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Bioengineering

Implante sub-retiniano de EPR em portador de miniporcos: diretrizes para preparos pré-operatórios, técnicas cirúrgicas e cuidados pós-operatórios

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/63505
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1Eye Clinic, Department of Ophthalmology,University Hospital Giessen and Marburg GmbH, 2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging, 3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine,Charles University in Prague, 4Institute of Macromolecular Chemistry,Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics,Czech Academy of Sciences, 6Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 7Institute of Experimental Medicine,Czech Academy of Sciences, 8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine,University of Oslo, 9Moorfields Eye Hospitals UAE, 10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab,Research Center “Principe Felipe”, 11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology,Sigmund Freud University

Summary

O implante sub-retiniano de epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma das abordagens mais promissoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina. No entanto, o desempenho de estudos pré-clínicos em modelos animais de olhos grandes permanece desafiador. Este relato apresenta diretrizes para o transplante sub-retiniano de EPR em um portador de células em miniporcos.

Abstract

Doenças degenerativas da retina (incluindo degeneração macular relacionada à idade), que se originam principalmente na camada epitelial pigmentada da retina (EPR) ou dentro dela, levam a uma desorganização progressiva da anatomia da retina e à deterioração da função visual. A substituição de células de EPR lesadas (EPRs) por células de EPR cultivadas in vitro usando um carreador de células sub-retinianas tem mostrado potencial para restabelecer a estrutura anatômica das camadas externas da retina e, portanto, está sendo mais estudada. Aqui, apresentamos os princípios de uma técnica cirúrgica que permite o transplante sub-retiniano efetivo de um portador de células com EPR cultivado em miniporcos. As cirurgias foram realizadas sob anestesia geral e incluíram vitrectomia pars plana (VPP) padrão poupadora de lente, aplicação sub-retiniana de solução salina balanceada (BSS), retinotomia de 2,7 mm, implantação de carreador de células nanofibrosas no espaço sub-retiniano por meio de esclerotomia adicional de 3,0 mm, troca ar-líquido (FAX), tamponamento com óleo de silicone e fechamento de todas as esclerotomias. Esta abordagem cirúrgica foi utilizada em 29 cirurgias (18 animais) nos últimos 8 anos, com uma taxa de sucesso de 93,1%. A verificação anatômica do posicionamento cirúrgico foi realizada por meio de imagens in vivo de fundo de olho (fotografia de fundo de olho e tomografia de coerência óptica). Os passos cirúrgicos recomendados para o implante sub-retiniano de EPRs em um portador em olhos de miniporco podem ser usados em futuros estudos pré-clínicos usando modelos animais de olhos grandes.

Introduction

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é considerada a principal causa de perda da visão central em países desenvolvidos e é uma das muitas condições relacionadas à disfunção do epitélio pigmentado da retina (EPR) 1,2. O EPR é encontrado na membrana de Bruch (MB) localizada basalmente e fornece a manutenção necessária para os fotorreceptores. A degeneração progressiva da camada de EPR é uma característica da forma atrófica inicial da DMRI, e também acompanha o desenvolvimento da forma exsudativa tardia da DMRI. Apesar de muitos avanços na terapia das doenças retinianas, o desenvolvimento de uma modalidade de tratamento eficaz permanece desafiador3. Um dos métodos promissores é a substituição do EPR utilizando uma camada de EPR cultivada in vitro. Esse tratamento está associado ao progresso nas pesquisas com células-tronco utilizando EPR derivado de células-tronco embrionárias humanas (RPE-hESC) e EPR derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (RPE-iPSC)3,4,5,6,7. Nos últimos anos, muitos grupos de pesquisa têm se concentrado no desenvolvimento de diferentes abordagens para a substituição da PSE com a prova de conceito inicialmente aceita 8,9,10,11,12,13,14,15. As células do EPR (EPR) são geralmente liberadas para o espaço sub-retiniano na forma de uma suspensão celular, uma folha celular autoportante ou uma monocamada celular suportada por um carreador artificial 3,16,17,18,19,20,21. A injeção de uma suspensão celular é o método mais fácil, mas a condição comprometida do BM muitas vezes pode impedir a fixação das células transplantadas. Isso pode resultar em orientação apicobasal incorreta das PSE e falha na formação de uma monocamada22,23. A principal vantagem dos outros dois métodos (uma folha celular autoportante e uma monocamada celular suportada por substrato artificial) é que as células já estão em um estado de monocamada diferenciada quando implantadas diretamente no espaço sub-retiniano24.

Muitas técnicas cirúrgicas descrevendo a liberação de carreadores celulares no espaço sub-retiniano foram publicadas nos últimos anos8,9,10,11,12,13,14,15. Esses estudos descreveram o uso de modelos animais de olhos grandes, os tipos de portadores celulares, o uso de culturas celulares transplantadas, os instrumentos de implante, bem como as técnicas cirúrgicas, e os autores se concentraram principalmente nos resultados do implante sub-retiniano. Popelka et al., em 2015, relataram o uso de uma membrana polimérica ultrafina eletrofiada suportada em armação para o transplante de EPRs em olhos de cadáveres suínos8. A técnica cirúrgica aqui descrita com implante sub-retiniano do carreador celular permitiu manuseio relativamente preciso do carreador e fácil posicionamento do arcabouço no espaço sub-retiniano. avaliaram a viabilidade da técnica de entrega de um carreador com tamanho aproximado de 2 mm x 5 mm em olhos suínos9. O design exclusivo do carreador celular permitiu sua correta colocação, evitando que a monocamada celular dobrasse e enrugasse6. Al-Nawaiseh e col. apresentaram, pela primeira vez, diretrizes detalhadas passo a passo para o implante de arcabouço sub-retiniano em coelhos25. Stanzel e col. publicaram um protocolo semelhante em 2019 para transplante em pequenos roedores, coelhos, porcos e primatas não humanos26. Como publicado anteriormente, o transplante de uma monocamada de EPR diferenciada e polarizada em um portador sólido resultou em melhor sobrevida e melhor integração do enxerto em comparação com outras técnicas de entrega (Arquivo Suplementar 1)27.

O objetivo de qualquer estudo pré-clínico em animais realizado in vivo é revelar os vários aspectos do implante cirúrgico transvítreo sub-retiniano de um portador de células com foco na segurança do procedimento, na sobrevivência das células transplantadas, na resposta tecidual às manobras sub-retinianas e nos resultados pós-operatórios a curto e longo prazo. O uso de olhos suínos como modelo animal de olhos grandes tem sido relatado como relevante em termos da abrangência dos dados obtidos, que poderiam ser úteis e potencialmente aplicáveis a humanos10,11,14. Nosso estudo relata a técnica cirúrgica utilizada para o implante sub-retiniano in vivo de um carreador de células em um modelo animal de olhos grandes. Apresentamos uma descrição detalhada dos preparos pré-operatórios, da técnica cirúrgica de implante de carreadores de células sub-retinianas e dos cuidados pós-operatórios dos olhos de miniporco com base em nossa experiência nos últimos 8 anos. Descrevemos os princípios cirúrgicos básicos que podem ser utilizados para estudos experimentais in vivo envolvendo a implantação de diferentes tipos de células e carreadores celulares.

