ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת

תפקידה העיקרי של הכליה הוא חיסול חומרים רעילים באמצעות שתן תוך שמירה על הומאוסטזיס של מים ומלחים¹. פונקציה זו מאוימת בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מה שמוביל למה שמכונה זאבת נפריטיס (LN). LN הוא תוצאה של מערכת החיסון התוקפת את הכליה, מה שמוביל לדלקת כליות מתמשכת, ולכן מאבד את יכולתו לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים. זה יוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות, אשר יכול להיות קטלני. במהלך התהליך הנפריטי, תאי B במחזור, תאי T ומונוציטים מגויסים לכליה, ומפרישים כימוקינים, ציטוקינים ונוגדנים עצמיים יוצרי קומפלקס חיסוני. התוצאה היא בסופו של דבר נזק לתאי האנדותל, פציעות ממברניות, ניוון צינורית הכליה ופיברוזיס².

עכברי MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) הנוטים לזאבת הם מודל עכברים קלאסי המציג סימנים קליניים דמויי זאבת הדומים ל-SLE³ אנושי. מודל זה סייע בהבנת אחד הגורמים המובילים לתמותה בחולי SLE, זאבת נפריטיס (LN)⁴. הן ב- SLE אנושי והן בעכבר, LN מאופיין בדלקת הדרגתית המופעלת על ידי תצהיר כלייתי של מתחמי חיסון, ואחריו הפעלה משלימה, גיוס תאי דלקת ואובדן תפקוד כלייתי⁵. תצהיר הקומפלקס החיסוני הוא הצעד הראשון להשראת ייצור כימוקין וציטוקינים על ידי תאי כליה פנימיים, המרחיבים את התגובה הדלקתית על ידי גיוס תאי חיסון⁶. הפרוטוקול הנוכחי מציג מספר טכניקות למעקב אחר התקדמות מחלת כליות המנתחות חדירת תאים ותצהיר קומפלקס חיסוני.

שתן שנאסף מדי שבוע מאפשר זיהוי והדמיה של מהלך הזמן של פרוטאינוריה לפני, במהלך ואחרי הופעת זאבת. פרוטאינוריה כסמן ביולוגי יכולה לקבוע את ההתקדמות הביולוגית של LN. יתרונות נוספים של טכניקה זו הם שהיא לא פולשנית, חסכונית וקלה ליישום⁷. כאשר הכליה פועלת בצורה מושלמת, רמת הפרוטאינוריה נמוכה באופן עקבי; עם זאת, בעכברי MRL/lpr, לאחר 8-9 שבועות של גיל, נצפתה עלייה הדרגתית של רמת הפרוטאינוריה, שבסופו של דבר גבוהה מספיק כדי לגרום לאי ספיקת כליות⁸. רצועות ריאגנטים מרובות וריאגנטים צבעוניים זמינים מסחרית לניטור הבעיה. עם זאת, מבחן ברדפורד הוא זול ומדויק מאוד בקביעת הופעת פרוטאינוריה ואת מהלך זאבת נפריטיס. בדיקה זו היא מהירה, והמגיב אינו מושפע מנוכחותם של ממסים, מאגרים, חומרים מחזרים וחומרים מטאליים שעשויים להיות במדגם^שלך 9,10,11^.

היבט חשוב אחד שיש לקחת בחשבון הוא חדירת תאים לכליה. חדירות אלה מקדמות פתוגנזה על ידי הפעלת הפרשת גורמים מסיסים כגון ציטוקינים כדי להחמיר את הדלקת¹². כדי להבין טוב יותר אילו אוכלוסיות תאים נמצאות בחדירות, שיטה שימושית היא לבודד לויקוציטים¹³. כאן, זיהוי של חדירה כלייתית של תאי B משמש כדוגמה. ההליך מתחיל בתהליך עיכול עם deoxyribonuclease (DNase) ו collagenase, ואחריו הפרדת גרדיאנט צפיפות המסירה פסולת, כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים צפופים. הסיבה לבידוד תאי B (CD19+) ותאי פלזמה (CD138⁺) היא שכליות זאבת יכולות לרכז את התאים האלה¹⁴. הוא הציע כי נוכחות של תאי B באגרגטים קטנים בכליה יכולה להצביע על התרחבות clonal, וכתוצאה מכך, ייצור אימונוגלובולין (Ig). ידוע כי תאי פלזמה נמצאים באגרגטים אלה גם¹⁵. לאחר בידוד לויקוציטים, ניתן להשתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לנתח את התאים המעניינים בעת צביעה בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים שונים.

אימונופלואורסצנציה היא אחת משיטות הזיהוי האימונוהיסטוכימיה (IHC) המאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של חלבונים בדגימות רקמת כליה בעובי 4 מיקרומטר. שיטות גילוי IHC אחרות תלויות באופי האנליטים, בכימיה המחייבת ובגורמים אחרים¹⁶. אימונופלואורסצנציה היא שיטת זיהוי מהירה החושפת את האנטיגן לנוגדן מקבילו המסומן בפלואורוכרום ספציפי (או צבע פלואורסצנטי). כאשר הוא מתרגש, הוא מייצר אור שמיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לזהות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התצהיר של משלים C3 ו IgG2a¹⁷. הפעלה מוגזמת של מפל משלים יכולה להיות קשורה לתגובה חיסונית בלתי מבוקרת ולאובדן תפקוד¹⁸. תצהיר חיסוני של נוגדנים עצמיים נגד דנ”א דו-גדילי (anti-dsDNA) בכליה הוא דאגה מרכזית¹⁹, כאשר אלה עם איזוטיפ IgG2a נקשרו ל-LN²⁰. באופן ספציפי, נוגדנים נגד dsDNA מפגינים יותר פתוגניות וזיקה לחומרים גרעיניים, ויוצרים קומפלקסים חיסוניים²¹. כאשר IgG2a קיים, מפל המשלים, כולל C3, מופעל כדי לנקות את מתחמי החיסון²². ניתן לכמת את סמני C3 ו- IgG2a בנפרד או לכסות אותם כדי לבסס את המתאם ביניהם.

יש לציין כי מדידת קריאטינין בסרום היא טכניקה אמינה נוספת שניתן להשתמש בה יחד עם המטוריה מיקרוסקופית וביופסיות כליות לאבחון LN²³. עם זאת, נוכחות של פרוטאינוריה היא אינדיקטור חזק של נזק גלומרולרי. במובן זה, ניטור רמת הפרוטאינוריה במהלך זאבת יכול לזהות התפרצות מחלה ולהשלים שיטות אחרות לאבחון זאבת. בנוסף, קומפלקסים חיסוניים שהופקדו glomeruli יכול לעורר תגובה דלקתית, להפעיל את מערכת המשלים, ולגייס תאים דלקתיים נוספים. נקודה נוספת ראויה לציון של פרוטוקול זה היא חדירת תאי B לכליה. זה, יחד עם תאי ה-T החודרים, מגביר את התגובות החיסוניות המקומיות שגורמות נזק לאיברים. חשוב לציין כי הסיווג של LN אינו מבוסס רק על שינויים מורפולוגיים גלומרולריים הנראים במיקרוסקופיה, אלא גם על משקעים חיסוניים שנצפו עם אימונופלואורסצנציה. לכן, בפרוטוקול זה, שיטות מדויקות וחסכוניות לניתוח תפקוד הכליות מוצעות במסגרות מעבדה.