Анализ протеинурии, почечной инфильтрации лейкоцитов и почечного отложения белков у склонных к волчанке МРЛ/ЛПР мышей

Основной функцией почек является выведение токсических веществ через мочу при сохранении гомеостаза воды и солей¹. Эта функция находится под угрозой у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), что приводит к так называемому волчаночному нефриту (ЛН). LN является следствием того, что иммунная система атакует почки, что приводит к постоянному воспалению почек, поэтому она теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости. Это в конечном итоге приведет к почечной недостаточности, которая может быть фатальной. Во время нефритического процесса циркулирующие В-клетки, Т-клетки и моноциты рекрутируются в почку, секретируя хемокины, цитокины и иммунные комплексообразующие аутоантитела. Это в конечном итоге приводит к повреждению эндотелиальных клеток, мембранным повреждениям, атрофии почечных канальцев и фиброзу².

MRL / Mp-Fas^lpr (MRL / lpr) мыши, склонные к волчанке, являются классической моделью мыши, проявляющей волчаноподобные клинические признаки, которые напоминают человеческую СКВ³. Эта модель сыграла важную роль в понимании одной из ведущих причин смертности у пациентов с СКВ, волчаночного нефрита (LN)⁴. Как у человека, так и у мышей СКВ LN характеризуется постепенным воспалением, вызванным почечным отложением иммунных комплексов, за которым следует активация комплемента, набор воспалительных клеток и потеря функции почек⁵. Отложение иммунного комплекса является первым шагом к индуцированию производства хемокина и цитокина внутренними почечными клетками, что расширяет воспалительный ответ путем набора иммунных клеток⁶. Текущий протокол представляет несколько методов для отслеживания прогрессирования почечной недостаточности, которые анализируют инфильтрацию клеток и отложение иммунного комплекса.

Моча, собранная каждую неделю, позволяет обнаружить и визуализировать временное течение протеинурии до, во время и после начала волчанки. Протеинурия как биомаркер может определять биологическую прогрессию ЛН. Другие преимущества этого метода заключаются в том, что он неинвазивный, экономически эффективный и простой в реализации⁷. Когда почка работает отлично, уровень протеинурии стабильно низкий; однако у мышей MRL/lpr после 8-9-недельного возраста наблюдается постепенное повышение уровня протеинурии, который в конечном итоге достаточно высок, чтобы вызвать почечную недостаточность⁸. Несколько полосок реагентов и колориметрических реагентов коммерчески доступны для мониторинга проблемы. Однако брэдфордский анализ дешев и очень точен в определении начала протеинурии и течения волчаночного нефрита. Этот анализ является быстрым, и на реагент не влияет присутствие растворителей, буферов, восстановителей и хелатирующих агентов, которые могут быть в вашем образце ^9,10,11.

Одним из важных аспектов, которые следует учитывать, является инфильтрация клеток в почках. Эти инфильтраты способствуют патогенезу, вызывая секрецию растворимых факторов, таких как цитокины, для усугубления воспаления¹². Чтобы лучше понять, какие клеточные популяции присутствуют в инфильтратах, полезным методом является выделение лейкоцитов¹³. Здесь в качестве примера используется обнаружение почечной инфильтрации В-клеток. Процедура начинается с процесса пищеварения дезоксирибонуклеазой (ДНКаза) и коллагеназой, за которым следует разделение градиента плотности, которое удаляет мусор, эритроциты и плотные гранулоциты. Причина выделения В-клеток (CD19⁺) и плазматических клеток (CD138+) заключается ^в том, что волчаночные почки могут концентрировать эти клетки¹⁴. Предполагается, что наличие В-клеток в небольших агрегатах в почках может свидетельствовать о клональной экспансии и, следовательно, выработке иммуноглобулина (Ig). Хорошо известно, что плазматические клетки присутствуют в этих агрегатах, а также¹⁵. После того, как лейкоциты были выделены, флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS) может быть использована для анализа клеток, представляющих интерес, при окрашивании различными флуоресцентно-конъюгированными антителами.

Иммунофлуоресценция является одним из методов иммуногистохимии (IHC), который позволяет флуоресцентную визуализацию белков в образцах почечной ткани толщиной 4 мкм. Другие методы обнаружения IHC зависят от природы аналитов, химии связывания и других факторов¹⁶. Иммунофлуоресценция — это метод быстрой идентификации, который подвергает антиген воздействию его аналога антитела, меченного специфическим фторхромом (или флуоресцентным красителем). При возбуждении он производит свет, который может обнаружить флуоресцентный микроскоп. Этот метод может быть использован для наблюдения осаждения комплемента C3 и IgG2a¹⁷. Чрезмерная каскадная активация комплемента может быть связана с неконтролируемым иммунным ответом и потерей функции¹⁸. Иммунная депонирование антидвухлопчатых аутоантител ДНК (анти-dsDNA) в почках является основной проблемой¹⁹, где те, у кого изотип IgG2a, были связаны с LN²⁰. В частности, анти-dsDNA антитела проявляют большую патогенность и сродство к ядерным материалам, образуя иммунные комплексы²¹. Когда присутствует IgG2a, каскад комплемента, включая C3, активируется для очистки иммунных комплексов²². Маркеры C3 и IgG2a могут быть количественно определены по отдельности или наложены для установления их корреляции.

Примечательно, что измерение креатинина в сыворотке крови является еще одним надежным методом, который можно использовать вместе с микроскопической гематурией и биопсией почек для диагностики LN²³. Однако наличие протеинурии является сильным показателем повреждения клубочков. В этом смысле мониторинг уровня протеинурии во время волчанки может обнаружить начало заболевания и дополнить другие методы диагностики волчанки. Кроме того, иммунные комплексы, отложенные в клубочках, могут вызывать воспалительную реакцию, активировать систему комплемента и набирать больше воспалительных клеток. Еще одним примечательным моментом этого протокола является инфильтрация В-клеток в почке. Это, вместе с инфильтрированными Т-клетками, усиливает местные иммунные реакции, которые вызывают повреждение органов. Важно отметить, что классификация LN основана не только на клубочковых морфологических изменениях, наблюдаемых в микроскопии, но и на иммунных отложениях, наблюдаемых при иммунофлуоресценции. Поэтому в данном протоколе предлагаются точные и экономически эффективные методы анализа функции почек в лабораторных условиях.