Modelo animal de grande porte
O rebanho experimental de miniporcos Liběchov foi fundado importando cinco animais da cepa Hormel dos EUA em 1967. Esses animais foram mestiços para estudos de grupos sanguíneos suínos com várias outras raças ou linhagens: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamitas e suínos miniatura de origem Göttingen28,29. Aos 5 meses de idade e aproximadamente 20 kg de peso corporal (PC), os miniporcos atingem a maturidade sexual. A sobrevivência das raças parentais de miniporcos (Hormel e Göttingen) é relatada como sendo de 12-20 anos. O implante sub-retiniano do carreador celular tem como alvo a porção central da retina. A retina dos miniporcos não possui mácula e fóvea. Entretanto, possui regiões de fotorreceptores cônicos altamente concentrados denominadas área central e estrias visuais30,31. Essas regiões são responsáveis pela maior acuidade visual.

As cirurgias foram realizadas por quatro cirurgiões vitreorretinianos experientes com o auxílio de um experiente assistente de centro cirúrgico (AT). Antes dos experimentos in vivo , os cirurgiões foram instruídos e obtiveram conhecimentos especiais da anatomia do olho de miniporco, como a menor relação entre o volume do cristalino e o vítreo, o menor comprimento axial (15-19 mm), a ausência da membrana de Bowman na córnea, o menor volume vítreo (2,8-3,2 mL), a ausência de mácula e fóvea, ausência do anel de Zin e diâmetro do disco óptico (vertical/horizontal: 1,5 mm/2,1 mm). Em todos os casos, a cirurgia foi realizada sob anestesia geral em centro cirúrgico especialmente organizado, com implementação de medidas assépticas e antissépticas padrão.

