ミニブタのキャリアへのRPEの網膜下移植:術前準備、手術手技、および術後ケアのガイドライン

この研究は、ヘルシンキ宣言のガイドラインの信条と、人間を対象とする医学研究の倫理原則に準拠しています。すべての実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドライン、および眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)に従って実施されました。研究プロトコルは、チェコ科学アカデミーの動物生理学および遺伝学研究所(チェコ共和国リビェホフ)の動物実験プロジェクトの承認のためにCASのリゾート専門家委員会によって承認されました(承認されたプロトコル番号60/2016および第64/2019)。 1. 担体上の細胞のミニブタへの網膜下移植時の考察 動物の選択生後12〜36か月、性別を問わず、体重(BW)が約40〜80 kgのLiběchovミニブタを入手して使用します。 ミニブタを、温度が18〜22°C、人工的な13時間/ 11時間の明暗サイクル、標準化された個々のペン、水への無料アクセス、および1日2回の給餌で、エアコン付きの動物小屋で屋内に保管してください。 手術前の準備目の外科的向きを確認し、眼底スキームを描きます。そのためには、縦線のペンを使用して、眼底図のミニブタの網膜を側頭(視神経乳頭から耳に向かって)、鼻(視神経乳頭からブタの鼻に向かって)、および中央(鼻側の主要な網膜血管の間)領域に概略的に分割します(図1A、B)。 行動的および神経学的病理がなく、皮膚、体の開口部、糞便、および食物消費の質が正常な健康な動物のみを選択してください。熟練した獣医師に臨床観察を行ってもらい、動物を選択します。 手術当日に塩酸セフチオフル(1 mL / kg)の3 mg / kgBWを筋肉内注射します。. 術前免疫抑制タクロリムス溶出ポリマーミクロスフェアを改変してWangらおよびSevcら32,33に記載されているように調製する。 ポリマーミクロスフェア中のタクロリムスの濃度がHPLC(材料表)によって決定されるように51.3 mg / gであることを確認してください。. 細胞移植片の拒絶反応を妨げるために、眼科手術の6日前にタクロリムスを装填したポリマーミクロスフェアを0.25 mg / kg BWの用量で皮下注射します。.これは、ミニブタの眼への異種移植中のヒトRPEドナー細胞の生存を確実にするために行われる。 手術当日に、体重に応じて80 mgのデポメドロールとベンジルペニシリンを1 mL / 10 kgで筋肉内注射します。. 麻酔手術前に、チレタミン(2 mg / kg)、ゾラゼパム(2 mg / kg)、ケタミン(2 mg / kg)、およびキシラジン(0.4 mg / kg)-TKX34,35の混合物の筋肉内注射で全身麻酔を誘発します。.意識不明の状態と、ペダル反射(後脚の指間皮膚のつまみ)、角膜反射(角膜のわずかな接触)、瞳孔反射(光への反応)、眼瞼反射(まぶたへの接触)をチェックして、麻酔の深さを確認します。動物が点滅しないようにしてください。心臓と呼吸数の規則性を確認します。 麻酔導入後、鎮静動物をリフトトロリーで手術室に輸送する(図2A)。 動物を左側の手術台に置き、右目の手術を可能にします(図2B)。 発泡スチロールパッドを使用して動物の頭の調整を行い、移植に最適な中央網膜の位置(つまり、床に対して水平および平行)を実現します(図2C)。 0.5%塩酸プロパラカイン点眼液の点眼薬を結膜嚢に1分間隔で3回入れ、局所麻酔を誘発します。. 静脈カニューレを挿入し、患者モニターを備えた麻酔器を使用して麻酔(1.5%イソフルラン)の吸入維持のために気管内チューブで動物に挿管します(図2A、B)。 眼科手術開始の約15分前に、16 kg BWあたり1 mLのエフィカーと20 mgのデポメドロール1の筋肉内注射を投与します(材料表)。 動物を等温ホイルで覆うことによって生理学的体温を維持し、セクション3で説明されているように手術を行います。 手術中は、イヤークリップと患者モニターを使用して、心拍数と血中酸素飽和度とともに動物の体温を監視します。安全限界36と見なされる処置中の体温の38°C未満の低下は避けてください。実験全体を通して、酸素飽和度(>96%)と脈拍数(毎分70〜90拍)を維持します。 手術が完了したら、イソフルランの流れを止めて動物を抜管します。 自発呼吸と目覚めの後、動物をペンに移します。 手術室のセットアップ大眼動物モデルの目の手術の必要性に応じて手術室を配置します(図3A、B)。