبكة رقائق الكربون أو شبكة EM المتقاطعة وإجراء هذه المحاذاة النهائية قبل إعداد جمع البيانات. حدد علامة التبويب EPU وانقر على زر إنشاء الجلسة لإنشاء جلسة جديدة في اللوحة اليمنى. حدد خيار جلسة عمل جديدة لاستخدام الإعدادات المسبقة البصرية الحالية أو خيار جديد من تفضيلات لتحميل إعداد الجلسة الذي تم تصديره مسبقا. املأ اسم الجلسة وموقع تخزين البيانات.ملاحظة: سيتم استخدام هذا الموقع لحفظ الصور المتكاملة وبيانات التعريف من جلسة عمل جمع البيانات في مجلد فرعي باسم جلسة العمل. على الرغم من أن هذه البيانات لن تشغل مساحة تخزين كبيرة ، فمن المستحسن حفظ هذه البيانات على تخزين بيانات إلغاء تحميل Falcon لخادم DMP حيث يتم تخزين إطارات كاميرا EER دائما في الدليل الجذر لتخزين البيانات هذا في دليل باسم الجلسة. حدد النوع اليدوي لجلسة العمل للتحكم في تحديد الثقوب الفردية في مربعات الشبكة المحددة لجمع البيانات لاحقا في البروتوكول. حدد وضع الاكتساب الأسرع لاستخدام نقل الصور الخالي من الانحراف (AFIS) لجمع البيانات لتقليل حركات المرحلة بين الثقوب الفردية، وتقليل الانجراف الكلي للعينة، وزيادة إنتاجية جمع البيانات دون تدهور جودة الصورة. حدد تنسيق mrc الافتراضي للصور المدمجة المحفوظة. حدد الشبكة المستخدمة ونوعها. استخدم هذا البروتوكول R-1.2/1.3 UltraAufoil ل apo-ferritin وشبكة R-2/1 Quantifoil للبروتيازوم 20S. حدد Quantifoil ضمن حامل العينة و R1.2/1.3 أو 2/1 ضمن نوع Quantifoil. اختياري: انقر على زر تسجيل الدخول إلى أثينا في الزاوية اليمنى السفلى لاستخدام مراقبة جودة EPU (EQM). أدخل تفاصيل تسجيل الدخول في النافذة المنبثقة للمتصفح لتنشيط قسم الإعدادات في نظرة عامة على إعداد الجلسة . انقر فوق الزر تحديد في قسم الإعدادات واستعرض بحثا عن مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها مسبقا (قسم البروتوكول 2) لربطها بجمع البيانات الحالي. قم بتشغيل خانة الاختيار تمكين مراقبة الجودة . انقر فوق الزر “تطبيق ” لإنشاء جلسة جديدة.ملاحظة: سيؤدي هذا الإجراء إلى فتح مهام جديدة في قائمة العمود الأيمن. في أي وقت أثناء الجلسة، إذا كانت بعض التفاصيل غير صحيحة، فمن الممكن العودة إلى مهمة إعداد جلسة العمل ، وتغيير/تحديث التفاصيل والنقر فوق تطبيق مرة أخرى لتحديث الجلسة. حدد مهمة تحديد مربع في اللوحة اليمنى لإظهار الأطلس الذي تم تجميعه للشبكة. اختياريا ، انقر نقرا مزدوجا فوق أي بلاط من الأطلس لرؤية صورة ذات جودة أعلى للحكم بشكل أفضل على جودة الجليد في مربعات الشبكة. انقر نقرا مزدوجا مرة أخرى على الصورة للعودة إلى أطلس الشبكة. حدد مربعات الشبكة بالخصائص التالية (الشكل 4): (i) رقائق الدعم في مربع الشبكة سليمة دون ضرر ، (ii) الجليد الرقيق الزجاجي في ثقوب الرقائق (تبدو الثقوب أكثر إشراقا من رقائق الكربون الداعمة) ، (iii) أقل تلوث جليدي بلوري (بقع سوداء) في مربع الشبكة قدر الإمكان ، (iv) الحد الأدنى من تدرج السطوع عبر مربع الشبكة وداخل ثقوب رقائق فردية.ملاحظة: مع الإعدادات المسبقة المختارة ومع شبكة جيدة ، يمكن ل 200 kV cryo TEM المستخدم في هذه الدراسة التصوير بمعدل ~ 200-300 فيلم / ساعة. مع وضع ذلك في الاعتبار ، حدد أكبر عدد ممكن من المربعات حسب الحاجة ، أو أضف المزيد لاحقا من خلال العودة إلى مهمة اختيار المربع وفقا لمقدار وقت المجهر المتاح. للإشارة ، تم جمع 3000 فيلم لتحقيق دقة 1.6 Å من apo-ferritin. حدد مربعات الشبكة لجمع البيانات إما في الأطلس الكامل أو صور التجانب عالية الجودة انقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع اهتمام الشبكة واختر الخيار تحديد في قائمة السياق بدلا من ذلك ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Ctrl على لوحة المفاتيح وانقر بزر الماوس الأيسر على مربعات الشبكة المطلوبة على العكس من ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق المفتاح Shift وقم بإلغاء تحديده أو اضغط باستمرار وانقر بزر الماوس الأيسر لإزالة المربعات ملاحظة: الخطوات التالية حاسمة لضمان أن يؤدي جمع البيانات إلى إعادة بناء عالية الدقة. ابدأ في اختيار الثقوب في مربع الشبكة بطبقة جليدية رقيقة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع الشبكة هذا وحدد الخيار تحديد ثقوب لبدء مهمة تحديد الثقب . حدد مهمة تحديد الثقب في اللوحة اليمنى لتحديد الثقوب في مربعات الشبكة المحددة. انقر فوق الزر Auto-Eucentric للانتقال تلقائيا إلى أول مربع شبكة محدد ، وضبط ارتفاع Eucentric والحصول على صورة مربع الشبكة للعثور على ثقوب الرقائق. انقر فوق الزر ” البحث عن ثقوب” للعثور على ثقوب الرقائق في الصورة.