Protocol

Este estudo adere aos princípios das Diretrizes da Declaração de Helsinque e aos princípios éticos para pesquisas médicas envolvendo seres humanos. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e de acordo com a Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais. O protocolo do estudo foi aprovado pela Comissão Profissional de Resort do CAS para Aprovação de Projetos de Experimentação em Animais no Instituto de Fisiologia e Genética Animal da Academia Tcheca de Ciências (Liběchov, República Tcheca) (Protocolo aprovado nº 60/2016 e nº 64/2019). 1. Considerações durante o transplante sub-retiniano de células de um portador em miniporcos Seleção de animaisObter e usar miniporcos Liběchov que são 12-36 meses de idade, ambos os sexos, e cerca de 40-80 kg de peso corporal (PC). Mantenha os miniporcos dentro de casa em um biotério com ar condicionado, com temperaturas entre 18-22 °C, exposição a um ciclo claro/escuro artificial de 13 h/11 h, baias individuais padronizadas, livre acesso à água e alimentação duas vezes ao dia. Preparo antes da cirurgiaVerifique a orientação cirúrgica do olho e desenhe os esquemas de fundo de olho. Para isso, divida esquematicamente a retina dos miniporcos no desenho do fundo de olho usando uma caneta com uma linha vertical nas regiões temporal (do disco óptico em direção à orelha), nasal (do disco óptico em direção ao focinho do porco) e central (entre os principais vasos da retina no lado nasal) (Figura 1A, B). Selecionar apenas animais saudáveis, sem qualquer patologia comportamental e neurológica e com qualidade normal da pele, orifícios corporais, fezes e consumo alimentar. Peça a um veterinário capacitado que realize a observação clínica e selecione os animais. Injetar por via intramuscular 3 mg/kg de PV de cloridrato de ceftiofur (1 mL/kg) no dia da cirurgia. Imunossupressão pré-operatóriaPreparar microesferas poliméricas eluidoras de tacrolimo conforme descrito em Wang et al., e Sevc et al.32,33 com modificação. Certifique-se de que a concentração de tacrolimus nas microesferas do polímero é de 51,3 mg/g, conforme determinado por HPLC (Tabela de Materiais). Realizar uma injeção subcutânea de microesferas de polímero carregadas de tacrolimus na dose de 0,25 mg/kg PV 6 dias antes da cirurgia ocular para impedir a rejeição do enxerto celular. Isso é feito para garantir a sobrevivência das células humanas do doador de EPR durante o transplante xenogênico nos olhos do miniporco. Injetar os animais por via intramuscular no dia da cirurgia com 80 mg de depo-medrol e benzilpenicilina a 1 mL/10 kg de acordo com o peso corporal. AnestesiaInduzir anestesia geral com injeção intramuscular de uma mistura de tiletamina (2 mg/kg), zolazepam (2 mg/kg), cetamina (2 mg/kg) e xilazina (0,4 mg/kg)-TKX34,35 antes da cirurgia. Verifique a profundidade da anestesia por um estado de inconsciência e verificando o reflexo pedal (uma pitada da pele interdigital da pata traseira), o reflexo corneano (um leve toque na córnea), o reflexo pupilar (reação à luz) e o reflexo palpebral (um toque na pálpebra). Certifique-se de que o animal não pisque. Confirme a regularidade da frequência cardíaca e respiratória. Após a indução anestésica, transportar o animal sedado até a sala de cirurgia em um carrinho de elevação (Figura 2A). Colocar o animal na mesa cirúrgica do lado esquerdo para possibilitar a cirurgia no olho direito (Figura 2B). Realizar o ajuste da cabeça do animal com almofadas de isopor para obter a posição mais adequada da retina central para implantação (isto é, horizontal e paralela ao chão) (Figura 2C). Coloque colírios de solução oftálmica de cloridrato de proparacaína a 0,5% no saco conjuntival com três vezes 1 min de intervalo para induzir anestesia local. Inserir cânula venosa e intubar o animal com tubo endotraqueal para manutenção da anestesia inalatória (isoflurano a 1,5%) com aparelho de anestesia equipado com monitor do paciente (Figura 2A, B). Administrar uma injeção intramuscular de 1 ml de Eficur por 16 kg de peso corporal e 20 mg de Depo-Medrol 1 aproximadamente 15 minutos antes do início da cirurgia ocular (Tabela de Materiais). Manter a temperatura corporal fisiológica cobrindo o animal com papel alumínio isotérmico e realizar a cirurgia conforme descrito na secção 3. Durante a cirurgia, monitore a temperatura do animal, juntamente com a frequência cardíaca e a saturação de oxigênio no sangue, usando um clipe auricular e um monitor do paciente. Evitar o abaixamento da temperatura corporal abaixo de 38 °C durante os procedimentos, que é considerado um limite seguro36. Manter a saturação de oxigênio (>96%) e a frequência de pulso (70-90 batimentos por minuto) durante todo o experimento. Quando a cirurgia estiver concluída, desligue o fluxo de isoflurano e extube o animal. Após a respiração espontânea e o despertar, transfira os animais para seus currais. Configuração da sala de cirurgiaOrganizar a sala cirúrgica de acordo com as necessidades da cirurgia nos olhos do modelo animal de olhos grandes (Figura 3A, B). Ajustar a altura das cadeiras do cirurgião, bem como a altura do microscópio, para obter uma posição confortável para os cirurgiões em relação à posição do focinho do porco. Figura 1: Desenho esquemático das zonas retinianas em miniporcos. (A) Desenho esquemático das zonas retinianas em relação à cabeça do miniporco; a elipse amarela representa a área desejada de implantação sub-retiniana, T refere-se à área temporal da retina e N refere-se à área da retina nasal. (B) Exemplo do esquema de fundo de olho após implantação sub-retiniana do carreador celular (amarelo) através de retinotomia (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Transporte e colocação do animal. (A) Transporte do animal sedado até a sala de cirurgia. (B) Colocação do animal durante a intubação. (C) Ajuste da cabeça do animal para ótimo acesso à retina central durante a cirurgia (seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Configuração padrão da sala de cirurgia. (A) Representação esquemática da posição do cirurgião (S = cirurgião, A = assistente) em relação à posição da mesa cirúrgica com o miniporco, o microscópio cirúrgico (MO), a máquina de vitrectomia (VM), a mesa instrumental (TI) e a máquina de anestesiologia (AM). Existem duas posições possíveis da máquina de vitrectomia (amarelo e cinza). (B) Ambientação da vida real na sala de cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Transportador celular, culturas de células cultivadas e injetor de implantação Celular transportadorCorte a estrutura oval de 30 μm de largura com dimensões externas de 1,7 mm x 4,8 mm, equipada com saliências triangulares localizadas assimetricamente no quadro (Figura 4A), a partir de uma folha de polietileno tereftalato (PET) biaxialmente orientada de 36 μm de espessura usando um laser de femtossegundo. Preparar solução poli(L-lactídeo-co-DL-lactídeo) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) em piridina a uma concentração de 11% em peso com a adição de 2,2 μL de ácido fórmico por 1 g de solução. Preparar a membrana nanofibrosa com uma estrutura de suporte embutida (Figura 4B) pela eletrofiação da solução polimérica em três etapas8: (1) depositar a primeira camada de nanofibras sobre um substrato de silício, (2) colocar a estrutura sobre a camada e (3) depositar a segunda camada de nanofibras.NOTA: Deposite cada camada por 7 min para atingir uma espessura total de membrana de 3,7 μm. Utilizar os seguintes parâmetros para obter uma membrana composta por fibras de 380 nm de espessura e poros médios de 0,4 μm e porosidade de cerca de 70: agulha toda em aço de 20 G, tensão de 7,1 kV, folga de 10 cm, vazão de 250 μL/min e temperatura de 25,0 °C ± 0,5 °C. Remova cuidadosamente a membrana com a estrutura embutida do substrato de silício e fixe-a no corpo de uma inserção comercial de cultura de células de 12 poços desprovida da membrana original para facilitar a semeadura e o crescimento das células. Trate a membrana nanofibrosa antes