外科医の椅子の高さと顕微鏡の高さを調整して、ブタの鼻の位置に関して外科医にとって快適な位置を実現します。 図1:ミニブタの網膜帯の模式図。 (A)ミニブタの頭部に対する網膜帯の模式図。黄色の楕円は網膜下移植の所望の領域を示し、Tは側頭網膜領域を指し、Nは鼻網膜領域を指す。(B)網膜切開術(赤)による細胞キャリア(黄色)の網膜下移植後の眼底スキームの例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:動物の輸送と配置 。 (A)鎮静された動物の手術室への輸送。(B)挿管中の動物の配置。(C)手術中に中心網膜への最適なアクセスのための動物の頭部の調整(赤い矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:標準的な手術室のセットアップ 。 (A)ミニブタ、手術顕微鏡(OM)、硝子体切除装置(VM)、器械台(IT)、麻酔器(AM)を備えた手術台の位置に対する外科医の位置(S =外科医、A =助手)の概略図。硝子体切除術機には2つの可能な位置(黄色と灰色)があります。(B)手術室での実際の設定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2.細胞キャリア、培養細胞培養、および移植インジェクター セルキャリア厚さ36μmのポリエチレンテレフタレート(PET)箔から、フレーム上に非対称に配置された三角形の突起を備えた、外形寸法1.7mm x 4.8mmの幅30μmの楕円形フレーム(図4A)を、フェムト秒レーザーを使用して切断します。 溶液1 gあたり2.2 μLのギ酸を添加して、ピリジン中のポリ(L-ラクチド-co-DL-ラクチド)(LLA/DLLA 90/10、MW 868、270 g / mol)ポリマー溶液を11 wt%の濃度で調製します。 ポリマー溶液のエレクトロスピニングにより、支持フレームが埋め込まれたナノファイバー膜(図4B)を3つのステップ8で準備します:(1)シリコン基板上にナノファイバーの第1層を堆積し、(2)層上にフレームを配置し、(3)ナノファイバーの第2層を堆積します。注:すべての層を7分間堆積させて、膜の総厚さ3.7μmに到達します。厚さ380 nmの繊維で構成され、平均孔径が0.4 μm、空隙率が約70のメンブレンを得るには、20 Gの全鋼針、電圧7.1 kV、ギャップ10 cm、流速250 μL/min、温度25.0 °C±0.5 °Cのパラメータを使用します。 フレームが埋め込まれたメンブレンをシリコン基板から慎重に取り外し、元のメンブレンのない市販の12ウェル細胞培養インサートの本体に固定して、細胞の播種と成長を促進します。 細胞播種前にナノ繊維膜をプラズマ中で70Wの電力で30秒間プラズマクリーナーで処理します。 細胞担体上での培養に用いる細胞培養注:以下の細胞担体を使用することができる:1)細胞を含まないナノ繊維状細胞担体。2)初代ヒトRPE(hRPE)を有するナノファイバー状細胞キャリア;3)ヒトiPS細胞由来RPE細胞を有するナノファイバー状細胞キャリア。初代hRPEの培養 初代hRPE細胞をヒトドナー眼から単離することは、既報の技術に従って38である。 網膜を30分間酵素処理して細胞を得る。その後、初代hRPE細胞(継代0)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/F12中で最大2週間培養します。 細胞培養がコンフルエントに達したら、培地を1Sに変更し、さらに30日間培養します。 初代hRPEをトランスウェルプレート上およびラミニンコーティングされたナノファイバー状細胞担体上に2,000細胞/mm2の密度で播種します。1Sでさらに30日間インキュベートした後、ミニブタへの網膜下移植に一次hRPEを含む細胞キャリアを使用します。 ヒトiPS細胞由来RPECRISPR/Cas9システムを用いて2つの対立遺伝子で遺伝子補正されたMERTK関連網膜色素変性症患者由来の線維芽細胞39 由来のhiPSC(RP1-FiPS4F1-GC2)40、および対照として使用される健常者の線維芽細胞由来のhiPSC(Ctrl2-FiPS5F2)41 を使用します。 以前に報告されているようにRPE細胞(hiPSC-RPE)に向けて両方のhiPSC細胞株を生成し、続いて分化させる42。 ノックアウトDMEM、20%ノックアウト血清、0.1 mM非必須アミノ酸、0.23 mM β-メルカプトエタノール、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、および10 mMニコチンアミドを含むRPE培地に、楕円形の移植フレームを備えたポリ(L-ラクチド-co-DL-ラクチド)のナノファイバー膜を備えたラミニンコーティング細胞培養インサートにhiPSC-RPEを200,000細胞/cm2 でプレートします。 