מודל מכרסמים משופר של איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה
Summary
מודל איסכמיה-רפרפוזיה שריר הלב של לב חולדה משופר על ידי שימוש ב- retractor מתוצרת עצמית, צינור פוליוויניל כלוריד ושיטת קשר ייחודית. אלקטרוקרדיוגרמה, טריפנילטרזוליום כלוריד וכתמים היסטולוגיים, ותוצאות ניתוח הישרדות באחוזים הראו כי לקבוצת המודל המשופרת יש שיעורי הצלחה והישרדות גבוהים יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת כבר.
Abstract
איסכמיה שריר הלב ופגיעה ברפרפוזיה (MIRI), המושרה על ידי מחלת לב כלילית (CHD), גורמת נזק לקרדיומיוציטים. יתר על כן, עדויות מצביעות על כך שטיפול טרומבוליטי או התערבות כלילית מלעורית ראשונית (PPCI) אינם מונעים פגיעה ברפרפוזיה. עדיין אין מודל חייתי אידיאלי עבור MIRI. מחקר זה נועד לשפר את מודל MIRI בחולדות כדי להפוך את הניתוח לקל יותר ובר ביצועי יותר. שיטה ייחודית להקמת MIRI מפותחת על ידי שימוש בצינור רך במהלך שלב מפתח של התקופה האיסכמית. כדי לחקור את השיטה הזו, שלושים חולדות חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות: קבוצת שאם (n = 10); קבוצת מודל ניסיוני (n = 10); וקבוצת מודל קיימת (n = 10). ממצאים של צביעת טריפנילטרזוליום כלוריד, אלקטרוקרדיוגרפיה ואחוז הישרדות מושווים כדי לקבוע את הדיוקים ושיעורי ההישרדות של הניתוחים. בהתבסס על תוצאות המחקר, הוסק כי שיטת הניתוח המשופרת קשורה לשיעור הישרדות גבוה יותר, מקטע ST-T גבוה יותר וגודל אוטם גדול יותר, אשר צפוי לחקות את הפתולוגיה של MIRI טוב יותר.
Introduction
מחלות לב איסכמיות הן הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם. לתמותה קרדיווסקולרית יש תפקיד מכריע בבריאות הציבור ובאפידמיולוגיה ברחבי העולם1. איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה ממלאים תפקידים חיוניים במחלת לב איסכמית, המתייחסת לתהליך פתופיזיולוגי מורכב הכולל דלדול של אדנוזין טריפוספט2, ייצור מופרז של מיני חמצן תגובתי3, תגובות דלקתיות4, ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה עקב עומס יתר של סידן5, המפעיל אוטם שריר הלב חריף באמצעות תפקוד מטבולי ונזק מבני6.
עם זאת, המנגנונים המפורטים העומדים בבסיס איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה (MIRI) עדיין אינם ידועים. העבודה הנוכחית נועדה לפתח מודל חייתי ייחודי המדמה כראוי את ההצגה הקלינית והטיפול ב-MIRI. אחרת, בתהליך של מחקר מודל MIRI, בעלי חיים גדולים7 (כגון חזירים) דורשים ניתוח התערבותי, וזה יקר. בעלי חיים קטנים (כגון ארנבות8, עכברים 9,10,11,12 וחולדות 13) זקוקים לניתוח עדין תחת מיקרוסקופיה10, שקים נשלטים מרחוק 8,11, או סחיטת הלב מתוך חלל 9, הדורשת רמה גבוהה של טכנולוגיה ועלולה לגרום למספר סיבוכים לאחר הניתוח המפריעים לדיוק הממצאים. מודל MIRI אידיאלי עם שיעור הישרדות גבוה יותר ועלות נמוכה יותר ימלא תפקיד מכריע במחקר פתולוגי.
מחקר זה נועד להילחם בסוגיות אלה על ידי הקמת מודל נגיש וישים יותר של MIRI בחולדות כדי להקל על המחקר על הפתולוגיה של MIRI, אשר יכול להוביל לגילוי של טיפולים קליניים עבור MIRI.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההבדל העיקרי בין השיטות הקיימות כבר לבין השיטות המשופרות היה השימוש בצינורות PVC בתהליך ההצמדה. בשיטת הניתוח הקיימת, רקמת שריר הלב נקשרה באמצעות תפר משי 6-0 בלבד, מה שגרם נזק לשריר הלב במהלך קשירת וכתוצאה מכך למוות תוך ניתוחי. יתר על כן, הפעימה של הלב תשחרר את ההחלקה. לעומת זאת, בשיטה המשופרת עם צינור ה-PVC, ניתן היה להדק את ההחלקה שהונחה בחריץ של הצינור, ולהגדיל את שטח שריר הלב המושפע מהקשירה. יתרונות אלה נצפו במהלך ההליך הניסיוני ואושרו על ידי צביעת TTC וממצאי ההישרדות באחוזים.