da semeadura celular no plasma de ar por 30 s a uma potência de 70 W em um limpador de plasma. Culturas de células utilizadas para cultivo no transportador celularNOTA: Os seguintes carreadores celulares podem ser usados: 1) carreadores de células nanofibrosas sem células; 2) carreadores de células nanofibrosas com EPRs humanos primários (hRPEs); 3) carreadores de células nanofibrosas com células humanas de EPR derivadas de iPSC.Cultura de hRPEs primários Isolar células primárias de hRPE de olhos de doadores humanos de acordo com técnica previamente relatada38. Obter as células por tratamento enzimático da retina por 30 min. Em seguida, cultivar as células primárias de hRPE (passagem 0) por até 2 semanas em DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Assim que as culturas celulares atingirem a confluência, trocar o meio para SFB a 1% e cultivar por mais 30 dias. Semeando os hRPEs primários em placas trans-poço e em um carreador de células nanofibrosas revestidas com laminina a uma densidade de 2.000 células/mm2. Após mais 30 dias de incubação em SFB a 1%, use os carreadores celulares com hRPEs primários para implantação sub-retiniana em miniporcos. EPRs humanos derivados de iPSCUtilizar hiPSCs derivadas de fibroblastos derivados da retinose pigmentosa associada ao MERTK39 que são corrigidas geneticamente, em dois alelos utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (RP1-FiPS4F1-GC2)40, bem como hiPSCs derivadas dos fibroblastos de um indivíduo saudável (Ctrl2-FiPS5F2)41 que são usadas como controle. Gerar e posteriormente diferenciar ambas as linhagens celulares de hiPSC em relação às células de EPR (hiPSC-RPE), conforme relatado anteriormente42. Plaquear os hiPSC-RPEs a 200.000 células/cm2 em pastilhas de cultura celular revestidas com laminina com membranas nanofibrosas de poli(L-lactídeo-co-DL-lactídeo) com armações ovais de implantação em meio de EPR contendo DMEM knockout, soro knockout 20%, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, β-mercaptoetanol 0,23 mM, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 0,1 mg/mL e nicotinamida 10 mM. Troque o meio em dias alternados e cultive a PSE-hiPSC por 2 meses antes da implantação para estimular o crescimento polarizado. Injetora de implantaçãoPreparar um capilar plástico com seção transversal retangular de 2,8 mm x 0,8 mm por moldagem por sopro a partir de um tubo plástico de OD 1,75 mm/ID 1,10 mm. Corte uma janela de carga de 4 mm x 2,2 mm no capilar plástico a 6 mm da extremidade. Monte o injetor a partir do capilar plástico, uma alça de silicone, um êmbolo de lâmina de aço e um pistão (Figura 5A). Carregar o carregador no injector através de uma janela de carga e, posteriormente, ejetá-lo para o espaço sub-retiniano por um empurrão do êmbolo, conforme descrito no passo 3.5.2 (Figura 5B). Preparação do carreador nanofibroso e carregamento do injetorEncher uma pequena placa de Petri plástica com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Retire uma pastilha com a camada de células preparada, coloque-a em uma placa de poliestireno semimacia e centralize-a sob um microscópio de luz. Use um soco modificado sob medida para cortar o suporte ao longo da estrutura oval usando um microscópio. As dimensões do suporte devem ser de 2 mm x 5 mm. Utilizar injetora sob medida com tubulação plana transparente para carregamento do transportador; A 6 mm da extremidade distal do capilar, há uma janela para carregar o portador. Preencha a janela do injetor com PBS. Usando a pinça, solte a amostra do fundo da placa, levante-a do líquido e transporte-a para a janela do injetor enquanto verifica as marcas de orientação lateral no quadro primeiro, a fim de detectar o lado superior do transportador com células aderentes. Uma armação oval facilita a manipulação com o carregador. Usando uma sonda dental (um instrumento odontológico de aço inoxidável com uma terminação afiada), posicione o transportador na janela do injetor. Use o êmbolo para empurrar o transportador para a parte superior fechada e segura do injetor. Em seguida, prepare o portador para a cirurgia. Verifique a orientação lateral do transportador em cada etapa. Descarregue o transportador nanofibroso do injetor empurrando o êmbolo metálico. Figura 4: Carreador nanofibroso com estrutura PET de suporte embutida. (A) Três marcas visíveis no quadro permitem o controle da orientação lateral do portador (setas brancas). (B) Visão ampliada do fragmento do quadro de PET embutido na membrana nanofibrosa (setas brancas) do carreador celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Injetora de implante. (A) Partes do injetor. (B) Carreador de células nanofibrosas com estrutura PET de suporte embutida carregada no capilar retangular plástico do injetor de implante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Procedimento cirúrgico Equipamento cirúrgicoUtilizar os seguintes equipamentos cirúrgicos: microscópio cirúrgico oftálmico, sistema operacional para cirurgias nos segmentos anterior e posterior do olho, sistema cirúrgico vitreorretiniano sem contato, aparelho de fotocoagulação a laser e câmera digital.NOTA: Os parâmetros padrão utilizados em vitrectomia, exocautério e endocautério e equipamentos de fotocoagulação a laser estão representados na Tabela 1. Instrumentos cirúrgicosEsterilizar os instrumentos cirúrgicos reutilizáveis com um esterilizador a vapor de autoclave móvel ou similar de acordo com um protocolo padrão. Os instrumentos cirúrgicos de uso único e os materiais necessários durante a cirurgia estão listados na Tabela de Materiais. Preparo para os passos cirúrgicosApós anestesiar o animal, conforme descrito no passo 1.4.1, aplicar colírio de solução de tropicamida a 1% e solução de cloridrato de fenilefrina a 10% no saco conjuntival 15 minutos antes do procedimento para provocar midríase induzida por drogas. Abordar a mesa cirúrgica com o cirurgião na posição superior e o auxiliar na posição lateral (Figura 3). Faça a barba na área ao redor do olho usando uma lâmina de barbear de uso único e remova a sujeira áspera. Desinfetar o saco conjuntival com solução de iodopovidona a 5% por 5 min. Desinfete a área periorbital com cotonetes esfregando das pálpebras para a periferia. Repita o processo três vezes usando uma solução de iodopovidona a 10% e deixe agir por 5 min. Cubra o campo operatório com o olho no meio usando um pano oftálmico estéril padrão com folha transparente pegajosa. Afaste os cílios do globo ocular. Evite cortar os cílios para reduzir o risco de endoftalmite pós-operatória. Insira o espéculo da pálpebra (espéculo tipo Liberman ou olho de Cook). Opcionalmente, fixar a membrana nictitante na pele com 8-0 sutura com poliglactina. Abrir a conjuntiva do lado nasal a 2 mm a 3 mm do limbo para expor a esclera para as esclerotomias com pinça cirúrgica e tesoura conjuntival de Westcott. Insira os trocárteres de três válvulas de 25 G a 2,5-3 mm do limbo na área da pars plana (coloque-os às 7 horas, 10 horas e 11 horas). Utilizar movimentos rotatórios durante a inserção de forma levemente oblíqua (100°-110°) em direção à retina posterior e segurar o trocarte com a pinça (Figura 6). Mantenha a córnea úmida ou cubra-a com metilcelulose durante toda a cirurgia para evitar o edema osmótico da córnea. Vitrectomia por pars plana (VPP)Remova a porção média do corpo vítreo com a abordagem padrão de vitrectomia pars plana de três portas. Remova cuidadosamente o vítreo atrás da lente na área da futura esclerotomia grande. Utilizar uma injeção intravítrea de 2-4 mg de acetonido de triancinolona (AT) (50-100 μL) para corar o vítreo posterior, que geralmente permanece aderente à retina, a fim de realizar um descolamento controlado do vítreo posterior. Em seguida, realizar lentamente uma injeção sub-retiniana de 0,05-0,1 mL de BSS com uma cânula de 41 G mais centralmente, evitando a formação de uma bolha em direção à periferia. Reduzir as configurações de pressão intraocular com o sistema de irrigação até 15 mmHg durante a injeção