ملاحظة: إذا لم يعمل البحث عن الثقب بشكل جيد (أي أن هناك إما ثقوبا تم تخطيها أو ثقوبا ذات حجم غير صحيح في الصورة)، فتحقق من إدخال القيم الصحيحة في إدخال نوع Quantifoil لمهمة إعداد جلسة العمل وابحث عن الثقوب مرة أخرى. إذا لم يتم العثور على الثقوب بشكل صحيح ، فانقر فوق الزر قياس حجم الثقب لتعيين قطر الثقب والمسافة يدويا والعثور على الثقوب مرة أخرى. انقر فوق الزر إزالة الثقوب بالقرب من زر شريط الشبكة لإلغاء تحديد الثقوب بالقرب من أشرطة الشبكة. اضبط الحدود في الرسم البياني للسطوع لمرشح الثلج (في أسفل يمين نافذة البرنامج) لإزالة جميع الثقوب ذات الجليد السميك جدا (باستخدام خط الحد الأيسر) وكذلك جميع الثقوب الفارغة (باستخدام خط الحد الأيمن) كما هو موضح في الشكل 4.ملاحظة: للتحسين، يمكن أيضا إدخال قيم كثافة محددة في مربعات النص المقابلة بجوار الزر تطبيق . اختياريا، استخدم فرشاة التحديد لتحسين تحديد الثقوب يدويا: انقر بزر الماوس الأيسر واسحب الفرشاة لإلغاء تحديد الثقوب غير المرغوب فيها. اضغط باستمرار على المفتاح Ctrl وانقر بزر الماوس الأيسر لتتمكن من إعادة تحديد ثقوب الرقائق. اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift وقم بالتمرير باستخدام عجلة الماوس لضبط حجم الفرشاة. حدد حفرة لإعداد واختبار قالب الحصول على البيانات الذي سيتم استخدامه بشكل متكرر أثناء جمع البيانات: انقر بزر الماوس الأيمن فوق ثقب في صورة مربع الشبكة وحدد الخيار نقل المرحلة إلى الموقع. حدد مهمة تعريف القالب في اللوحة اليمنى. حدد الإعداد المسبق للثقب / Eucentric وانقر فوق الزر اكتساب للحصول على صورة. انقر فوق الزر ” البحث عن ثقب وتوسيطه” لتوسيط ثقب في الصورة. قم بتعيين قيم للتأخير بعد إزاحة الصورة إلى 0.5 ثانية (افتراضي) والتأخير بعد إزاحة المرحلة إلى 20 ثانية. ملاحظة: نظرا لأن قطر الشعاع المتوازي مثبت على نظام cryo-TEM 200 كيلو فولت المستخدم في هذه الدراسة ويتوافق عادة مع 1.6-1.7 ميكرومتر مع فتحة 50 ميكرومتر، يمكن الحصول على صورة واحدة فقط لكل ثقب باستخدام شبكات R-1.2/1.3 وصورتين لكل ثقب (بالقرب من الحواف المقابلة) باستخدام شبكات R-2/1 أو R-2/2. يرجى ملاحظة أن حجم مناطق الاستحواذ المحددة على الشاشة لا يتوافق مع قطر الشعاع الفعلي. يمكن استخدام شريط مقياس الصورة لتقدير مسافة الموضع المناسبة. حدد الزر ” إضافة منطقة استحواذ” وانقر على الصورة لتحديد الموقع في الحفرة المركزية حيث سيتم التقاط صورة عالية التكبير منها. حدد الزر إضافة منطقة تركيز بؤري تلقائي وانقر على الصورة لتحديد الموقع على رقاقة الدعم بجوار الفتحة المركزية حيث سيتم تنفيذ التركيز البؤري التلقائي للصورة.ملاحظة: حجم الشعاع للتركيز هو 1.6-1.7 ميكرومتر ويجب وضعه على مسافة متساوية من الثقوب المجاورة على الكربون. انقر فوق منطقة الاستحواذ الخضراء لتعيين سلسلة من قيم إلغاء التركيز البؤري في قائمة إلغاء التركيز البؤري في القسم العلوي من نافذة البرنامج. أدخل أعلى إلغاء تركيز بؤري كأول لتحسين تصور الجسيمات في تشغيل اختبار لمهمة تنفيذ القالب التالية. انقر على منطقة التركيز البؤري التلقائي الزرقاء لتعيين الإعدادات الخاصة بالتركيز البؤري التلقائي في نفس المنطقة: حدد الخيار بعد التوسيط للتركيز البؤري التلقائي في بداية كل مجموعة AFIS. حدد الخيار Objective Lens للحصول على تركيز بؤري تلقائي أسرع وتقليل انحراف المرحلة. حدد مهمة تنفيذ القالب وانقر على الزر تنفيذ. راقب الخطوات الفردية لإجراء الحصول على البيانات (توسيط الثقب، والتركيز البؤري التلقائي في المنطقة المحددة، والحصول على الصورة في المناطق المحددة) وتحقق من جودة الجسيمات المصورة في الصورة النهائية عالية التكبير. انقر فوق الزر FFT في أسفل يسار نافذة صورة التكبير العالي للتحقق من صورة FFT وتقييم ما إذا كانت حلقات Thon تظهر تذبذبات متعددة وتمتد إلى دقة عالية في صورة FFT بصريا. إذا تم الانتهاء من تنفيذ القالب بنجاح ، فانقر فوق الزر إعداد جميع المربعات في مهمة تحديد الثقب للحصول على مجموعة جمع البيانات تلقائيا في جميع مربعات الشبكة المحددة الأخرى وفقا للإعدادات المستخدمة في مربع الشبكة الأول هذا. 6. محاذاة المجهر النهائية قبل البدء في جمع البيانات ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج عالية الدقة، يجب إجراء المحاذاة الأكثر حساسية بالضبط في نفس إعدادات وضع الحصول على البيانات في برنامج جمع البيانات وقبل بدء الحصول الفعلي على البيانات مباشرة. يجب أن تتم هذه المحاذاة في موضع به كربون دعم رقيق للشبكة ، بعيد بما فيه الكفاية عن أي قضبان شبكة ، ومحاذاة عند ارتفاع Eucentric. حدد مهمة تنفيذ القالب ، واحصل على صورة جديدة وانتقل مع المرحلة إلى منطقة نظيفة على رقائق الكربون بنقرة بزر الماوس الأيمن وحدد خيار القائمة نقل المرحلة هنا. حدد علامة التبويب وظائف تلقائية واضبط إلغاء التركيز البؤري المطلوب على 0 ميكرومتر وتكرار على -2 ميكرومتر. قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للتركيز البؤري التلقائي وانقر فوق الزر ابدأ لتشغيل وظيفة التركيز البؤري التلقائي. ضع شاشة الفلورسنت لأسفل وافتح قائمة المحاذاة المباشرة في واجهة مستخدم TEM. للحصول على أفضل النتائج، يمكن للمستخدمين ذوي الخبرة التحقق من محاذاة النقطة المحورية: اختر مهمة nP Beam Tilt pp X في قائمة المحاذاة المباشرة وتداخل الحزم المرتدة إلى أقصى حد باستخدام المقابض متعددة الوظائف على لوحات التحكم. كرر ذلك لمهمة np Beam Tilt pp Y . انقر على زر EF في قائمة كاميرا الشاشة الفلورية لإظهار دائرة خضراء تشير إلى فتحة مدخل مرشح الطاقة وتوسيط الشعاع فوق الدائرة الخضراء.