Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

A rodopsina ativada pela luz (R), que é um receptor acoplado à proteína G (GPCR), é composta por uma proteína transmembrana 7 (opsina) e um cromoforo. Em Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), a absorção de fótons induz a isomerização do cromo de 11-cis-3-OH-retinal ao todo trans-3-OH-retinal ¹, promovendo a mudança conformacional da rhodopsina para metarhodopsina (M, Figura 1A). Ao contrário da rodopsina vertebrado, a fração predominante do cromoforoto invertebrado não se dissocia da opsina, resultando no estado de pigmento fisiologicamente ativo e estável M. Por sua vez, a absorção adicional de fótons pelo cromoforo de retina totalmente trans-3-OH induz isomerização do cromoforo ^2,3, gerando o estado de pigmento R com o cromotorgico 11-cis-3-OH-retinal. O estado R é um fotopigment escuro, estável e fisiologicamente não ativo. Além da rota de regeneração de fótons extremamente rápida do cromoforo⁴, assim como os fotopigmentos de vertebrados, existe uma rota lenta enzimática alternativa para a regeneração do cromóforo em invertebrados, em que alguns dos estágios são realizados em células da retina ao redor das células fotorreceptores ^5,6.

A drosophila implica grandes vantagens como organismo modelo para estudar fotorreceptores invertebrados. Em particular, a acessibilidade da preparação e a capacidade de aplicar genética molecular tornaram o Drosophila um poderoso sistema modelo⁷. Assim, foram estabelecidos diversos métodos experimentais in vivo e ex vivo para o estudo da fototransdução em geral e em níveis de fotopigment, em particular. O método in vivo mais simples explora a resposta de tensão extracelularmente relativamente grande à luz do olho drosophila. Assim, a estimulação da luz evoca uma resposta de tensão elétrica em todo o olho que pode ser medida usando o registro de eletroretinograma extracelular (ERG), que é ~3 ordens de magnitude maior que a resposta ERG à luz dos olhos vertebrados ^8,9. A resposta Drosophila ERG é robusta e facilmente obtida, o que o torna um método conveniente para identificar anormalidades na resposta à luz devido a mutações. A resposta do ERG à luz surge principalmente dos fotorreceptores, células pigmentantes (glia) e neurônios secundários da lâmina (ver Figura 1B). Os principais componentes do ERG são (i) a resposta de tensão extracelular dos fotoreceptores, (ii) os transitórios “on” e “off” no início e no fim do estímulo de luz que surgem dos neurônios lamina (Figura 2A, inset, ON, OFF), (iii) a resposta lenta das células glia (Figura 2A, inset, setas) e (iv) o breve e transitório, resposta resultante do deslocamento da carga durante a ativação do fotopigment que precede o ON transitório¹⁰ (Figura 2C [inset], D, E). Esta breve resposta é composta de duas fases (M1 e M2, Figura 2C [inset]) e só pode ser induzida por estimulação de luz extremamente forte, que ativa simultaneamente milhões de moléculas de fotopigment. Não é observada sob estimulação azul (Figura 2D, traço azul) nem em mutantes com níveis de fotopigment altamente reduzidos (Figura 2E, traço vermelho), mas sua amplitude é levemente aumentada em um mutante que abolia a atividade do PLC (Figura 2E, traço laranja). A fase M1 é um ERP típico da mosca decorrente da ativação de M nos fotorreceptores. A fase M1, que tem uma polaridade positiva (intracelularmente), libera um neurotransmissor da maneira normal em uma sinapse invertida de sinais e ativa os neurônios de lâmina, que respondem à despolarização do fotoreceptor gerando a fase M2 sintáticamente amplificada. Assim, ambas as fases M1 e M2 refletem a ativação M^10,11.