sub-retiniana para evitar uma oclusão vascular transitória da retina. Realizar uma endodiatermia linear grande da retina com uma sonda de endodiatermia 27G 3 mm próxima à base do bleb nasal. Em seguida, realizar retinotomia de 3 mm com lâmina MVR 25 G ou tesoura vertical com ajuste elevado da pressão intraocular (PIO) do sistema de irrigação até 60 mmHg por 3 min a 5 min. Certifique-se de que não há sangramento da retinotomia e, em seguida, reduza a PIO para 25 mmHg. Realizar uma exodiatermia dos vasos episclerais entre os dois trocárteres nasais a 2,5-3 mm do limbo com uma sonda de endodiatermia de 27 G, aplicando um toque suave na superfície da esclera. Verifique o nível de líquido do frasco de infusão antes de ampliar a esclerotomia, pois após o aumento da esclerotomia, o consumo de líquidos é temporariamente alto. Realizar esclerotomia de 3,0 mm de largura, a 3 mm do limbo, com faca faco de 2,75 mm. Preste atenção a possíveis sangramentos dos vasos esclerais e corpo ciliar dentro da grande esclerotomia. Em caso de sangramento, use uma sonda de endodiatermia 27G para coagular os vasos danificados. Ampliar a esclerotomia para 3,0 mm com uma faca de cetim para acomodar a ponta do injetor (0,8 mm x 2,8 mm). Remova o corpo vítreo prolapsado no local da grande esclerotomia com um vitrector. Manter a infusão de SBS no nível de 25-30 mmHg com o sistema de vitrectomia para evitar o colapso do globo ocular. Implantação do carreador celularInsira suavemente o injetor com a mão dominante na cavidade vítrea através da grande esclerotomia. Em caso de resistência, aumentar o tamanho da esclerotomia. Implantar o carreador celular através da retinotomia no espaço sub-retiniano. Se necessário, utilizar técnica bimanual com esclerotomia adicional e candelabro leve para melhorar o controle do implante. Retire o injetor do olho e feche a esclerotomia grande com um 8-0 sutura de poliglactina para evitar complicações associadas à hipotonia intraocular. Realizar uma troca completa de ar-líquido (FAX) e drenagem do líquido sub-retiniano com uma cânula com ponta de silicone. Em seguida, injetar óleo de silicone (1.000 cSt) na cavidade vítrea usando o sistema de vitrectomia e tubulação para injeção de óleo de silicone até que a PIO esteja normal. Exames de imagem e documentação intraoperatóriosRealizar uma gravação de vídeo durante toda a cirurgia com documentação fotográfica das principais etapas da implantação utilizando um sistema de gravação de vídeo. Completar o desenho do fundo de olho documentando a localização das esclerotomias, retinotomia, implante sub-retiniano, e quaisquer complicações que ocorreram usando esquemas de desenho de fundo. Etapas pós-operatóriasAo final da cirurgia, retirar os trocárteres e fechar as três esclerotomias e a conjuntiva com 8-0 suturas de poliglactina. Enxaguar o saco conjuntival com solução de iodopovidona a 5%. Realizar uma injeção subconjuntival de 0,3 mL de 20 mg de gentamicina, 2 mg de dexametasona e xilocaína a 2%. Verifique a condição do fundo e da lente usando uma visão microscópica. Remover a(s) sutura(s) da membrana nictitante com pinça cirúrgica e tesoura conjuntival Westcott (opcional). Aplique pomada de neomicina ou pomada ofloxacina oftálmica no saco conjuntival. Figura 6: Inserção dos trocárteres no olho de um miniporco. (A) Representação esquemática dos trocárteres, que são inseridos perpendicularmente na esclera em direção ao centro da cavidade vítrea no olho humano (cor cinza) e de forma oblíqua em direção à retina posterior no olho do miniporco (cor azul) para evitar danos ao cristalino. A lente do miniporco (cor azul) é maior do que a dos humanos e relativa ao tamanho da cavidade vítrea. (B) Visão intraoperatória dos trocárteres inseridos em PPV de três portas. A córnea é coberta com metilcelulose para evitar o ressecamento e inchaço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Cuidados pós-operatórios Aplicar bacitracina tópica zinco/acetato de hidrocortisona/sulfato de neomicina ou ofloxacina a 0,3% no saco conjuntival dos animais cinco vezes ao dia. No pós-operatório, verifique os seguintes parâmetros oculares: turgor dos tecidos moles do olho usando palpação, reação inflamatória na superfície ocular e estrabismo como reação protetora das pálpebras usando uma lâmpada de fenda portátil ou oftalmoscópio indireto. Para cuidados pós-operatórios sistêmicos, use os seguintes antibióticos:Injetar cloridrato de ceftiofur por via intramuscular na dose de 3 mg/kg de peso corporal (1 mL/kg) no segundo e terceiro dia de estabilidade. Injetar tulatromicina (1 mL/40 kg PV) após 72 h pós-operatório para prevenção de infecção bacteriana secundária. Realizar uma injeção intramuscular de flunixina (2 mL/45 kg de peso vivo) e cloridrato de tramadol (100 mg) a cada 24 h por 3 dias após a cirurgia para prevenir a dor. Mantenha os miniporcos em uma instalação especializada com ar condicionado com uma faixa de temperatura de 18-22 °C e um regime artificial de 13 h/11 h claro/escuro. Certifique-se de que eles tenham livre acesso à água e alimentação padrão (duas vezes por dia). 5. Procedimentos pós-operatórios Exames oftalmológicos pós-operatóriosNo período pós-operatório, inspecione os olhos com um oftalmoscópio indireto para a presença de inflamação (ou seja, vermelhidão, inchaço tecidual ou congestão de muco no saco conjuntival). Medir a pressão intraocular no olho operado usando o método de palpação. Exames de imagem pós-operatóriosInduzir sedação no miniporco pela injeção intramuscular de uma mistura de TKX antes da fotografia de fundo de olho e exame de OCT. Instilar colírios de tropicamida a 1% e cloridrato de fenilefrina a 10% no saco conjuntival do miniporco para induzir midríase. Utilize um espéculo de pálpebra para manter os olhos abertos. Para hidratar a superfície ocular e obter uma imagem clara de OCT, lavar a córnea do animal com solução salina (NaCl a 0,9%) a cada 30-60 s. Posicione o minipig na mesa cirúrgica da mesma maneira que durante a operação (Figura 2B,C, Figura 3A). O principal requisito é colocar a cabeça na lateral e perpendicular à peça de digitalização do dispositivo OCT. Use almofadas de isopor sob o focinho do animal para estabilizar a cabeça, colocando a superfície ocular em uma posição horizontal. Colete imagens coloridas de fundo de olho com uma câmera de fundo de olho não midriática colorida, pois isso permite documentar o segmento anterior, a retina e o disco óptico. Além disso, tire uma imagem da retina sem vermelho com a câmera de fundo não midriático. Realizar tomografia de coerência óptica usando o sistema OCT de domínio espectral. Durante a OCT ou fundo de olho, incline a cabeça do miniporco manualmente em direção às lentes do OCT ou às lentes da câmera de fundo para otimizar a visão da retina posterior e da área de implantação (Figura 2C). Para obter a imagem ideal do carreador implantado no fundo, aplique a luz de reflectância infravermelha do dispositivo OCT para focalizar o implante (Figura 2C). Use os modos de varredura de linha cruzada e mapa de retina da OCT. Aplique pomada ofloxacin oftálmica no final do exame sob a pálpebra do olho do animal. Mova o miniporco para a instalação interna e observe seu estado geral até o final da sedação (aproximadamente 2 h a 5 h). 6. Enucleação do olho post mortem após eutanásia Sedar os miniporcos com uma injeção intramuscular da mistura de TKX seguida de uma aplicação intravenosa (através de uma cânula auricular de 22 G) em bolus de propofol a 1% (20 mL/animal) seguida de exsanguinação. Não use fixadores gerais. Sacrificar os animais por exsanguinação durante anestesia geral profunda 7 dias, 14 dias, 28 dias e 42 dias após o implante do enxerto celular. Use pinças e tesouras para remover as pálpebras superiores e inferiores. Retire a terceira pálpebra e corte a conjuntiva. Corte os músculos oculares e o nervo óptico. Enuclear os olhos post mortem usando tesoura cirúrgica e pinça cirúrgica. Certifique-se de que o procedimento é realizado por uma pessoa experiente.