ملاحظة: تأكد من إيقاف المضخة التوربينية قبل المتابعة. تقلل الاهتزازات الناتجة عنه من عدد حلقات الرعد المرئية وتتسبب في فشل وظائف السيارات بشكل متكرر. ارجع إلى نافذة البرنامج وحدد علامة التبويب وظائف تلقائية في شريط القوائم. حدد مهمة Autostigmate ، وقم بالتبديل إلى الإعداد المسبق ل Thon Ring ، واضغط على الزر ابدأ . راقب العملية للتأكد من أن (i) الصور الملتقطة على الكربون ، (ii) حلقات Thon مرئية بوضوح ، و (iii) تناسب CTF المحسوب (الخطوط المنقطة) في وضع جيد في الحد الأدنى لحلقة Thon (الشكل التكميلي 2). حدد مهمة Autocoma واضغط على زر البدء ( Start ) . راقب العملية للتأكد من أن الصور الملتقطة على الكربون وأن حلقات Thon مرئية بوضوح وأن التناسبات المحسوبة (الخطوط المنقطة) موضوعة بشكل جيد في الحد الأدنى لحلقة Thon. قم بتكبير كل صورة من صور حلقة Thon باستخدام عجلة تمرير الماوس (الشكل التكميلي 3).ملاحظة: إذا كان المجهر مجهزا بمرشح طاقة، فيجب إجراء ضبط مرشح الطاقة كجزء من تسلسل المحاذاة لتوسيط شق المرشح إلى ذروة الخسارة الصفرية ولتصحيح أي تشوهات في منشور مرشح الطاقة (الخطوات 6.9-6.14). يجب أن تتم هذه المحاذاة في منطقة فارغة من الشبكة ، مثل داخل مربع شبكة مكسور. افتح واجهة مستخدم Sherpa وحدد تطبيق مرشح الطاقة (الشكل التكميلي 4). اضبط الكاميرا على EF-Falcon، بن 4x، وقت التعرض 0.2 ثانية في نافذة الإعدادات . انقر فوق الزر ” مركز” في خيار “صفر خسارة ” لتوسيط شق مرشح الطاقة صفر الخسارة. انقر فوق الزر Tune في خيار Isochromaticity (الشكل التكميلي 4). انقر على تكبير اللحن وتشوهات اللحن في خيار التشوهات الهندسية واللونية (الشكل التكميلي 5 ، الشكل التكميلي 6) إذا لم تكن النتائج ضمن المواصفات المشار إليها وتظهر باللون الأحمر في تقرير المخرجات، فقم بتكرار المحاذاة من الخطوة 6.11 مرة أخرى.ملاحظة: على الرغم من أن مرجع كسب كاشف الإلكترون المباشر يمكن أن يكون مستقرا على مدار أشهر، إلا أنه يجب أخذ مرجع كسب جديد باستخدام مدير الصور المرجعية Falcon 4 إذا كانت صور المناطق الفارغة لا تظهر كثافة موحدة ولكنها تظهر خطوطا أو ميزات مميزة أخرى. بدلا من ذلك ، احسب تحويل فورييه السريع (FFT) لمثل هذه الصورة وتأكد من عدم وجود خطوط مرئية. في نافذة البرنامج، حدد علامة التبويب إعداد وقم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للحصول على البيانات. اضبط إعداد الجرعة على 40 e-/Å2 وانقر على زر قياس معدل الجرعة . انتقل إلى علامة التبويب EPU ، وحدد مهمة الاستحواذ التلقائي ، وتحقق اختياريا من وظيفة Auto Zero Loss ؛ انقر فوق الزر ” بدء تشغيل” لبدء جمع البيانات تلقائيا بالكامل. 7. مراقبة وتحسين جودة البيانات أثناء جمع البيانات ملاحظة: أثناء جمع البيانات ، يمكن مراقبة البيانات التي تم جمعها باستخدام EQM من خلال بوابة إدارة البيانات. تقوم EQM بإجراء تصحيح الحركة وتحديد CTF أثناء التنقل وتعرض النتائج في البوابة. ومن ثم يصبح المستخدم قادرا على الحكم على جودة عمليات الاستحواذ الفردية، والاطلاع على الرسوم البيانية لمختلف مؤشرات الجودة، وتصفية عمليات الاستحواذ غير المرغوب فيها وتصدير البيانات إلى تخزينها النهائي إما أثناء التنقل أو كمهمة دفعية. انتقل إلى مجموعة البيانات التي يضع برنامج التحليل البيانات فيها باستخدام مستعرض ويب. في نظرة عامة على مجموعة البيانات، تعرض بطاقات الاقتناء معلومات حول تصحيح الحركة وتحديد CTF بتنسيق رسومي. انقر على البطاقات الفردية للحصول على مزيد من المعلومات. قم بتمكين لوحة DataViz من عرض الرسوم البيانية المجمعة من مجموعة البيانات الكاملة التي تعرض نطاق عدم التركيز البؤري والاستجماتيزم والثقة CTF لكل عملية استحواذ (الشكل التكميلي 7). استخدم المرشحات الموجودة أعلى اللوحة لتحديد البيانات الموجودة ضمن نطاق إلغاء التركيز البؤري المطلوب فقط، والتي تحتوي على الاستجماتيزم بالقرب من الصفر، ويمكن تحديد CTF حتى الدقة (الهدف) المحددة. بمجرد إعداد عوامل التصفية، اضغط على الزر تطبيق ( Apply ) لعرض البيانات المختارة فقط في نافذة نظرة عامة على مجموعة البيانات. عندما تكون معظم الصور التي تم الحصول عليها ضمن المعايير المحددة، دع جلسة جمع البيانات تستمر في الانتهاء. إذا كان جزء صغير جدا من الصور التي تم الحصول عليها يفي بالمعايير المحددة ، فإما إعادة تكوين إعدادات برنامج التحليل ، أو الانتقال إلى منطقة أخرى في العينة (اضغط على زر Next Grid Square في برنامج التحليل) ، أو إيقاف جمع البيانات.