השלב הקריטי של שיטת הניתוח המשופרת היה הנחת הצינור הרך על העורק הכלילי הפרוקסימלי LAD, מלווה בעצבים, כלי הלימפה ורקמת שריר הלב במהלך קשירת התקופה האיסכמית. צינור רך מוכן מראש זה יכול לשמש כרית המגנה על הרקמות ההיקפיות (עצבים, מיוקרדיה וכלי הלימפה) ומפחיתה את התמותה במהלך קשירת עורקים כליליים. הניתוח שבוצע בשיטה הקיימת כבר היה דומה לניתוח לאוטם שריר הלב. ממצאי ההישרדות באחוזים הצביעו על כך שחולדות בקבוצת המודל הקיימת מתו בעיקר בתקופה האיסכמית (שתי חולדות מתו ב-2 דקות לאחר ההדבקה, ושתי חולדות מתו ב-45 דקות לאחר ההצמדה). אחרת, הסיבות הבסיסיות למוות עדיין אינן ברורות, וישנן שורה של השערות, כולל נזק נוסף למבני העצבים23, כלי הלימפה והמיוקרדיה.
לגבי פגיעה עצבית, מחקרים קודמים הצביעו על כך שבמהלך התקופה האיסכמית במודל החי, מלבד ההשפעות המקומיות הישירות של איסכמיה על מבני העצבים, יש גם כנראה ירידה משמעותית ברמות הנוירופפטיד Y (NPY) התורמות להפרעות בהובלה אקסופלסמית בעצבנות הסימפתטית24. ממצא זה מסכים עם התוצאות שדווחו על ידי Han et al.25, שגילו כי היעלמות הדרגתית של NPY התרחשה בתוך שריר הלב האוטם לאחר קשירת העורק הכלילי LAD בחולדות. עם זאת, תפקידו של NPY בהקשר זה עדיין אינו ברור. מחיקתו מחלישה תפקוד לקוי של הלב ואפופטוזיס במהלך אוטם שריר הלבהחריף 26, והיא קשורה להפרעת קצב27, לחץ דם גבוה ותפקוד מיקרו-וסקולרי כלילי28.
יתר על כן, חסימה שלילית של זרימת הלימפה הלבבית התרחשה במהלך התקופה האיסכמית, מה שהוביל לבצקת לב קשה, תפקוד לקוי שמאלי ודימומים29, אשר עשויים להיות גורם נוסף למוות בחולדות. במהלך תהליך פתולוגי זה, ניתן לייחס את הליגטורה של העורק הכלילי LAD לחסימה של עורקים כליליים או הובלה לימפתית לבבית בתוך אזור האוטם, אשר יכול לגרום לסיבוכים נוספים, כגון שיפוץ שלילי של הלימפה של אספן אפיקרדיאלי, זרימת הלימפה מופחתת, ובצקת מתמשכת30.
לכן, זרימת הדם בכלי הלימפה ממלאת תפקיד פונקציונלי בהומאוסטזיס לבבי31 ובריפויפצעים 32, וממצאי ההישרדות באחוזים במחקר זה מצביעים על כך שההליך הכירורגי המשופר של MIRI עשוי למנוע נזק לימפטי ולקדם רפרפוזיה לימפטית על ידי הנחת הצינור הרך על העורק הכלילי LAD במהלך הליגטורה. לשם השוואה, שיטת הניתוח הקיימת נוטה יותר לקרוע את שריר הלב ולגרום לדימום מסיבי במהלך קשירת העורק הכלילי LAD, ללא אפקט הריפוד של הצינור הרך. בנוסף, קוטר הצינור הרך שהוכן מראש היה גדול בהרבה מתופר המשי 6-0, וייתכן שהצינור התכווץ וגרם לגודל אוטם גדול יותר כאשר ההחלקה נקשרה לצינור במהלך התקופה האיסכמית.
למחקר זה היו כמה מגבלות. גודל האוטם של הלב נותח בניסוי הראשוני. נוסחת ההחלפה (N = 7.75) חושבה באמצעות משוואה33 שדווחה בעבר. בהתחשב במוות אפשרי של חולדות במהלך הניתוח, N הועלה ב -25%; לפיכך, n = 10 (עשר חולדות לכל קבוצה) הוחלט. אחרת, בשיטה הקיימת כבר ליצירת מודל MIRI היה שיעור תמותה גבוה. לכן, מקרים מעטים (גודל מדגם נמוך) בקבוצת המודל הניסויי השפיעו על הממצאים הסטטיסטיים. מספר הערכות, כולל אקוקרדיוגרפיה30, צביעה כחולה של אוונס34 ומדידת אנזים שריר הלב35, היו חיוניות להערכה ולניתוח של תפקוד הלב. בשל גודל המדגם הנמוך של עבודה זו, הערכות אלה לא בוצעו ויתואר במחקר עתידי של מחקר פרמקודינמי ב- MIRI. עם זאת, בהתחשב בכך שההליך הכירורגי הקיים ליצירת מודל MIRI קשור לנזק נרחב בשריר הלב, כדאי לדווח על שיטה נוכחית זו כדי לשפר את המידול של MIRI בחולדות ולהביא אור למודל פרה-קליני זה המדמה נכונה מחלת לב איסכמית.