Representative Results

Os resultados da implantação sub-retiniana do carreador celular em miniporcos Liběchov são apresentados em Tcapaz 2. O sucesso do implante foi definido como a obtenção de dados suficientes para estudo histológico e imuno-histoquímico. Os casos falhados foram definidos como olhos com complicações intraoperatórias graves, o que impossibilitou a observação adicional dos tecidos oculares. A aplicação da técnica proposta com o uso de tamponamento com óleo de silicone permite controlar a condição do transplante sub-retiniano por meio de modalidades de imagem a partir do dia seguinte após a cirurgia até o momento da enucleação (Figura 7, Figura 8 e Figura 9). Fundoscopia e SD-OCTOs miniporcos foram examinados no pós-operatório usando imagens de fundo de olho, imagem livre de vermelho e tomografia óptica coerente de domínio espectral (Figura 7). A imagem de fundo de olho de alta qualidade foi possibilitada com o uso de meios ópticos transparentes, incluindo lente transparente e tamponamento com óleo de silicone (Figura 7A). O local da retinotomia não apresentava sinais de reação proliferativa (Figura 7A, setas amarelas), e o quadro de TEP do portador de células era claramente visível através das camadas semitransparentes da retina porcina. Na imagem vermelho-livre, a refletividade dos hRPEs cultivados no carreador não diferiu da refletividade da camada endógena de EPR suíno (Figura 7B). No TSD-OCT, o quadro de TEP causou apenas pequeno sombreamento das estruturas anatômicas subjacentes e discreto espessamento da retina (Figura 7C, setas vermelhas). Não foram observadas zonas hipo ou hiper-reflexivas atípicas no SD-OCT, e a membrana de Bruch também pareceu permanecer intacta. A Figura 8 apresenta imagens de fundo de olho e OCTi do arcabouço cultivado com células primárias do EPR humano 1 mês após a cirurgia (Figura 8). O próprio carreador celular (sem células) não causou aumento significativo da espessura retiniana (Figura 9C). Esses achados sugerem que o impacto iatrogênico do implante no intraoperatório foi mínimo e que o carreador celular implantado sofreu adaptação suficiente das células implantadas às células fotorreceptoras sobrejacentes e ao tecido neurorretiniano. Figura 7: Imagem pós-operatória da retina em miniporcos . (A) Imagem de fundo de olho, (B) Imagem livre de vermelho e (C) Imagem de coerência óptica do carreador nanofibroso com células primárias do EPR humano em um seguimento de 1 semana após o transplante sub-retiniano em um olho de miniporco. (A) As setas amarelas indicam o local da retinotomia. (B) As setas vermelhas demonstram as margens do carreador de células nanofibrosas. (C) As setas vermelhas mostram o ligeiro sombreamento do sinal de OCT causado pela estrutura PET de suporte do carreador nanofibroso, que foi implantado no espaço sub-retiniano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Fundoscopia e OCTi dos scaffolds 30 dias após o implante sub-retiniano nos miniporcos. A, B, C, D e E correspondem aos suínos 169, 182, 179, 199 e 224, respectivamente. As setas amarelas representam a moldura do andaime. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Análise histológica e imuno-histoquímicaApós a eutanásia dos animais, os olhos inteiros de miniporco foram retirados e fixados em paraformaldeído (PFA) a 4% por 24 horas. A parte anterior do olho foi removida, e o carreador nanofibroso implantado foi identificado na retina nasal central e isolado com a esclera aderida. Todos os tecidos foram crioprotegidos em soluções graduadas de sacarose e cortes verticais congelados, conforme descrito detalhadamente43. A histologia da membrana nanofibrosa sem células do EPR após 4 semanas de implantação revelou retinas sem inflamação e alterações degenerativas (Figura 9A). A presença da membrana nanofibrosa foi detectada em luz polarizada (Figura 9B). Figura 9: Análise histológica da membrana nanofibrosa acelular implantada. Coloração pela hematoxilina-eosina da membrana nanofibrosa acelular 4 semanas após o implante (A) com iluminação padrão e (B) com microscopia de luz polarizada. A seta branca indica a localização da membrana nanofibrosa (barra de escala: 50 μm). (C) Imagens de tomografia de coerência óptica in vivo da membrana nanofibrosa acelular após 4 semanas após o implante mostram boa aceitação e aderência da membrana nanofibrosa no espaço sub-retiniano. A seta branca indica a localização do implante na imagem transversal da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A Figura 10 mostra a coloração hematoxilina-eosina (H&E) da área retiniana contendo as células primárias de hRPE implantadas em um carreador nanofibroso (seta amarela) no olho do miniporco. A aparência pigmentada dos hRPEs primários implantados formou uma camada pigmentada contínua, porém irregular (Figura 10, setas vermelhas). Após períodos de observação mais longos (6 semanas), a neurorretina sob os implantes mostrou uma aparência semelhante a uma roseta ou reação hipertrófica ao redor do local da retinotomia, provavelmente como resultado da manipulação iatrogênica. Esses resultados morfológicos são comparáveis aos achados da SD-OCT e apoiam as evidências do impacto mínimo da liberação do carreador no tecido da retina. Figura 10: Análise histológica da membrana nanofibrosa implantada com os hRPEs primários. Coloração pela hematoxilina-eosina da área retiniana contendo o carreador nanofibroso implantado (seta amarela) com os hRPEs primários no olho do miniporco. O animal foi sacrificado e analisado 6 semanas após o implante. Os hRPEs primários eram claramente distinguíveis por seu tamanho, forma arredondada e pigmentação (setas vermelhas) no espaço sub-retiniano oposto aos fotorreceptores. Os núcleos fotorreceptores no ONL constroem estruturas semelhantes a rosetas. O espaço sub-retiniano parece hipertrófico. Abreviações: hRPE = epitélio pigmentado primário da retina humana, ONL = camada nuclear externa, INL = camada nuclear interna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A imunomarcação foi realizada empregando-se um método indireto em duas etapas. Os cortes foram incubados à temperatura ambiente durante a noite em CRALBP, um anticorpo primário monoclonal, na diluição de 1:100. A imunofluorescência foi realizada com o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488. Os hRPEs primários implantados estavam presentes na área de implantação e expressaram o marcador CRALBP típico do EPR semelhante às células endógenas do EPR do miniporco (Figura 11A). Em contraste, a morfologia das células implantadas pareceu não assumir uma forma monocamada após o implante, mas permaneceu localizada dentro do espaço sub-retiniano definido (Figura 11A,B, setas brancas). Os seguintes marcadores de PSE/retina e aparência morfológica permaneceram positivos após o período de 6 semanas pós-implantação: a presença de grânulos de pigmento/melanina, os marcadores neuronais específicos da retina em estágio terminal para o bastonete bipolar (PKC-alfa) e os fotorreceptores do cone (PNA), e a positividade para GFAP – um sinal de ativação microglial. Figura 11: Imunomarcação com o marcador celular de EPR CRALBP (cellular retinaldehyde binding protein) em um minipig 6 meses após o implante de hRPEs primários. (A) Cortes verticais congelados do olho de porco tratado foram imunomarcados com anticorpo monoclonal CRALBP (verde) e contracorados com DAPI (azul). (B) Representação única de marcação de núcleos celulares com DAPI em preto e branco, pois o alto contraste revela a forma redonda das células hRPE individuais (algumas mostradas com setas brancas). Abreviações: hRPE = epitélio pigmentado da retina humana, ONL = camada nuclear externa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Complicações ocularesNo total, 27 das 29 (93,1%) operações realizadas com sucesso. A definição “cirurgias realizadas com sucesso” foi aplicada aos casos em que o olho operado não apresentou complicações pós-operatórias clinicamente significativas até o momento da enucleação que pudessem influenciar o estudo histológico e imuno-histoquímico. A redução da transparência dos meios ópticos impactou a imagem pós-operatória em quatro casos (13,7%); no entanto, esses olhos foram processados com análise histológica e imuno-histoquímica adicional. Descolamento periférico de retina intraoperatório ocorreu em quatro casos (13,8%). Em dois casos, foi manejada pela aspiração do líquido sub-retiniano durante a troca fluido-gasosa e aplicação de fotocoagulação a laser da retina na área de descolamento. Nos outros dois casos (6,9%), o descolamento de retina foi associado a sangramento maciço de retina e sub-retina, o que impossibilitou o implante do carreador celular e levou ao término da cirurgia e eutanásia imediata do miniporco enquanto estava na mesa de operação. Não Parâmetros Configurações padrão usadas 1 Velocidade de vitrectomia (taxa de corte) até 20.000 cortes/min 2 Bomba Venturi 50-180 mmHg 3 Tempo de ascensão 1 seg 4 Pressão de irrigação 18-25 mmHg 5 Pressão de infusão de ar 20-25 mmHg 6 Exodiatermia bipolar 18-26% 7 Endodiatermia monopolar 16-18% 8 Fotocoagulação a laser da retina, 532 nm Potência 100-150 mW Intervalo 100 ms Duração 100 ms Tabela 1: Parâmetros padronizados utilizados durante a vitrectomia e fotocoagulação a laser. Total de animais, n 18 Olhos totais, n 36 Olhos operados, n 29 Implantação bem sucedida, n 27 Casos reprovados, n 2 Tempo médio de cirurgia, min 57 Taxa de sucesso, % 93.1 Tabela 2: Resultados da técnica cirúrgica padronizada com implante sub-retiniano do portador de células em miniporcos Liběchov entre 2016 e 2020. Arquivo Suplementar 1: Resumo dos estudos dedicados à implantação sub-retiniana de células de EPR no portador celular. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O implante sub-retiniano de células do EPR de diferentes origens é uma tendência muito promissora na pesquisa ocular para o tratamento de doenças degenerativas retinianas, como a DMRI3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . A ideia principal dessa abordagem é substituir os EPR danificados por EPRs saudáveis cultivados ex vivo (Arquivo Suplementar 1)44,45,46,47,48. O uso de carreadores celulares para transplantar as células de EPR cultivadas representa a abordagem mais razoável, uma vez que as membranas porosas mantêm a camada de células polarizadas de EPR na orientação correta em relação à camada fotossensorial.