Representative Results

توفر بوابة إدارة البيانات تخزينا فعالا ومنظما للصور والبيانات والبيانات الوصفية التي تم جمعها من مهام سير عمل تجريبية متعددة في نظام أساسي برمجي واحد. تتكون كل تجربة محددة في مشروع تم إنشاؤه من سير عمل مع خطوات يحددها العميل لالتقاط معلومات العينة والبيانات المجمعة والبيانات الوصفية ذات الصلة دون أي قيود لتوفير أقصى قدر من المرونة وسهولة الاستخدام لأي تجارب محتملة وجميع حالات الاستخدام (الشكل 1 ، الشكل 2). تحتوي بوابة إدارة البيانات أيضا على وظيفة ملاحظة المختبر لتوضيح خطوات سير العمل ، بما في ذلك معالجة الصور ذات النتائج الوسيطة ، والتي يمكن ربطها جميعا بالمشروع وتوفير سجل كامل قدر الإمكان لتحليل وإنشاء التقارير والمنشورات. الشكل 1: مثال على التنظيم المحتمل للبيانات والبيانات الوصفية في منصة إدارة البيانات. يمكن أن يتكون كل مشروع من تجارب متعددة ، مثل cryo-EM أو التحليل الطيفي للكتلة (أي خطوة البروتوكول 2.3). يمكن أن تتضمن كل تجربة مهام سير عمل متعددة معرفة من قبل المستخدم (أي خطوة البروتوكول 2.5)، ويتكون كل منها من عدة خطوات قابلة للتكوين (أي خطوة البروتوكول 2.7). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: عرض سير عمل مشروع مفتوح في النظام الأساسي لإدارة البيانات. يوضح الشكل بيانات التعريف والملاحظات المقترنة بالخطوة المفتوحة في سير العمل. يوفر الشريط الأيسر مع الرموز وصولا سريعا إلى خيارات وقوائم مختلفة من النظام الأساسي لإدارة البيانات. تتضمن اللوحة اليمنى قائمة بمهام سير العمل المحفوظة (تظهر سير عمل واحد فقط “Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7”) وزر أزرق لإضافة سير عمل جديد. تعرض اللوحة المركزية الخطوات الفردية في سير العمل المفتوح، كما هو موضح لسير عمل SPA هنا. يمكن أن يضيف الزر الأزرق الموجود أعلى اليسار خطوة إضافية إلى سير العمل المفتوح. تتضمن اللوحة اليمنى مساحة إما للبيانات الأولية المسجلة أو ملاحظات إدخال المستخدم لسير العمل، والتي قد تتضمن نصا وجداول وصورا. تتوفر خيارات تنسيق مختلفة للنص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. عادة ما تعرض شبكات Cryo-EM المنتجة باستخدام أجهزة تجميد الغطس التقليدية ، مثل Vitrobot ، تدرجا من سمك الجليد على سطح الشبكة. يمكن أيضا أن تتلف بعض الشبكات (عازمة) بعد المعالجة اليدوية و / أو القطع في حامل حلقة autogrid. ويبين الشكل 3 أمثلة لشبكات مختلفة على النحو المبين في الاستعراض العام للأطلس. يجب استبعاد الشبكات ذات الجليد السميك أو التلف من مزيد من التحقيق. الشكل 3: معرض للشبكات المختلفة كما هو موضح في نظرة عامة على أطلس . (أ) شبكة سيئة ذات جليد سميك ، (ب) شبكة منحنية مع تلوث سيئ بالجليد والجليد ، (ج) شبكة مقبولة ذات تدرج جليدي جيد ، (د) شبكة نموذجية ذات جليد رقيق جيد وتدرج جليدي صغير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. يعد اختيار مربعات الشبكة دون أي ضرر وسماكة الجليد المثلى أمرا بالغ الأهمية لجمع مجموعات بيانات عالية الدقة. قد يختلف سمك الجليد حتى على مستوى مربعات الشبكة الفردية ، وبالتالي ، من المهم تحديد الثقوب ذات الجليد الرقيق على النحو الأمثل من كل مربع شبكة محدد. يوضح الشكل 4 مربع شبكة مناسب مع رقائق سليمة وجليد رقيق في الوسط. يعد مربع الشبكة الموضح جيدا لإعداد مرشح للاختيار الآلي للثقوب ذات الجليد الرقيق في جميع مربعات الشبكة المحددة لأنه يحتوي على مجموعة من سمك الجليد المختلفة بالإضافة إلى الثقوب الفارغة بدون جليد ، وهو أمر مفيد للغاية لتعيين نطاق مناسب من الكثافة في مرشح الجليد في مهمة اختيار الثقب. الشكل 4: مثال على مربع الشبكة مع تدرج سمك الجليد ، من مربعات الشبكة الفارغة في الوسط والجليد السميك بالقرب من قضبان الشبكة. يمكن استخدام مرشح جودة الجليد لتحديد نطاق الكثافات داخل الثقوب بسماكة الجليد المثالية التي يتم اختيارها وفقا لذلك في مربع الشبكة (الثقوب ذات التراكب الأخضر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تم الحصول على نتائج مرجعية باستخدام البروتوكول الموصوف باستخدام عينة من الفأر apo-ferritin (apoF) من مجموعة Kikkawa11. ApoF هو بروتين حلزوني عالي α يشكل قفصا ثماني السطوح مستقرا للغاية. يجعل الاستقرار العالي والتماثل العالي من apoF عينة مثالية للتصوير بالتبريد EM عالي الدقة ومعالجة الصور. لذلك أصبح ApoF عينة قياسية لتقييم أداء أدوات التبريد EM 11،12،13. تم إذابة أليكوت مجمدة تحتوي على 15 ملغم / مل من عينة apoF النقية على الجليد وتم توضيحها عن طريق الطرد المركزي عند 10000 × g لمدة 10 دقائق. تم تخفيف supernatant إلى 5 ملغ / مل مع 20 mM HEPES الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 150 mM كلوريد الصوديوم. تم تطبيق 3 ميكرولتر من العينة المخففة على R-1.2 / 1.3 ، 300 شبكة ذهبية شبكية لمدة 30 ثانية. ثم تم مسح الشبكات لمدة 5 ثوان قبل الغطس في الإيثان السائل المبرد بواسطة النيتروجين السائل. تم إجراء تجميد الغطس باستخدام نظام تزجيج آلي بالكامل عند رطوبة 100٪ و 4 درجات مئوية. تم قص جميع الشبكات في autogrids وتحميلها في 200 كيلو فولت Cryo-TEM. تم جمع حوالي 3000 فيلم بمعدل إنتاجية 300 فيلم / ساعة. تمت معالجة البيانات باستخدام الطرق الموضحة11 مع التعديلات التالية: i) تم استخدام إصدار Relion 4-beta بدلا من Relion 3.1 ، ii) تم اختيار الجسيمات الآلي باستخدام متوسطات فئة 2D لعمليات إعادة بناء apoF السابقة كمراجع ، و iii) تم إنشاء النموذج ثلاثي الأبعاد الأولي من إعادة بناء apoF السابقة منخفضة الدقة إلى 15-Å. لم يتم تجميع البصريات لمجموعة البيانات هذه حيث ثبت أن إجراء AFIS34 المستخدم يقلل بكفاءة وموثوقية من تحولات الطور الناجمة عن إمالة الحزمة التي لا تحد من جودة البيانات لإعادة بناء الخرائط ثلاثية الأبعاد في درجات الدقة المبلغ عنها. أدى صقل 3D بعد تلميع Bayesian وصقل CTF إلى خريطة دقة 1.68 Å. تم تحسين الدقة بشكل أكبر مع تصحيح كرة Ewald مما أدى إلى خريطة دقة 1.63 Å. ويبين الجدول 2 نظرة عامة على بارامترات جمع البيانات ومعالجتها، وترد خريطة الكثافة النهائية المعاد بناؤها في الشكل 5، مع منحنى ارتباط فورييه شل (FSC) الموضح في الشكل التكميلي 8. الجدول 2: معلمات جمع البيانات ومعالجة الصور المستخدمة لإعادة بناء 3D من apo-ferritin. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الشكل 5: إعادة بناء Cryo-EM ل apo-ferritin . (اللوحة اليسرى) تقديم 3D لخريطة apoF cryo-EM المعاد بناؤها بدقة 1.6 Å. (اللوحة اليمنى) عرض مفصل للخريطة المعاد بناؤها على مستوى السلاسل الجانبية الفردية للأحماض الأمينية. يتم حل كثافة السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية بشكل جيد ، ويمكن بناء النموذج الذري بشكل لا لبس فيه داخل هذه الخريطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تم تقييم آثار وفوائد استخدام مرشح الطاقة في عمليات إعادة بناء SPA باستخدام بروتياسوم 20S بدائي النواة المعزول من T. acidophilum. كما تم استخدام البروتيازوم 20S بدائي النواة كعينة تبريد EM قياسية لأنه يمثل النواة الحفازة المستقرة لمجمع البروتيازوم مع تناظر D7. تم إعداد الشبكات عن طريق إضافة 4.5 ميكرولتر من عينة البروتيازوم T. acidophilum 20S النقية إلى شبكة نحاسية R 2/1 مفرغة من التوهج. تم تزجيج العينات في خليط سائل من الإيثان / البروبان باستخدام نظام تزجيج آلي بالكامل مضبوط على 4 درجات مئوية ورطوبة 100٪ مع قوة لطخة تبلغ 20 ووقت لطخة يبلغ 4.5 ثانية. تم جمع ثلاث مجموعات بيانات مختلفة من نفس شبكة cryo-EM مع مربعات شبكة مماثلة باستخدام عرض شق مختلف لمرشح الطاقة بالترتيب: i) شق مفتوح بالكامل (بدون إدخال شق) ، ii) شق 20 eV و iii) شق 10 eV. تم اختيار مربعات الشبكة باستخدام مرشح جودة الجليد داخل برنامج التحليل. وظلت جميع البارامترات الأخرى لجمع البيانات ومعالجتها كما هي. تم جمع مجموعات البيانات لمدة 15 ساعة مع ما مجموعه 4000 فيلم ومعالجتها باستخدام الطرق كما هو موضح11 باستخدام Relion 3.1 مع التعديل الذي تم فيه استخدام خوارزمية انتقاء الجسيمات Laplacian-of-Gaussian لإنتاج متوسطات أولية لفئة 2D لاختيار الجسيمات المستندة إلى المرجع من مجموعات البيانات الكاملة. تم اختيار نفس العدد (102,200) من الجسيمات المختارة عشوائيا واستخدامها للتكرار النهائي وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد لكل مجموعة بيانات. يتم وصف متغيرات معالجة البيانات في الجدول (الجدول 3) أدناه لتحقيق خريطة كثافة EM النهائية المعاد بناؤها الموضحة في الشكل 6 مع منحنى FSC الموضح في الشكل التكميلي 9. لم يتم تجميع البصريات وتصحيح مجال Ewald لمجموعات البيانات هذه أيضا. الجدول 3: معلمات جمع البيانات ومعالجة الصور المستخدمة لإعادة بناء ثلاثي الأبعاد لبروتيازوم T. acidophilum 20S. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الجدول 4: ملخص للدقة المحققة والعامل B لإعادة بناء بالتبريد EM لبروتياسوم T. acidophilum 20S باستخدام مجموعات بيانات ذات عرض شق طاقة مختلف. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الشكل 6: تأثير تصفية الطاقة على صور cryo-EM. (A) صور Cryo-EM بقيم مختلفة لإلغاء التركيز البؤري تم جمعها مع أو بدون شق 10 eV. (ب) نظرة عامة على خريطة 20S proteasome cryo-EM مع وحدات فرعية مجزأة. (ج) عرض التكبير في خريطة البروتياسوم 20S مع نموذج ذري مجهز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل التكميلي 1: مهمة معايرة إزاحات الصورة (القطع الناقص الأصفر) لمحاذاة إزاحات الصورة بين الإعدادات البصرية المسبقة المختلفة (القطع الناقص الأحمر) في برنامج التحليل، باستخدام بلورة من الجليد السداسي مرئية في نطاق التكبير الكامل بين 100x إلى 165,000x. (أعلى) المعايرة بين الإعدادات المسبقة للحصول على البيانات والارتفاع الثقبي/Eucentric، والمعايرة (الوسطى) بين الإعدادات المسبقة لارتفاع الثقب/Eucentric ومربع الشبكة، والمعايرة (السفلية) بين الإعدادات المسبقة لمربع الشبكة وأطلس. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 2: دالة الوصم الذاتي في برمجيات التحليل (القطع الناقص الأصفر). (الصورة اليسرى) الصورة المكتسبة. (الصورة اليمنى) نقل فورييه للصورة المكتسبة التي تظهر حلقات ثون متحدة المركز وتناسبها CTF الموضح في الحزم الشعاعية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 3: واجهة المستخدم لدالة Autocoma في برنامج التحليل (القطع الناقص الأصفر) لمحاذاة الغيبوبة. تعرض لوحة الصور صور نقل فورييه التي تم الحصول عليها عند إمالات شعاع مختلفة وتناسبها CTF التي تستخدم لحساب الغيبوبة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 4: واجهة المستخدم لضبط مرشح الطاقة. مثال على تقرير جيد عن isochromacity مرشح الطاقة مع جميع المعلمات (الموضحة في النص الأخضر) ضمن المواصفات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 5: واجهة المستخدم لضبط مرشح الطاقة. مثال على تقرير ضبط جيد لتشوهات تكبير مرشح الطاقة مع جميع المعلمات (الموضحة في النص الأخضر) ضمن المواصفات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 6: واجهة المستخدم لضبط مرشح الطاقة. مثال على الضبط الجيد للتشوهات اللونية لمرشح الطاقة مع جميع المعلمات (الموضحة في النص الأخضر) ضمن المواصفات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 7: لوحة DataViz التابعة لمراقب جودة وحدة EPU مع نظرة عامة على جودة البيانات في مجموعة بيانات cryo-EM التي تم جمعها. تظهر الرسوم البيانية التي تحتوي على بيانات مجمعة من جميع الصور / الأفلام التي تم جمعها قيما (مخططات نقطية) وتوزيعا (مخططات شريطية) لمؤشرات جودة حرجة مختارة ، مثل CTF fit confidence (الأزرق) ، وإلغاء التركيز (البرتقالي) ، والاستجماتيزم (الأخضر). يمكن تحديد مجموعة فرعية من الصور / الأفلام التي تم جمعها عن طريق إعداد مرشحات المعلمات في الجزء العلوي من لوحة DataViz. بعد تطبيق المرشحات ، يمكن تصدير الصور / الأفلام المحددة لمزيد من المعالجة في حزمة معالجة صور أخرى ، مثل Relion أو CryoSpark. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 8: منحنى FSC لإعادة البناء النهائي ل apoF إلى دقة 1.6 Å ، كما ورد في Relion 4-beta. يظهر المنحنى الأزرق FSC لخرائط 3D المقنعة من اثنين من عمليات إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد المكررة بشكل مستقل من مجموعتين نصف بيانات متعارضتين. وفقا للمعيار الذهبي FSC عند 0.143 ، فإن دقة الخريطة ثلاثية الأبعاد النهائية المعاد بناؤها من مجموعة البيانات الكاملة تتوافق مع 1.6 Å. يظهر المنحنى البرتقالي FSC لعمليات إعادة الإعمار 3D المقنعة مع مراحل عشوائية. يشير الانخفاض السريع لمنحنى FSC إلى أن القناع المستخدم لم يساهم في FSC المرصود للخرائط الأصلية المعاد بناؤها (المنحنى الأزرق) بعد دقة ~ 2 Å. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. الشكل التكميلي 9: منحنيات FSC لإعادة البناء النهائي ل T. acidophilum 20S proteasome باستخدام عروض شق مختلفة لمرشح الطاقة ، كما ورد في Relion 3.1. تظهر المنحنيات الزرقاء FSC لخرائط 3D المقنعة من عمليتي إعادة بناء تم تنقيحهما بشكل مستقل من مجموعتين نصف بيانات لكل مجموعة بيانات ، على التوالي. يشير FSC القياسي الذهبي عند 0.143 إلى الدقة المحققة للخرائط ثلاثية الأبعاد النهائية التي أعيد بناؤها من مجموعات البيانات الكاملة ذات الصلة (دقة 2.3 Å و 2.2 Å و 2.1 Å ، على التوالي). تظهر المنحنيات الحمراء FSC للخرائط المقنعة ذات المراحل العشوائية. يشير الانخفاض السريع لمنحنيات FSC الحمراء إلى أن القناع المستخدم لم يساهم في FSC للخرائط الأصلية المعاد بناؤها بعد دقة ~ 3 Å. تظهر المنحنيات الخضراء FSC للخرائط ثلاثية الأبعاد غير المقنعة ، والتي تتأثر بالضوضاء في حجم 3D المعاد بناؤه بالكامل ، وبالتالي تسقط في وقت أقرب من FSC للخرائط ثلاثية الأبعاد المقنعة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف. توافر البيانات: تم إيداع خرائط كثافة cryo-EM في بنك بيانات EM تحت أرقام الانضمام: apoferritin: EMD 14173 ، EMPIAR-10973. 20S بروتيازوم: EMD 14467 ، EMPIAR-10976.