לסיכום, לשיטת הניתוח המשופרת ליצירת מודל MIRI היה שיעור הישרדות גבוה יותר, סגמנט ST-T גבוה יותר וגודל אוטם גדול יותר משיטת יצירת מודל MIRI הקיימת, מה שמרמז על כך שהמודל המשופר מדמה טוב יותר את הפתולוגיה של MIRI.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מנהל הרפואה הסינית המסורתית [SLJ0204], בית החולים המחוזי ג’יאנגסו לרפואה סינית (Y21017), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [81973763, 81973824,82004239].
Materials
| 10% Neutral Formalin | Chunyu, China | _ | |
| 2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride | Solarbio, China | T8107 | |
| 75% Alchol | SCR, China | 10009261 | |
| Artery Clip | Zhonglin Dongsheng, China | 6.5cm | |
| Camera | Olympus Corporation, Japan | EPL5 | |
| Cotton ball | Huachen, China | _ | |
| Dpilatory cream | Veet, China | _ | |
| Eye speculum | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
| Gauze | Zhonggan, China | _ | |
| GraphPad | GraphPad Software, USA | 8.0 | |
| H&E Kit | Solarbio, China | G1120 | |
| High-pressure steam sterilizer | TOMY, Japan | SX-500 | |
| ImageJ | NIH, USA | _ | |
| Masson Kit | Solarbio, China | G1340 | |
| Medical Tape | Mr.Song, China | _ | |
| Microscope | Olympus Corporation, Japan | CKX31 | |
| Microscopy | TEKSQRAY, China | _ | |
| Microtome | Leica, Germany | RM2235 | |
| Microtome Blade | Leica, Germany | 819 | |
| Needle holder | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
| Ophthalmic tweezers | Shanghai Jingzhong, China | _ | |
| Paper clip | Chenguang, China | ABS91613 | |
| Physiological saline solution | Kelun, China | _ | |
| Powerlab ECG | ADINSTRUMENTS ,China | 4/35 | |
| PVC tube | Guanzhijia, China | _ | |
| Small animal ventilator | TECHMAN, China | HX-101E | |
| Sodium Pentobarbital | SIGEMA, USA | 1030001 | |
| Suction trocar | TECHMAN, China | HX-101E | |
| Suture line | Lingqiao, China | 4-0 | |
| Suture needle with thread | Shanghai Pudong Jinhua Medical Products Co LTD, China | 6-0 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American heart association. Circulation. 133 (4), 38 (2016).
- Allen, D. G., Orchard, C. H. Myocardial contractile function during ischemia and hypoxia. Circulation Research. 60 (2), 153-168 (1987).
- Ashraf, M. I., et al. A p38MAPK/MK2 signaling pathway leading to redox stress, cell death and ischemia/reperfusion injury. Cell Communication and Signaling. 12, 6 (2014).
- Hernandez-Resendiz, S., et al. The role of redox dysregulation in the inflammatory response to acute myocardial ischaemia-reperfusion injury – adding fuel to the fire. Current Medicinal Chemistry. 25 (11), 1275-1293 (2018).
- Heidrich, F., et al. The role of phospho-adenosine monophosphate-activated protein kinase and vascular endothelial growth factor in a model of chronic heart failure. Artificial Organs. 34 (11), 969-979 (2010).
- Shen, Y., Liu, X., Shi, J., Wu, X. Involvement of Nrf2 in myocardial ischemia and reperfusion injury. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 496-502 (2019).
- Hinkel, R., et al. AntimiR-21 prevents myocardial dysfunction in a pig model of ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 75 (15), 1788-1800 (2020).
- Torrado, J., et al. Sacubitril/Valsartan averts adverse post-infarction ventricular remodeling and preserves systolic function in rabbits. Journal of the American College of Cardiology. 72 (19), 2342-2356 (2018).
- Guan, L., et al. MCU Up-regulation contributes to myocardial ischemia-reperfusion Injury through calpain/OPA-1-mediated mitochondrial fusion/mitophagy Inhibition. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (11), 7830-7843 (2019).