Modelo animal ideal
Um passo crítico no desenvolvimento de tais abordagens de tratamento é o uso do modelo animal ótimo49. No passado, modelos de animais de pequeno e grande porte foram utilizados, incluindo coelhos, cães, porcos e primatas não humanos 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. Neste artigo, propomos o uso do modelo de miniporco Liběchov e descrevemos as etapas pré-operatórias, cirúrgicas e pós-operatórias que permitem a eficácia robusta do transplante. O miniporco Liběchov foi originalmente criado há cerca de 20 anos e tem sido frequentemente utilizado em pesquisas biomédicas no campo de doenças neurodegenerativas, como Parkinson e doença de Huntington29,50. Como o porco possui um cérebro relativamente grande, com suprimento sanguíneo e resposta imunológica semelhantes aos humanos, ele também tem sido utilizado como modelo animal para experimentos de transplante alogênico51,52,53,54. Embora a retina dos miniporcos não possua mácula e fóvea semelhantes às humanas, ela contém a área central e estrias visuais, que são regiões da retina com alta concentração de fotorreceptores cônicos30. O tamanho semelhante ao olho humano, a presença de retina central enriquecida com cone, o sistema imunológico bem descrito e a presença de métodos para avaliar a morfologia e a função pós-operatória são argumentos importantes para o uso deste modelo animal de grande porte no estudo apresentado.

Procedimento cirúrgico
Até onde sabemos, não existem técnicas cirúrgicas padronizadas e amplamente aceitas para o transplante vitreorretiniano de células do EPR em portadores. Uma das principais questões da terapia de substituição celular é a técnica cirúrgica desafiadora que apresenta risco de complicações intra e pós-operatórias ligadas ao descolamento de retina, hipotonia, sangramento episcleral, coroide e/ou retiniano e alta turbulência intraocular, que pode levar a danos no andaime. No pós-operatório, há risco de vitreorretinopatia proliferativa, endoftalmite, hipotonia, descolamento de retina e formação de catarata 4,10,13,14,15.

Os primeiros estudos sobre abordagens utilizando carreadores celulares foram realizados em coelhos bastardos de chinchilas13,16,25. Embora esses animais representem um modelo animal de pequeno porte, os resultados enfocando os aspectos técnicos da cirurgia foram cruciais no desenvolvimento dos procedimentos em modelos animais de grande porte e, portanto, estão resumidos a seguir.

Inicialmente, foi utilizada uma cânula de infusão 23G personalizada com dois orifícios laterais para redirecionar a corrente de jato, o que ajudou a resolver o colapso da bolha e consequente descolamento de retina13. No presente estudo, não observamos tal colapso da bolha. A possível razão para isso poderia ser o maior tamanho do globo ocular e a realização da vitrectomia por agulha grossa com vítreo poupado na periferia no local de infusão da cânula, o que poderia reduzir a força do fluxo de jato direcionado.

As dificuldades durante a ejeção do portador da célula do instrumento foram outro obstáculo intraoperatório nos modelos animais de pequeno porte, que foram categorizados como “presos com o instrumento”. Além disso, os autores sugeriram que o vítreo residual na superfície retiniana poderia causar um “salto” para trás do portador para fora do orifício da retinotomia após o implante. Esse problema pode ser resolvido com uma vitrectomia assistida por enzima, que permite uma ejeção suave e contínua do portador celular para o espaço sub-retiniano. Na maioria dos casos, os autores reposicionaram o carreador para obter uma localização mais distante do implante, longe da retinotomia. Em nossa casuística, também vivenciamos uma situação em que o carreador celular permaneceu preso à ponta do injetor. No entanto, isso foi gerenciado pela manipulação lenta e suave do tubo de luz e da ponta do injetor. Não observamos nenhum vítreo residual no local da retinotomia em nenhum dos nossos casos. O uso de VPP assistido por AT nas cirurgias pode ser sugerido como um método para reduzir o risco de aderência vítrea residual. Múltiplas colorações com AT podem ser necessárias para remover completamente o vítreo sobrejacente.

Em outro estudo, foram relatados os resultados do implante sub-retiniano de células-tronco humanas do EPR cultivadas como monocamada celular polarizada sobre uma membrana de poliéster24. Durante os experimentos, a mesma técnica cirúrgica descrita anteriormente foi utilizada13, mas uma abordagem de VPP de dois portais foi aplicada. Finalmente, um protocolo passo-a-passo para o implante sub-retiniano de cirurgia de carreador celular em coelhos foi publicadoposteriormente25. Este estudo apresenta uma descrição muito detalhada e facilmente repetível do procedimento cirúrgico, incluindo os cuidados pré e pós-operatórios, que também são baseados em experiências prévias.

Durante o uso de modelos animais de grande porte em estudos subsequentes, não apenas questões técnicas foram abordadas, mas também questões relacionadas à reação imune às células transplantadas, bem como questões relacionadas ao tamanho do portador celular. Um estudo com macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) descreveu os resultados do implante sub-retiniano de monocamadas de EPR derivadas de células-tronco humanas15. Todos os animais foram submetidos à imunossupressão sistêmica, que consistiu de sirolimo (dose de ataque de 2 mg, dose diária de 1 mg) e tetraciclina (7,5 mg/kg– PC) com início 7 dias antes da cirurgia e duração de 3 meses após a cirurgia. O procedimento cirúrgico foi realizado de acordo com protocolos descritos anteriormente24,25. Os autores utilizaram uma abordagem PPV de três portas de 25 G com endo-iluminação do lustre. É importante ressaltar que uma DVP assistida por AT foi usada para excluir adesão vitreorretiniana residual na retina posterior. Como um acréscimo ao procedimento originalmente descrito, os autores removeram a camada de EPR do hospedeiro na área de implantação futura usando um instrumento de loop extensível personalizado de 20 G.

Em nosso estudo com miniporcos, também usamos imunossupressão sistêmica. Entretanto, o tipo de imunossupressão diferiu do descrito acima. Administramos uma injeção subcutânea de microesferas de polímero eluidoras de tacrolimus como depósito na dose de 0,25 mg/kg PV para dificultar a rejeição do enxerto celular e as reações inflamatórias. Não removemos a camada de células PSE do hospedeiro durante a cirurgia, pois nosso objetivo primário era analisar a segurança do procedimento e a viabilidade das células implantadas, mas não sua integração na retina do hospedeiro.

Previamente, a segurança e a viabilidade do implante sub-retiniano de uma monocamada de EPRs derivados da hESC em uma membrana submire-C submireno-C não degradável não degradável suportada em tela (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm de espessura) foi avaliada em 14 miniporcos fêmeas de Yucatán10. Após o cultivo, as células foram semeadas em uma membrana suportada em tela. A imunossupressão foi realizada com administração sistêmica de tacrolimo (sem regime e dose indicados) e injeções intravítreas de 0,7 mg de implante de dexametasona ao final da cirurgia. O VPP foi realizado com abordagem de 20 G. Os autores utilizaram uma injeção intravítrea de acetonido de triancinolona para melhor visualização do corpo vítreo. A esclerotomia grande tinha de 2 mm a 3 mm. Após a injeção sub-retiniana, a retina foi achatada com uma injeção temporária de líquido perfluorocarbonado. Após a troca líquido-ar, foi realizado tamponamento com óleo de silicone (1.000/5.000 cSt). Os cuidados pós-operatórios incluíram a aplicação ocular de pomada de dexametasona/neomicina/polimixina B 1 semana após a cirurgia. Os autores relataram uma taxa de sucesso de 91% (isto é, implante sub-retiniano eficiente e dados de imagem pós-operatórios suficientes). Em nosso estudo, a injeção intravítrea de cristais de AT foi utilizada no intraoperatório e principalmente para visualização do corpo vítreo. No entanto, a ação imunossupressora local dessa droga permanece obscura. Os carreadores de células nanofibrosas utilizados em nosso estudo tinham 5,2 mm x 2,1 mm e 3,7 μm de espessura, com poros de 0,4 μm. Durante a cirurgia, realizamos FAX direto em vez de injetar líquido perfluorocarbonado. Nossa taxa de sucesso cirúrgico (93,1%) foi consistente e ligeiramente melhor que a de Koss et al.10.

