Analyses van proteïnurie, renale infiltratie van leukocyten en renale afzetting van eiwitten bij lupusgevoelige MRL / lpr-muizen

De primaire functie van de nier is de eliminatie van giftige stoffen via de urine met behoud van de homeostase van water en zouten¹. Deze functie wordt bedreigd bij patiënten met systemische lupus erythematosus (SLE), wat leidt tot zogenaamde lupus nefritis (LN). LN is een gevolg van het immuunsysteem dat de nier aanvalt, wat leidt tot aanhoudende nierontsteking, waardoor het zijn vermogen verliest om afval uit het bloed te verwijderen en zout- en vloeistofconcentraties te reguleren. Dit zal uiteindelijk leiden tot nierfalen, wat fataal kan zijn. Tijdens het nefritische proces worden circulerende B-cellen, T-cellen en monocyten gerekruteerd naar de nier, waarbij chemokines, cytokines en immuuncomplexvormende auto-antilichamen worden afgescheiden. Dit resulteert uiteindelijk in endotheelcelbeschadiging, vliezige verwondingen, renale tubulaire atrofie en fibrose².

MRL / Mp-Fas^lpr (MRL / lpr) lupus-gevoelige muizen is een klassiek muismodel dat lupus-achtige klinische symptomen vertoont die lijken op menselijke SLE³. Dit model heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van een van de belangrijkste oorzaken van sterfte bij SLE-patiënten, lupus nefritis (LN)⁴. Bij zowel menselijke als muis SLE wordt LN gekenmerkt door geleidelijke ontsteking veroorzaakt door renale afzetting van immuuncomplexen, gevolgd door complementactivering, rekrutering van ontstekingscellen en verlies van nierfunctie⁵. De immuuncomplexafzetting is de eerste stap om chemokine- en cytokineproductie door intrinsieke niercellen te induceren, wat de ontstekingsreactie uitbreidt door immuuncellen te rekruteren⁶. Het huidige protocol presenteert verschillende technieken om de progressie van nierziekten te volgen die celinfiltratie en immuuncomplexafzetting analyseren.

Urine die elke week wordt verzameld, zorgt voor detectie en visualisatie van het tijdsverloop van proteïnurie vóór, tijdens en na het begin van lupus. Proteïnurie als biomarker kan de biologische progressie van LN bepalen. Andere voordelen van deze techniek zijn dat het niet-invasief, kostenefficiënt en eenvoudig te implementeren is⁷. Wanneer de nier perfect werkt, is het proteïnurieniveau constant laag; bij MRL/lpr-muizen wordt echter na een leeftijd van 8-9 weken een geleidelijke toename van het proteïnurieniveau waargenomen, dat uiteindelijk hoog genoeg is om nierfalen te veroorzaken⁸. Meerdere reagenstrips en colorimetrische reagentia zijn in de handel verkrijgbaar om het probleem te monitoren. De Bradford-test is echter goedkoop en zeer nauwkeurig bij het bepalen van het begin van proteïnurie en het beloop van lupus nefritis. Deze test is snel en het reagens wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van oplosmiddelen, buffers, reductiemiddelen en metaalchelaatmiddelen die zich in uw monster kunnen bevinden ^9,10,11.

Een belangrijk aspect om te overwegen is celinfiltratie in de nier. Deze infiltraten bevorderen de pathogenese door de afscheiding van oplosbare factoren zoals cytokines te activeren om ontstekingen te verergeren¹². Om beter te begrijpen welke celpopulaties aanwezig zijn in de infiltraten, is een nuttige methode om leukocyten te isoleren¹³. Hier wordt de detectie van renale infiltratie van B-cellen als voorbeeld gebruikt. De procedure begint met een verteringsproces met deoxyribonuclease (DNase) en collagenase, gevolgd door dichtheidsgradiëntscheiding die puin, rode bloedcellen en dichte granulocyten verwijdert. De reden voor het isoleren van B-cellen (CD19⁺) en plasmacellen (CD138⁺) is dat lupus nieren deze cellen kunnen concentreren¹⁴. Er wordt gesuggereerd dat de aanwezigheid van B-cellen in kleine aggregaten in de nier kan wijzen op klonale expansie en bijgevolg op immunoglobuline (Ig) productie. Van plasmacellen is bekend dat ze ook in deze aggregaten aanwezig zijn¹⁵. Zodra leukocyten zijn geïsoleerd, kan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) worden gebruikt om de cellen van belang te analyseren bij kleuring met verschillende fluorescentie-geconjugeerde antilichamen.

Immunofluorescentie is een van de immunohistochemische (IHC) detectiemethoden die fluorescentie visualisatie van eiwitten in 4 μm dikke nierweefselmonsters mogelijk maakt. Andere IHC-detectiemethoden zijn afhankelijk van de aard van analyten, bindingschemie en andere factoren¹⁶. Immunofluorescentie is een snelle identificatiemethode die het antigeen blootstelt aan zijn tegenhanger antilichaam gelabeld met een specifiek fluorochroom (of een fluorescerende kleurstof). Wanneer het wordt geëxciteerd, produceert het licht dat een fluorescentiemicroscoop kan detecteren. Deze techniek kan worden gebruikt om de afzetting van complement C3 en IgG2a¹⁷ te observeren. Overmatige complementcascadeactivering kan worden geassocieerd met een ongecontroleerde immuunrespons en functieverlies¹⁸. Immuundepositie van anti-dubbelstrengs DNA (anti-dsDNA) auto-antilichamen in de nier is een grote zorg¹⁹, waar mensen met IgG2a isotype zijn geassocieerd met LN²⁰. In het bijzonder vertonen anti-dsDNA-antilichamen meer pathogeniciteit en affiniteit met nucleaire materialen en vormen ze immuuncomplexen²¹. Wanneer IgG2a aanwezig is, wordt de complementcascade, inclusief C3, geactiveerd om de immuuncomplexen te verwijderen²². De C3- en IgG2a-markers kunnen afzonderlijk worden gekwantificeerd of eroverheen worden gelegd om hun correlatie vast te stellen.

Met name serumcreatininemeting is een andere betrouwbare techniek die samen met microscopische hematurie en nierbiopten kan worden gebruikt om LN²³ te diagnosticeren. De aanwezigheid van proteïnurie is echter een sterke indicator van glomerulaire schade. In die zin kan het monitoren van het proteïnurieniveau tijdens lupus het begin van de ziekte detecteren en een aanvulling vormen op andere methoden voor het diagnosticeren van lupus. Bovendien kunnen immuuncomplexen die in glomeruli worden afgezet een ontstekingsreactie veroorzaken, het complementsysteem activeren en meer ontstekingscellen rekruteren. Een ander opmerkelijk punt van dit protocol is B-celinfiltratie in de nier. Dit, samen met de geïnfiltreerde T-cellen, versterkt lokale immuunresponsen die orgaanschade veroorzaken. Belangrijk is dat de classificatie van LN niet alleen gebaseerd is op glomerulaire morfologische veranderingen die worden waargenomen in microscopie, maar ook op immuunafzettingen waargenomen met immunofluorescentie. Daarom worden in dit protocol nauwkeurige en kosteneffectieve methoden voor de analyse van de nierfunctie aangeboden in laboratoriumomgevingen.