Análises de Proteinúria, Infiltração Renal de Leucócitos e Deposição Renal de Proteínas em Camundongos MRL/lpr propensos a Lúpus

A função primária do rim é a eliminação de substâncias tóxicas através da urina, mantendo a homeostase da água e sais¹. Esta função está ameaçada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE), levando à chamada nefrite lúpus (LN). A LN é uma consequência do sistema imunológico atacar o rim, levando a inflamações renais persistentes, perdendo assim sua capacidade de limpar resíduos do sangue e regular concentrações de sal e fluidos. Isso eventualmente levará à insuficiência renal, que pode ser fatal. Durante o processo nefrástico, células B circulantes, células T e monócitos são recrutados para o rim, secretando quimiocinas, citocinas e autoanticorpos de formação de complexos imunológicos. Isso resulta em danos nas células endoteliais, lesões membranous, atrofia tubular renal e fibrose².

MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) é um modelo clássico de rato que exibe sinais clínicos semelhantes ao lúpus que se assemelham ao SLE³ humano. Este modelo tem sido fundamental na compreensão de uma das principais causas de mortalidade em pacientes com SLE, a nefrite lúpus (LN)⁴. Tanto no SLE humano quanto no camundongo, a LN é caracterizada por inflamação gradual desencadeada pela deposição renal de complexos imunológicos, seguida de ativação complementar, recrutamento de células inflamatórias e perda da função renal⁵. A deposição do complexo imunológico é o primeiro passo para induzir a produção de quimiocina e citocinas por células renais intrínsecas, o que expande a resposta inflamatória recrutando células imunes⁶. O protocolo atual apresenta várias técnicas para acompanhar a progressão da doença renal que analisam a infiltração celular e a deposição do complexo imunológico.

A urina coletada toda semana permite a detecção e visualização do curso de tempo de proteinúria antes, durante e depois do início do lúpus. Proteinúria como biomarcador pode determinar a progressão biológica da LN. Outras vantagens dessa técnica são que ela é não invasiva, econômica e fácil de implementar⁷. Quando o rim está funcionando perfeitamente, o nível de proteinúria é consistentemente baixo; no entanto, em camundongos MRL/lpr, após 8-9 semanas de idade, observa-se um aumento gradual do nível de proteinúria, que eventualmente é alto o suficiente para causar insuficiência renal⁸. Várias tiras de reagente e reagentes colorimétricos estão disponíveis comercialmente para monitorar o problema. No entanto, o ensaio de Bradford é barato e muito preciso na determinação do aparecimento de proteinúria e o curso de nefrite lúpus. Este ensaio é rápido, e o reagente não é afetado pela presença de solventes, buffers, agentes de redução e agentes de corte de metal que podem estar em sua amostra ^9,10,11.

Um aspecto importante a considerar é a infiltração celular no rim. Esses infiltrados promovem a patogênese desencadeando a secreção de fatores solúveis, como citocinas, para piorar a inflamação¹². Para entender melhor quais populações celulares estão presentes nos infiltrados, um método útil é isolar os leucócitos¹³. Aqui, a detecção de infiltração renal de células B é usada como exemplo. O procedimento começa com um processo de digestão com desoxyribonuclease (DNase) e colagenase, seguido pela separação gradiente de densidade que remove detritos, glóbulos vermelhos e granulócitos densos. A razão para isolar células B (CD19⁺) e células plasmáticas (CD138⁺) é que os rins de lúpus podem concentrar essas células¹⁴. Sugere-se que a presença de células B em pequenos agregados no rim pode indicar expansão clonal e, consequentemente, produção de imunoglobulina (Ig). As células plasmáticas são bem conhecidas por estarem presentes nestes agregados, bem como¹⁵. Uma vez que os leucócitos tenham sido isolados, a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para analisar as células de interesse ao coloração com diferentes anticorpos conjugados pela fluorescência.

A imunofluorescência é um dos métodos de detecção de imunohistoquímica (IHC) que permite a visualização fluorescente de proteínas em amostras de tecido renal de 4 μm de espessura. Outros métodos de detecção de IHC dependem da natureza dos analitos, química de vinculação e outros fatores¹⁶. A imunofluorescência é um método de identificação rápida que expõe o antígeno ao seu anticorpo de contrapartida rotulado com um fluorocromo específico (ou um corante fluorescente). Quando excitado, produz luz que um microscópio de fluorescência pode detectar. Esta técnica pode ser usada para observar a deposição do complemento C3 e IgG2a¹⁷. A ativação excessiva da cascata de complementos pode estar associada a uma resposta imune descontrolada e perda de função¹⁸. A deposição imune de autoanticorpos de DNA anti-dsDNA (anti-dsDNA) no rim é uma grande preocupação¹⁹, onde aqueles com isótipo IgG2a foram associados com LN²⁰. Especificamente, anticorpos anti-dsDNA apresentam mais patogenicidade e afinidade com materiais nucleares, formando complexos imunológicos²¹. Quando o IgG2a está presente, a cascata complementar, incluindo c3, é ativada para limpar os complexos imunológicos²². Os marcadores C3 e IgG2a podem ser quantificados individualmente ou sobrepostos para estabelecer sua correlação.

Notavelmente, a medição da creatinina sé serum é outra técnica confiável que pode ser usada em conjunto com hematuria microscópica e biópsias renais para diagnosticar LN²³. No entanto, a presença de proteinúria é um forte indicador de danos glomerulares. Nesse sentido, o monitoramento do nível de proteinúria durante o lúpus pode detectar o aparecimento da doença e complementar outros métodos para o diagnóstico de lúpus. Além disso, os complexos imunológicos depositados em glomeruli podem induzir uma resposta inflamatória, ativar o sistema complementar e recrutar mais células inflamatórias. Outro ponto importante deste protocolo é a infiltração de células B no rim. Isso, juntamente com as células T infiltradas, amplifica as respostas imunes locais que desencadeiam danos nos órgãos. É importante ressaltar que a classificação da LN não se baseia apenas em alterações morfológicas glomerulares vistas na microscopia, mas também depósitos imunológicos observados com imunofluorescência. Portanto, neste protocolo, métodos precisos e econômicos para a análise da função renal são oferecidos em ambientes laboratoriais.