Discussion

يفترض البروتوكول الموصوف أن بصريات مجهر TEM المستخدم في حالة محاذاة بشكل جيد. بالنسبة ل 200 kV TEM المستخدم في هذا البروتوكول ، يتم إجراء محاذاة الأعمدة هذه والتحقق منها وحفظها من قبل مهندس خدمة متمرس بعد تركيب المجهر أو أي تدخل كبير في الخدمة. يمكن استدعاء إعدادات المحاذاة هذه في أي وقت في واجهة مستخدم المجهر. يمكن للمستخدمين استخدام إجراءات المحاذاة المباشرة في واجهة مستخدم المجهر لإعادة تعديل المعلمات الحرجة. بعض المحاذاة ، مثل إمالة البندقية وتبديل البندقية ، مستقرة ولا تحتاج إلى تعديل من قبل المستخدمين على أساس يومي. ينصح المشرف المجهري بإجراء فحوصات وإعادة محاذاة (إذا لزم الأمر) لإمالة البندقية وتحولها مرتين في السنة. من ناحية أخرى ، فإن بعض التحالفات حاسمة ويجب مواءمتها قبل كل جمع للبيانات كما هو موضح في البروتوكول أعلاه (مثل الاستجماتيزم الموضوعي والمحاذاة الخالية من الغيبوبة). إذا فشلت وظيفة Autocoma في برنامج التحليل في التقارب ، فيجب التحقق من محاذاة النقاط المحورية لإمالة الشعاع و / أو مركز الدوران وتعديلها ، ويجب تأكيد التمركز الصحيح لفتحة C2. بعد ذلك ، يجب تشغيل وظيفة Autostigmate حيث يتم استخدام وصمات الوصم الموضوعية لتصحيح الغيبوبة أيضا. يجب تكرار هذه المحاذاة حتى ينجح كل من Autostigmate و Autocomafunctions في تكرارهما الأول. إذا لزم الأمر، يمكن تحديد منطقة أخرى (على سبيل المثال، دعم رقائق الكربون بدون ثلج)، أو ضبط إلغاء التركيز البؤري المصور، أو زيادة وقت اكتساب الصورة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصور المكتسبة، ورؤية حلقات Thon المتعددة في تحويل فورييه للصور المكتسبة.

تولد المجاهر الحديثة cryo-EM كميات هائلة من البيانات التي غالبا ما تتجاوز 1 تيرابايت لكل مجموعة بيانات لتحقيق عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ، خاصة بالنسبة للبروتينات ذات التماثل المنخفض. عادة ما تستكمل بيانات ونتائج Cryo-EM ببيانات ونتائج من طرق متعامدة لفهم العلاقات بين البنية والوظيفة بشكل كامل في كل مشروع علمي. إن تنظيم البيانات التي تم جمعها، ونقلها إلى خط أنابيب لمعالجة الصور، ومشاركة إعادة بناء شبكة التبريد EM الناتجة بين المتعاونين يضع متطلبات إضافية على المتبنين الجدد لمنهجية cryo-EM لإنشاء البنية التحتية المحلية لتكنولوجيا المعلومات الخاصة بهم. تسهل برامج إدارة البيانات ، مثل أثينا ، التخزين المركزي للبيانات التي يتم الحصول عليها بواسطة أي أداة أو برنامج متصل يديره مستخدم مسجل. يمكن الوصول إلى البيانات المخزنة وبيانات التعريف باستخدام واجهة مستعرض ويب بسيطة من قبل عدة مستخدمين، يمكنهم الحصول على أدوار مختلفة في المشروع مع حقوق وصول مختلفة (إما كمالك أو متعاون أو عارض) استنادا إلى بيانات اعتماد تسجيل الدخول وتعريف مشاركة البيانات في إعداد التجربة. توفر رقمنة سير العمل التجريبية هذه وسائل لمشاركة البيانات والبيانات الوصفية بين المتعاونين دون ازدواجية غير ضرورية وتزيد من إنتاجية وإمكانية تتبع سير العمل المستخدم. يعد تنفيذ هيكل عام وقابل للتخصيص للمشاريع والتجارب وسير العمل في برامج إدارة البيانات أمرا عالميا ويسمح بتخصيص ودمج التجارب المتعامدة باستخدام طرق تكميلية في قاعدة بيانات مشروع واحدة.

يعد اختيار المناطق لجمع البيانات على شبكة cryo-EM أمرا بالغ الأهمية للنجاح في الحصول على مجموعات بيانات عالية الدقة. عادة ما تعرض شبكات Cryo-EM المنتجة باستخدام أجهزة تجميد الغطس التقليدية ، مثل Vitrobot (نظام تزجيج مؤتمت بالكامل) ، تدرجا من سمك الجليد على سطح الشبكة (الشكل 4). قد يكون هذا مفيدا لأن الشبكة تحتوي على مناطق بسماكات جليدية مختلفة. ومع ذلك ، يجب تحديد المناطق ذات سمك الجليد المثالي لجمع البيانات كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. يجب أن تحتوي شبكة cryo-EM المثلى على أقل قدر ممكن من تلوث الجليد الناقل وتحتوي على مربعات شبكة كافية مع رقائق دعم هولي سليمة. لا ينصح بجمع البيانات عن مربعات الشبكة التي تحتوي على شقوق أو مناطق مكسورة لأن الصور التي تم جمعها ستتأثر بالانجراف الكلي الأقوى بكثير عند الإضاءة بواسطة شعاع إلكترون مقارنة بمربعات الشبكة ذات رقائق الدعم السليمة. يمكن أن يؤدي فائض الجليد البلوري إلى سد غالبية ثقوب الرقائق و / أو التداخل مع التركيز البؤري التلقائي ويجب تجنب مربعات الشبكة هذه أيضا. عادة ما تظهر مربعات الشبكة ذات الجليد الرقيق مساحات زجاجية كبيرة والعديد من ثقوب الرقائق الساطعة التي يمكن رؤيتها في صورة تم التقاطها باستخدام الإعداد المسبق لأطلس. من المتوقع حدوث جليد أكثر سمكا بالقرب من قضبان الشبكة وغير حرج حيث يتم استبعاد ثقوب الرقائق في هذه المناطق من مربع الشبكة أثناء إجراء اختيار الثقب. قد يشير وجود العديد من الثقوب الفارغة في مربع الشبكة إلى أن الجليد الزجاجي في الثقوب المحيطة رقيق للغاية وقد يحتوي على جزيئات تالفة أو لا تحتوي على جزيئات على الإطلاق. بشكل عام ، من الحكمة اختيار مربعات الشبكة ذات مجموعة متنوعة من سمك الجليد في مناطق مختلفة على الشبكة للفرز والتقييم الأولي لفهم المناطق التي لديها أفضل الظروف لجمع البيانات عالية الدقة وإظهار كثافة الجسيمات المثالية وتوزيع الاتجاه. بالنسبة لعينات البروتيازوم apoF و 20S المستخدمة في هذه الدراسة ، تحتوي المناطق ذات أنحف الجليد الذي يمكن ملاحظته على أفضل الظروف للتصوير عالي الدقة لهذه العينات.

