生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

この方法の目的は、網膜入力がゼブラフィッシュ脳の視覚処理センターである視蓋骨の成長と発達にどのように影響するかを調べることです。片目を取り除いた後、視蓋の両側を比較することで、同一試料内のテクタル変化を観察・正規化することができ、複数の検体間での比較が可能となります。この技術と組み合わせた現代の分子アプローチは、視覚系の成長と発達、ならびに軸索の変性と再生の根底にあるメカニズムへの洞察をもたらすでしょう。

視覚、聴覚、体性感覚などの感覚系は、外部器官から情報を収集し、その情報を中枢神経系に中継し、中脳全体の外界の「マップ」を生成します^1,2。視覚は、多くの魚を含むほぼすべての脊椎動物にとって支配的な感覚様式です。眼の神経組織である網膜は、網膜の投影ニューロンである視受容体、双極性細胞、網膜神経節細胞(RGC)を主体とする神経回路で情報を収集します。RGCは長い軸索を持ち、網膜の内面を横切って視神経頭に向かい、そこで脳を魅了して一緒に移動し、最終的に背側中脳の視覚処理センターで終わる。この構造は、魚類や他の哺乳類以外の脊椎動物では視蓋骨と呼ばれ、哺乳類の優れた丘陵地帯と相同である³。

視蓋骨は、背側中脳における両側対称の多層構造である。ゼブラフィッシュおよび他のほとんどの魚類では、視蓋の各葉は対側眼からのみ視覚入力を受け取るため、左視神経は右眼房で終了し、右視神経は左眼球⁴で終了する(図1)。哺乳類の対応物である上甲骨と同様に、オプティックテクタムは視覚情報をオーディションや身体感覚などの他の感覚入力と統合し、視覚的注意の変化やサッケードなどの眼球運動を制御します^1,5,6。しかし、哺乳類の上斜膜とは異なり、視蓋骨は、テクタル増殖ゾーン⁷と呼ばれるテクタルローブの内側および尾縁付近の特殊な幹細胞ニッチから新しいニューロンおよびグリアを連続的に生成する。視蓋および中枢神経系の他の領域における増殖性前駆細胞の維持は、部分的には、ゼブラフィッシュ⁸に文書化された顕著な再生能力に寄与する。

盲目または片目の魚の脳を調べた以前の研究は、視蓋の大きさが^それが受ける網膜神経支配の量に正比例することが明らかになった ^9,10,11.初期胚発生で目が退化する成体の洞窟魚類では、オプティックテクタムは、近縁の、目の見える表面魚⁹のそれよりも著しく小さい。洞窟魚眼の変性は、胚発生時に内因性レンズを表面魚由来のレンズと交換することによって阻止することができる。これらの片目の洞窟魚が成体期まで飼育されると、神経支配されたテクタルローブは、非神経化されたテクタルローブ⁹よりも約10%多くの細胞を含む。同様に、同じ個体内で異なるサイズの目を生成するために化学的処置を用いて孵化した幼虫キリフィッシュにおいて、より神経支配されたテクタムの側面はより大きく、より多くのニューロン¹⁰を含んでいた。成体金魚における視神経圧潰実験からの証拠は、神経支配が増殖を促進し、神経支配が破壊されるとテクタル細胞増殖が減少することを示している¹¹。

これらの古典的な研究を確認し、拡張して、いくつかの最近の報告は、神経支配に応答した増殖が、少なくとも部分的には、BDNF-TrkB経路^12、13によって調節されることを示唆するデータを提供する。発達中の感覚系が損傷および軸索変性にどのように対処するか、どの細胞および分子シグナルが網膜入力が視蓋成長を調節することを可能にするか、これらのメカニズムがいつアクティブになるか、神経支配に関連した増殖および分化が網膜およびその標的組織が成長速度を調整し、正確な網膜トピックマッピングを確実にすることを可能にするかどうかなど、眼テクタムの成長および発達に関する多くの未解決の疑問が残っている。さらに、活動依存性の発達については、以下に説明するような外科的アプローチでゼブラフィッシュ視覚系を尋問することによって対処できるはるかに大きな質問がある。

神経活動、特に視覚入力からの神経活動が細胞の生存と増殖を変化させる細胞および分子のメカニズムを調べるために、記載されたアプローチは、個々のゼブラフィッシュ幼虫内の神経支配および脱神経化されたテクタルローブ(図1)を直接比較する。この方法は、視蓋におけるRGC軸索変性の文書化および有糸分裂細胞の数が神経支配と相関することを確認することを可能にする。

図1:片側眼除去前後のゼブラフィッシュ幼虫のスケッチ 。 (A)解剖顕微鏡下で見た5 dpf幼虫の図面。各幼虫は、低融点アガロースに埋め込まれ、鋭い引っ掛けられた先端を有するタングステン針が上を向いて眼をすくい取るために使用される前に横方向に向けられる(この例では左目)。(B) Aに描かれた手術から生じた9dpf幼虫の背部図の図面。右目から高度に図式化された3つのRGC軸索のみが、左蓋葉のニューロンと脱魅惑的で連結していることが示されている。略語: dpf = 受精後日数;dps = 手術後の日数;RGC = 網膜神経節細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。