- Fan, Q., et al. Dectin-1 contributes to myocardial ischemia/reperfusion injury by regulating macrophage polarization and neutrophil infiltration. Circulation. 139 (5), 663-678 (2019).
- Huang, C., et al. Effect of myocardial ischemic preconditioning on ischemia-reperfusion stimulation-induced activation in rat thoracic spinal cord with functional MRI. International Journal of Cardiology. 285, 59-64 (2019).
- Li, D., et al. Cardioprotection of CAPE-oNO2 against myocardial ischemia/reperfusion induced ROS generation via regulating the SIRT1/eNOS/NF-κB pathway in vivo and in vitro. Redox Biology. 15, 62-73 (2018).
- Cui, Y., Wang, Y., Liu, G. Protective effect of Barbaloin in a rat model of myocardial ischemia reperfusion injury through the regulation of the CNPY2PERK pathway. International Journal of Molecular Medicine. 43 (5), 2015-2023 (2019).
- Lin, M. W., et al. Prolonged preoperative fasting induces postoperative insulin resistance by ER-stress mediated Glut4 down-regulation in skeletal muscles. Int J Med Sci. 11 (5), 1189-1197 (2021).
- Wu, J., et al. Sevoflurane alleviates myocardial ischemia reperfusion injury by inhibiting P2X7-NLRP3 mediated pyroptosis. Frontiers in Molecular Biosciences. 26 (8), 768594 (2021).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments. (48), e2464 (2011).
- Zhang, C. X., et al. Mitochondria-targeted cyclosporin: A delivery system to treat myocardial ischemia reperfusion injury of rats. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 18 (2019).
- Liu, X. M., et al. Long non-coding RNA MALAT1 modulates myocardial ischemia-reperfusion injury through the PI3K/Akt/eNOS pathway by sponging miRNA-133a-3p to target IGF1R expression. European Journal of Pharmacology. 916, 174719 (2022).
- Li, L., et al. Ginsenoside Rg3-loaded, reactive oxygen species-responsive polymeric nanoparticles for alleviating myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Controlled Release. 317, 259-272 (2020).
- Mickelson, J. K., et al. Streptokinase improves reperfusion blood flow after coronary artery occlusion. International Journal of Cardiology. 23 (3), 373-384 (1989).
- Verscheure, Y., Pouget, G., De Courtois, F., Le Grand, B., John, G. W. Attenuation by R 56865, a novel cytoprotective drug, of regional myocardial ischemia- and reperfusion-induced electrocardiographic disturbances in anesthetized rabbits. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 25 (1), 126-133 (1995).
- Fan, M. L., et al. Animal model of coronary microembolization under transthoracic echocardiographic guidance in rats. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568 (3), 174-179 (2021).
- Lim, M., et al. Intravenous injection of allogeneic umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells reduces the infarct area and ameliorates cardiac function in a porcine model of acute myocardial infarction. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 129 (2018).
- Trautner, H., et al. Heart innervation after ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). Histochemistry. 92 (2), 103-108 (1989).
- Han, C., Wang, X. A., Fiscus, R. R., Gu, J., McDonald, J. K. Changes in cardiac neuropeptide Y after experimental myocardial infarction in rat. Neuroscience Letters. 104 (1-2), 141-146 (1989).
- Huang, W., et al. Deletion of neuropeptide Y attenuates cardiac dysfunction and apoptosis during acute myocardial infarction. Frontiers in Pharmacology. 10, 1268 (2019).
- Kalla, M., et al. The cardiac sympathetic co-transmitter neuropeptide Y is pro-arrhythmic following ST-elevation myocardial infarction despite beta-blockade. European Heart Journal. 41 (23), 2168-2179 (2020).
- Cuculi, F., et al. Relationship of plasma neuropeptide Y with angiographic, electrocardiographic and coronary physiology indices of reperfusion during ST elevation myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 99 (16), 1198-1203 (2013).
- Vuorio, T., Tirronen, A., Ylä-Herttuala, S. Cardiac Lymphatics – a new avenue for therapeutics. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 28 (4), 285-296 (2017).
- Henri, O., et al. Selective stimulation of cardiac lymphangiogenesis reduces myocardial edema and fibrosis leading to improved cardiac function following myocardial infarction. Circulation. 133 (15), 1484-1497 (2016).
- Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21st century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
- Klotz, L., et al. Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury. Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).
- Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
- Miller, D. L., Li, P., Dou, C., Armstrong, W. F., Gordon, D. Evans blue staining of cardiomyocytes induced by myocardial contrast echocardiography in rats: evidence for necrosis instead of apoptosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (12), 1988-1996 (2007).
- Deng, C., et al. α-Lipoic acid reduces infarct size and preserves cardiac function in rat myocardial ischemia/reperfusion injury through activation of PI3K/Akt/Nrf2 pathway. PLoS ONE. 8 (3), 58371 (2013).