عند اختيار الثقوب تلقائيا في جميع مربعات الشبكة المحددة باستخدام برنامج جمع البيانات، ينصح بتنفيذ مهمة تنفيذ القالب على ثقب تمثيلي في كل مربع شبكة للتحقق والتأكد من عدم اختيار مربعات سميكة بشكل مفرط أو رقيقة للغاية أو غير زجاجية بشكل غير متوقع لجمع البيانات. أثناء الحصول على البيانات ، يمكن مراقبة مؤشرات الجودة الرئيسية للصور التي تم جمعها ، مثل انحراف الصورة وتركيب CTF ، باستخدام EQM. يمكن بعد ذلك تحسين جمع البيانات عن طريق تخطي المناطق التي تنتج صورا ذات جودة رديئة. ومع ذلك، لا يزال بإمكان الصور ذات الملاءمة عالية الدقة ل CTF أن تحتوي على صور تحتوي على جزيئات في عدد قليل من الاتجاهات المفضلة أو جزيئات مشوهة في طبقة جليدية رقيقة جدا. ومن شأن انتقاء الجسيمات في الوقت الحقيقي والتصنيف 2D من الصور التي تم جمعها أن يوفران معلومات إضافية حول جودة البيانات الهيكلية في الجسيمات المصورة ويكشفان عن الاتجاهين المفضلين للجسيمات السليمة في الجليد أو البنية غير المتسقة للجسيمات المشوهة (جزئيا). وبالتالي يمكن أن يساعد حساب متوسطات الفئات على زيادة تحسين المناطق المناسبة لجمع البيانات ، كما تم تنفيذه بالفعل وموضح في حزم البرامج الأخرى23,28.

يعتمد اختيار إعدادات التصوير للحصول على البيانات ، مثل التكبير ومعدل جرعة الإلكترون ونطاق إلغاء التركيز البؤري ، على عدة معايير ، مثل الدقة المستهدفة ، وحجم البروتين ، وتركيز العينة ، وإنتاجية المجهر المطلوبة ، وما إلى ذلك. بالنسبة لكاميرا كاشف الإلكترون المباشر المستخدمة في هذه التجارب ، تم اختيار معدل جرعة الإلكترون في نطاق 4-5 e–/pix/s عن طريق اختيار حجم وكثافة SPOT المناسبين للحفاظ على الإضاءة المتوازية. وكما هو مبين في الجدول 1، يمكن استخدام حجم SPOT مختلف في الإعداد المسبق لارتفاع الثقب/Eucentric لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية في الصورة لتوسيط الثقوب أثناء جمع البيانات. يجب اختيار التكبير بحيث يكون حجم البكسل أصغر ب 2-3 مرات على الأقل من الدقة المستهدفة لإعادة بناء cryo-EM. ومع ذلك ، يتم استخدام التكبير الأعلى (أي حجم البكسل الأصغر) ، ويتم التقاط مجال الرؤية الأصغر في الصور ، وهناك جزيئات أقل لكل صورة ، مما يؤدي في النهاية إلى وقت أطول لجمع البيانات لجمع الصور مع جزيئات كافية لإعادة بناء خرائط 3D إلى دقة عالية. بالنسبة لعينة apoF ، استخدمنا حجم البكسل البالغ 0.43 Å حيث كان لدينا تركيز عينة كاف للكثافة العالية للجسيمات في الصور واستهدفنا دقة sub-2 Å لإعادة الإعمار. بالنسبة لعينة البروتيازوم 20S ، استخدمنا حجم البكسل 0.68 Å لتغطية مجال رؤية أكبر في الصور التي تم الحصول عليها. عادة بالنسبة لمجاهر TEM 200 كيلو فولت ، يتم الحصول على صور cryo-EM في نطاق إلغاء التركيز البؤري من 0.8 إلى 2.0 ميكرومتر. ومع ذلك ، مع تحسين نسبة التباين والإشارة إلى الضوضاء باستخدام مرشح الطاقة ، يمكن إجراء عمليات الحصول على البيانات بالقرب من التركيز البؤري للحفاظ على المعلومات عالية الدقة بشكل أفضل في الصور التي تم الحصول عليها بسبب الانحرافات الأصغر وتقليل اضمحلال وظيفة مغلف CTF في المقابل. كما أننا لا نستخدم فتحة عدسة موضوعية لأن الفتحة قد تحدث انحرافات إضافية في الصورة بينما يتم بالفعل تحسين تباين الصورة بشكل كاف باستخدام مرشح الطاقة. بالنسبة لعينات البروتيازوم apoF و 20S ، استخدمنا إعدادات إلغاء التركيز البؤري ل 0.5 ميكرومتر و 0.7 ميكرومتر و 0.9 ميكرومتر. بالنسبة للبروتينات الأصغر (<200 كيلو دالتون) ، استخدمنا إعدادات إلغاء التركيز البؤري من -0.5 ميكرومتر و -0.7 ميكرومتر و -0.9 ميكرومتر لتحسين تباين الجسيمات وتسهيل التقاط الجسيمات بسهولة والمحاذاة الخشنة الأولية في خطوة الصقل ثلاثي الأبعاد لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد ، مما أدى إلى خرائط ثلاثية الأبعاد بدقة 2.5 Å تقريبا (نتائج غير منشورة).

لقد أظهرنا بالفعل أن التصوير باستخدام مرشح الطاقة يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في صور cryo-EM التي تم جمعها على مجاهر TEM 300-kV11 المتطورة. في الواقع ، عندما تمر الإلكترونات عبر عينة ، يحدث نوعان رئيسيان من التفاعلات: i) تحافظ الإلكترونات المتناثرة بشكل مرن على طاقتها وتساهم في تكوين الصورة عن طريق التداخل مع الحزمة الساقطة غير المتناثرة عبر آلية تباين الطور ii) تفقد الإلكترونات المبعثرة بشكل غير مرن بعض الطاقة في العينة وتساهم بشكل رئيسي في الضوضاء في الصور. لذلك ، يمكن تحسين SNR بشكل كبير عن طريق تصفية الإلكترونات المتناثرة بشكل غير مرن ، والتي لديها طاقة أقل من الشعاع الساقط والإلكترونات المتناثرة بشكل مرن ، باستخدام شق طاقة ضيق. ومع ذلك، من الأهمية بمكان استخدام مرشح طاقة مستقر بما فيه الكفاية، مثل Selectris أو Selectris-X، لتكون قادرا على استخدام شقوق ضيقة جدا (10 eV أو أصغر) على مدى فترة طويلة (12+ ساعة) الحصول الآلي على البيانات من مجموعات بيانات cryoEM عالية الدقة.