A despolarização do fotoreceptor gera o transitório “on” córnea-positivo, decorrente da sinapse invertida entre o axônio fotorreceptor e os neurônios monopolares da lamina^10,11 (Figura 1B). O lento aumento e decadência do ERG surge da despolarização das células pigmentadas (Figura 2A, inset, setas) principalmente devido ao Efflux K⁺ das células fotorreceptoras¹² através dos canais receptores transitórios (TRP) e TRP-like (TRPL) 13,14,15. Esses componentes cinéticos lentos mascaram e distorcem em grande parte a forma de onda da resposta do fotorreceptor quando comparada às gravações intracelulares ou células inteiras da resposta do fotorreceptor à luz ^9,10. Além disso, em iluminação muito forte, pode ser observada uma resposta transitória adicional, que precede e se funde parcialmente com o transitório “on”, (Figura 2C [inset],D,E). Este sinal se origina diretamente da ativação maciça do fotopigmento¹⁰.

Vários protocolos de regime de luz utilizando densidade neutra (ND) e filtros de cores, bem como fortes flashes iluminados, foram desenvolvidos para investigar o olho em geral e a cascata de fototransdução em particular. Esses protocolos também têm sido usados para investigar as propriedades do fotopigment.

O protocolo de intensidade-resposta mede o pico de amplitude da resposta de tensão ERG de todo o olho ao aumento das intensidades de luz (Figura 2A,B). Este protocolo auxilia na detecção de alterações na sensibilidade das células fotorreceptoras à luz⁹.

O protocolo de despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora as diferenças nos espectros de absorção de rhodopsin e metarhodopsina que permite, em Drosophila, uma conversão maciça de fotopigment de R para seu estado intermediário fisiologicamente ativo e estável escuro^{M 2}. Na resposta de tensão ERG, é dado um pulso relativamente curto de luz saturada, e a resposta de tensão resultante é registrada. Sob essa condição, um teto (potencial de reversão) é atingido pelo sinal de despolarização porque a ativação de uma fração de por cento da enorme quantidade de moléculas de rodopsina (~1 x 10⁸) é suficiente para atingir o teto. A presença dos componentes de fototransdução em grande abundância garante que este teto seja atingido mesmo em mutantes com uma redução significativa na concentração ou defeito sutil dos componentes de fototransdução. Esta situação impede o isolamento desses mutantes. Pak et al. introduziram a triagem PDA⁷ buscando um teste confiável e revelador para isolar mutantes visuais. Em Drosophila, a resposta do PDA é provocada pela remoção genética do pigmento de triagem vermelho, que permite a conversão de fotopigment, e a aplicação da luz azul, que é preferencialmente absorvida por rodopsina (Figura 3A) e, assim, resulta em uma grande conversão líquida do R para o estado de fotopigmentação M. A terminação de fototransdução é interrompida ao nível do fotopigment por uma grande conversão líquida de R para M, o que, por sua vez, resulta em excitação sustentada muito depois que a luz é desligada (Figura 2C, Figura 4A [topo]). Durante o período PDA, os fotorreceptores são menos sensíveis às luzes de teste subsequentes e são parcialmente dessensibilizados (inativados). O PDA detecta mesmo pequenos defeitos na biógnese de rodopsina e testa a capacidade máxima da célula fotorreceptora para manter a excitação por um longo período. Uma vez que depende estritamente da presença de altas concentrações de rodopsina, ele pontua facilmente para reposição deficiente dos componentes de fototransdução. Notavelmente, a tela do PDA rendeu muitos mutantes visuais novos e muito importantes (revisados em Pak et ^al.7). Assim, os mutantes do PDA isolados por Pak et ^al.7 ainda são extremamente úteis para analisar o sistema visual Drosophila .