O transplante sub-retiniano de portadores de células totalmente degradáveis (scaffold) para implantação sub-retiniana foi estudado pela primeira vez em 2019 em porcos de Yorkshire14. O estudo foi focado principalmente nas características biodegradáveis de implantes de hidrogel de fibrina. Os autores observaram que a imunossupressão agressiva utilizada nos porcos domésticos poderia inibir uma reação inflamatória local potencialmente causada durante a biodegradação dos implantes de hidrogel de fibrina. No entanto, não especificaram a terapia imunossupressora utilizada nos suínos. Durante a VPP, realizaram uma esclerotomia de 3,6 mm de comprimento para inserção do dispositivo de implante sub-retiniano paralelo e aproximadamente 3,5 mm posterior ao limbo. Além disso, utilizaram um sistema de injeção pneumática com o objetivo de reduzir a instabilidade do posicionamento das mãos causada pela manipulação dos dedos. Em nossa casuística, todas as esclerotomias estavam a 2,5 mm a 3,0 mm do limbo. A grande esclerotomia para a inserção do injetor tinha 3 mm de comprimento. O implante injetor utilizado em nosso estudo foi operado manualmente. A cauterização completa da pars plana do corpo ciliar e um corte suficiente no interior da grande esclerotomia parecem ser cruciais para evitar complicações intraoperatórias, como descolamento de retina periférica iatrogênica, sangramento e perda do implante.

Em resumo, descrevemos o uso do modelo de miniporco de Liběchov para o transplante de células RPE em portadores biodegradáveis como opção de tratamento para doenças hereditárias e adquiridas da retina. Semelhanças na anatomia e fisiologia ocular, bem como no que diz respeito ao sistema imunológico, nos permitem desenvolver e aprimorar as técnicas cirúrgicas e instrumentação para a implantação sub-retiniana de células, que podem ser facilmente transferidas para o tratamento de doenças oculares humanas. É importante assegurar que as cirurgias em miniporcos sejam realizadas utilizando a mesma instrumentação (incluindo ferramentas de liberação de implantes) quando utilizadas em cirurgias humanas, facilitando assim a aplicação da experiência adquirida e do know-how em humanos. Modelos animais alternativos de olhos grandes com a presença de uma área macular, como primatas não humanos, poderiam ser úteis para o acompanhamento e análise das alterações anatômicas e funcionais após o implante sub-retiniano na área central da retina. A descrição detalhada dos cuidados pré-operatórios, cirúrgicos e pós-operatórios será útil para estudos futuros, aumentando a geração de dados eficiente e padronizada.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O projeto foi apoiado pela Fundação Tcheca de Ciência (Projeto Número 18-04393S) e pela Agência de Subsídios e Tecnologia da Noruega da República Tcheca (Programa KAPPA, Número do Projeto TO01000107).

Materials

Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 Mindray, Shenzhen, China Wato Ex-65 anesthesia machine
R-Evolution CR Optikon, Rome, Italy R-Evolution CR phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α Meridian, Thun, Switzerland Merilas 532α ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) Hi-R NEO 900A ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD Sony, Tokyo, Japan PMW-10MD full HD medical 2-piece 
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM Volk, Mentor, OH, USA MERLIN BIOM BIOM
Steam sterilizer Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL 3870 HSG sterilizer
iCam100 Optovue, Fremont, CA, USA iCAM100 funduscamera
iVue OCT100-2 Optovue, Fremont, CA, USA iVue OCT100-2 OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum Katena, New Jersey, US K1-5403 15mm blades
Ophthalmology surgical drape Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA 79304 132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) DORC, Zuidland, Netherlands 1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula DORC, Zuidland, Netherlands 1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up Surgical Specialties Corporation, Reading, USA 72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) DORC, Zuidland, Netherlands 1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe BBraun, Melsungen, Germany 4617022V 3ml
1ml soft-inject Tuberculin Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany 5010.200V0 1ml
8-0 Coated Vicryl Ethicon, Puerto Rico, USA J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml (FCI, Paris, France) S5.7170 1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga Synergetics, O'Fallon, USA 10.24.23PIN 23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps Alcon, Geneva, Switzerland 706.44 Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe  Synergetics, O’Fallon, USA 55.21.23
FCI Protect 2.0% FCI Ophthalmics, Paris, France S5.9100 viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 1-501 Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 2-100-1E 0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 2-504E 6mm
DK Needle Holder, Straigh Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 3-201 9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.  UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic tropicamidum 10 mg/ml eye drops
Diprophos Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands betamethasonum 7 mg/ml 1ml
Alcon BSS Irrigation Solution Alcon, Geneva, Switzerland balance salt solution (BSS) 500ml
Betaisodona Mundipharma, Cambridge, United Kingdom povidon-Iodine 1g/10ml 30ml
Depo-medrol 120mg Pfizer, New Yourk, USA methylprednisolon 5ml/200mg
Shotapen Virbac Carros Cedex, France benzylpenicillin, dihydrostreptomycin 250ml
Flunixin a.u.v. Norbrook, Newry, Northern Ireland flunixinum 50,0 mg 250ml
Tramal 100MG/2ML Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland tramadol 2ml
Zoletil 100 Virbac Carros Cedex, France tiletamine, zolazepam 100mg
Narkeran 10 Vetoquinol, Magny-Vernois, France ketamin 2ml
Rometar 20mg/ml Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic xylazinum 20mg
Braunol 75mg/g B.Braun medical, Prague, Czech republic povidone iodine 75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland propofol 10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom isoflurane 100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml Unimed pharma, Bratislava, Slovakia oxybuprakaine 10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.  Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland fenylefrin chloride 10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate 5mg
Floxal ung. Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany ofloxacin 0.30%
Eficur inj.  Hipra, Amer, Spain ceftiofurum hydrochloridum  50mg / 1ml
Draxxin Zoetis Inc., New Jersey, USA tulathromycinum 100mg / 1ml
Tramal Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland tramadoli hydrochloridum 100mg / 2ml
Xylapan Vetoquinol, Magny-Vernois, France xylazinum 0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA Proparacaine hydrochlorid 0.50%
Prograf  Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA Tacrolimus powder 1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts Corning Inc., Kenneburg, ME, USA 353103
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 12604021
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11320033
Biolaminin 521 LN (LN521) BioLamina, Sundbyberg, Sweden LN521-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific, MA, USA 35050061
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific, MA, USA J66742.0B
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA P4333
CRALBP Novus Biologicals, Abingdon, UK NB100-74392
Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Germany  21202
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Lytvynchuk, L., Stranak, Z., Studenovska, H., Rais, D., Popelka, Š., Tichotová, L., Nemesh, Y., Kolesnikova, A., Nyshchuk, R., Brymová, A., Ellederová, Z., Čížková, J., Juhásová, J., Juhás, Š., Jendelová, P., Nagymihály, R., Kozak, I., Erceg, S., Binder, S., Müller, B., Stieger, K., Motlik, J., Petrovski, G., Ardan, T. Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care. J. Vis. Exp. (189), e63505, doi:10.3791/63505 (2022).
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