تظهر صور Cryo-EM التي تم الحصول عليها باستخدام مجاهر TEM 200 kV في نفس الظروف كما هو الحال مع مجاهر TEM 300 kV SNR أصغر بدقة عالية (خاصة <4 Å) بسبب الاضمحلال الأسرع لوظائف مغلف CTF. وبالتالي ، هناك حاجة إلى عدد أكبر من الجسيمات (وبالتالي عدد أكبر من الصور التي تم جمعها) لتحقيق دقة معينة عند استخدام TEMs 200 كيلو فولت. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عمق المجال (10-25 نانومتر في نطاق الدقة 2-3 Å) أصغر بنسبة 20٪ تقريبا في صور 200 kV35 ، مما يعني أن جزيئات أقل في طبقة الجليد (عادة ما يكون سمكها 20-50 نانومتر) ستكون في بؤرة التركيز بالكامل وتساهم بشكل بناء في جميع الميزات عالية الدقة لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد المحسوبة ما لم يتم تحسين قيم إلغاء التركيز لكل جسيم بشكل مستقل في المراحل اللاحقة من إجراء إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد. بالنسبة للجسيمات الأكبر حجما (مثل فيروسات icosahedral أو غيرها من التجمعات الجزيئية الكبيرة) ، قد يتجاوز حجم الجسيمات عمق المجال بدقة عالية وإدخال أخطاء الطور بسبب التقريب المستوي لمجال Ewald في خوارزميات إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد القياسية36. يمكن تحسين هذه الأخطاء بواسطة خوارزميات متقدمة تم تنفيذها بالفعل في حزم معالجة الصور cryo-EM الشائعة37،28،39. نظرا لأن كرة Ewald لديها انحناء أكبر في بيانات 200 kV من بيانات 300 kV ، فإن تصحيح مجال Ewald مطلوب بدقة أقل نسبيا و / أو للتجمعات الجزيئية الكبيرة الأصغر نسبيا عند استخدام TEMs 200 kV. من ناحية أخرى ، تظهر صور 200 كيلو فولت تباينا أعلى للجسيمات في الجليد الرقيق (20-50 نانومتر) وهو أرق بكثير من المسار الحر للإلكترون المتوسط 200-300 كيلو فولت (220-280 نانومتر). يساعد التباين الأعلى على تحسين المحاذاة العالمية الصحيحة للجسيمات الفردية ، خاصة بالنسبة للبروتينات الصغيرة المبعثرة بشكل ضعيف والتي لم يعرف هيكلها بعد ، ولم يتم بعد تأسيس النموذج المرجعي 3D بشكل جيد.

هنا ، أثبتنا على مثال بروتيازوم 20S أنه يمكن تحسين تباين الصورة وجودتها بالمثل باستخدام مرشح طاقة عند استخدام مجهر TEM 200 كيلو فولت. باستخدام نفس العدد من الجسيمات ، أعيد بناء البيانات التي تم جمعها باستخدام شق 20 eV إلى دقة 2.26 Å مقارنة بالبيانات التي تم جمعها باستخدام شق الطاقة المفتوح بالكامل والذي أعيد بناؤه فقط إلى دقة 2.34 Å. تم تحقيق أفضل إعادة بناء من البيانات التي تم جمعها باستخدام الشق 10 eV الذي أعيد بناؤه إلى دقة 2.14 Å. وتتفق هذه النتائج مع التنبؤ النظري بأن تصفية الإلكترونات المتناثرة بشكل غير مرن تزيد من SNR في الصور المجمعة وتسهل دقة أعلى في عمليات إعادة بناء cryo-EM من العدد المحدد من الجسيمات، كما هو موضح في الجدول 4. تم تأكيد هذه النتائج بشكل أكبر من خلال العوامل B المحسوبة من مجموعات البيانات هذه التي تشير إلى جودة أعلى للصور في مجموعات البيانات التي تمت تصفيتها بالطاقة.

لذلك يمكننا أن نستنتج أنه في حين أن مجاهر TEM 300 كيلو فولت توفر أعلى إنتاجية وأعلى دقة ممكنة في عمليات إعادة بناء cryo-EM ، فإن مجاهر TEM 200 kV توفر أيضا مجموعات بيانات عالية الجودة لإعادة بناء cryo-EM عالية الدقة. لقد أظهرنا هنا أنه يمكن تحسين جودة الصور المكتسبة ، وبالتالي الوقت الإجمالي للهيكل ، باستخدام TEM 200 kV المجهز بمرشح طاقة وكاشف إلكترون مباشر. يصف البروتوكول المقدم جميع الخطوات اللازمة حول كيفية الحصول بشكل روتيني على بيانات cryo-EM عالية الدقة باستخدام هذا الإعداد والكشف عن التفاصيل الهيكلية الدقيقة للهياكل الجزيئية الكبيرة 3D ، والتي تعد ضرورية لفهم العلاقات الرئيسية بين البنية والوظيفة في البيولوجيا الهيكلية وتصميم الأدوية القائمة على الهيكل.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

اي.

Materials

AutoGrid rings Thermo Fisher Scientific 1036173 Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 Package of 100 clips that secure
the standard EM grids inside the AutoGrid rings.
Data Management Platform Thermo Fisher Scientific 1160939 Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software
EPU Quality Monitor Thermo Fisher Scientific 1179770
EPU Software Thermo Fisher Scientific 1025080 Part of the Glacios base configuration
Ethane 3.5 Westfalen A06010110 Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)
Falcon 4 200kV Thermo Fisher Scientific 1166936 Direct electron detector
Glacios Thermo Fisher Scientific 1149551 200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification Quorum N/A also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
QuantiFoil grids Quantifoil N/A R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid
Relion MRC Laboratory of Molecular Biology N/A open source software:
https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191753 Energy filter
Selectris X with Falcon
4 for 200 kV		 Thermo Fisher Scientific 1191755 Energy filter
UltrAuFoil grids Quantifoil N/A R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids
Vitrobot Mk. IV Thermo Fisher Scientific 1086439 Automated vitrification system
Whatman 595 filter paper Thermo Fisher Scientific AA00420S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
  2. Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor – auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
  3. Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
  4. Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
  5. Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
  6. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  7. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
  8. Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
  9. Walls, A. C., Park, Y. -. J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
  10. Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
  11. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
  12. Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
  13. Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , (2021).
  14. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
  15. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  16. Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
  17. Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
  18. Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
  19. Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
  20. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  25. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  27. Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
  28. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  29. Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  30. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  31. Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
  32. Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
  33. Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
  35. Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
  36. DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
  37. Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
  38. Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
  39. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).

Tags

Cryo-EM200 KV TEMHigh-resolutionProtein StructureProtein ComplexesMolecular MechanismsStructure-based Drug DesignApoferritinProteasomeAuto GridsLiquid NitrogenAutomated Data CollectionAtlasEPU

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koh, A., Khavnekar, S., Yang, W., Karia, D., Cats, D., van der Ploeg, R., Grollios, F., Raschdorf, O., Kotecha, A., Němeček, D. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J. Vis. Exp. (181), e63519, doi:10.3791/63519 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image