O PDA é induzido em Drosophila pela saturação da luz azul, resultando em despolarização contínua muito tempo após o deslocamento da luz (Figura 4A [topo]). Após saturar a luz azul indutora de PDA, os fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecem continuamente ativos no escuro em sua capacidade máxima, atingindo a saturação. Luzes azuis saturadas adicionais durante o PDA não produzem nenhuma resposta adicional em células R1-6 por muitos segundos, mas induzem uma resposta em células R7-8 que é sobreposta ao PDA. As respostas sobrepostas são explicadas pelos diferentes espectros de absorção dos fotopigmentamentos expressos nessas células (R7-8)¹⁶. O PDA pode ser suprimido pela fotoconversão de M de volta para R com luz laranja saturada (Figura 4A [topo]). A capacidade do PDA de trazer as células fotorreceptoras à sua capacidade ativa máxima, uma situação que não pode ser alcançada pela luz branca intensa, explica por que tem sido uma ferramenta importante para a triagem de mutantes visuais de Drosophila. Isso porque permite a detecção de pequenos defeitos em proteínas envolvidas na biogênese dos níveis normais de fotopigment^17,18. Dois grupos de mutantes defeituosos do PDA foram isolados: nem inativação nem pós-potencial (nina) mutantes e inativação, mas não após mutantes (ina) ina. O fenótipo do primeiro é a falta de um PDA e a inativação associada decorrente de uma grande redução nos níveis de fotopigment (Figura 4A [meio]). O fenótipo deste último mostra inativação, mas sem despolarização escura após a luz azul devido a um mecanismo ainda desconhecido no mutante com níveis normais de rodopsina, mas sem proteínas interagindo com os canais TRP (Figura 4A [inferior]).

O PDA decorre da diferença na quantidade de fotopigment em relação à prisão (ARR2), que vincula e encerra a atividade M 19,20,21 (Figura 1A). Em fotorreceptores de Drosophila, a quantidade do fotopigment é cerca de cinco vezes maior que a quantidade de ARR2¹⁹. Assim, os níveis de ARR2 são insuficientes para inativar todas as moléculas M geradas por uma grande fotoconversão líquida de R a M, deixando um excesso de M constantemente ativo no escuro 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica a eliminação da resposta do PDA por mutações ou por privação de^{carotenoides 24,25}, causando uma redução no nível de fotopigment, mas não afeta os níveis de detenção. Além disso, essa explicação também explica os fenótipos do alelo mutante ARR2 (arr2³)²¹, no qual o PDA poderia ser alcançado em intensidades de luz azul 19,20,21 (Figura 4B,C). O PDA não é uma característica única de fotorreceptores de mosca, e aparece em todas as espécies testadas que tem M estável escuro com um espectro de absorção diferente do estado R, permitindo fotoconversão suficiente do fotopigment do R para o estado M. Uma espécie minuciosamente investigada em que a fenomenologia do PDA foi descoberta é o fotoreceptor de craca (Balanus), no qual o espectro de absorção do estado R está em um comprimento de onda mais longo do que o estado M² (Figura 3B). Assim, ao contrário da situação na mosca, na craca, a luz laranja-vermelha induz um PDA, enquanto a luz azul suprime o PDA².

O protocolo de potencial receptor (ERP) inicial explora o deslocamento de carga que ocorre durante a ativação de R ou M. O pigmento visual é parte integrante da membrana superficial do compartimento de sinalização das membranas vertebrados e invertebrados³. Assim, o processo de ativação em que as moléculas de fotopigmento mudam de um estado intermediário para o outro é acompanhado por um deslocamento^de carga ^4,26. Como as moléculas de fotopigmentão estão eletricamente alinhadas em paralelo com a capacitância da membrana⁴, uma rápida mudança conformacional sincronizada gera uma rápida mudança de polarização da membrana superficial, que, em moscas, ocorre no compartimento de sinalização composto por uma pilha de ~30.000-50.000 microvilli chamado rabdomi. Essa polarização então descarrega passivamente através da capacitância da membrana do corpo celular até que a membrana celular esteja igualmente polarizada. O ERP é a gravação extracelular do deslocamento da carga. O ERP registrado intracelularmente manifesta o ERP extracelular integrado pela constante de tempo da membrana^{celular 4,27,28}. A corrente ativada pelo deslocamento da carga de pigmento visual também poderia ser medida em gravações de tensão-grampo de tensão de células inteiras^29,30 (Figura 5A-D), com a maior vantagem (nas gravações de corrente receptora precoce (ERC) de minimizar o efeito da capacitância da membrana na cinética do sinal.

A seção de protocolo descreve como realizar medições de ERG a partir de medições de olho Drosophila ⁹ e ERC por gravações de células inteiras de Drosophila isolada ommatidia^31,32. Também descrevemos protocolos específicos que são usados para investigar a fototransdução em geral e fotopigments em particular.