1日おきに培地を交換し、移植前に2ヶ月間hiPSC-RPEを培養して分極増殖を促します。 埋め込み型インジェクター外径1.75 mm/内径1.10 mmのプラスチックチューブからブロー成形により、断面2.8 mm x 0.8 mmの長方形のプラスチックキャピラリーを準備します。 端から4 mmのプラスチックキャピラリーで2.2 mm x 6 mmのローディングウィンドウを切り取ります。 プラスチックキャピラリー、シリコンハンドル、スチールブレードプランジャー、およびピストンからインジェクターを組み立てます(図5A)。 ローディングウィンドウを介してキャリアをインジェクターにロードし、後で手順3.5.2(図5B)で説明されているように、プランジャーを押して網膜下腔に排出します。 ナノ繊維状担体の調製およびインジェクタの装填小さなプラスチック製のペトリ皿に2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れます。準備した細胞層でインサートを取り出し、半柔らかいポリスチレン皿の上に置き、光学顕微鏡で中央に配置します。カスタム修正されたパンチを使用して、顕微鏡を使用して楕円形のフレームに沿ってキャリアを切り取ります。キャリアの寸法は2 mm x 5 mmです。 キャリアを装填するために、平らな透明なチューブを備えたカスタムメイドのインジェクターを使用してください。キャピラリーの遠位端から6mmのところに、キャリアを装填するための窓がある。インジェクターのウィンドウをPBSで満たします。 鉗子を使用して、ディッシュの底からサンプルを放出し、液体から持ち上げ、最初にフレームの側面の向きマークを確認しながらインジェクターの窓に輸送し、接着細胞のあるキャリアの上面を検出します。楕円形のフレームは、キャリアの操作を容易にします。 歯科用プローブ(先端が鋭いステンレス鋼の歯科用器具)を使用して、キャリアをインジェクターの窓に配置します。プランジャーを使用して、キャリアをインジェクターの閉じた安全な上部に押し込みます。次に、手術のためにキャリアを準備します。 各ステップでキャリアの側面の向きを確認してください。金属プランジャーを押して、ナノファイバーキャリアをインジェクターからアンロードします。 図4:支持PETフレームが埋め込まれたナノ繊維キャリア。 (A)フレーム上の3つの目に見えるマークにより、キャリアの側面の向きを制御できます(白い矢印)。(b)細胞担体のナノ繊維膜に埋め込まれたPETフレーム断片の拡大図(白抜き矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:植込みインジェクター 。 (A)インジェクターの部品。(B)移植インジェクターのプラスチック長方形キャピラリーに装填された埋め込み支持PETフレームを備えたナノ繊維状細胞キャリア。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3.外科的処置 手術器具次の手術機器を使用してください:眼科手術用顕微鏡、前眼部と後眼部の手術用のオペレーティングシステム、非接触硝子体網膜手術システム、レーザー光凝固装置、およびデジタルカメラ。注:硝子体切除術、外焼灼および内視鏡、およびレーザー光凝固装置で使用される標準パラメータを 表1に示します。 手術器具再利用可能な手術器具は、標準的なプロトコルに従って、移動式オートクレーブ蒸気滅菌器または同様のもので滅菌します。手術中に必要な使い捨ての手術器具および材料は、 材料の表に記載されています。 手術ステップの準備ステップ1.4.1に記載されるように動物に麻酔をかけた後、薬物誘発散瞳を誘発する処置の15分前に結膜嚢に1%トロピカミド溶液点眼薬および10%塩酸フェニレフリン溶液を塗布する。 外科医を上の位置に、助手を横の位置にして手術台に近づきます(図3)。 使い捨てのシェービングカミソリで目元を剃り、ざらざらした汚れを取り除きます。 結膜嚢を5%ポビドンヨード溶液で5分間消毒する。 まぶたから周辺までこすり洗いして、綿棒で眼窩周囲を消毒します。10%ポビドンヨード溶液を使用してこのプロセスを3回繰り返し、5分間そのままにします。 粘着性のある透明なホイルを備えた標準的な滅菌眼科用ドレープを使用して、中央の目で手術野を覆います。まつげをアイグローブから離します。術後の眼内炎のリスクを減らすためにまつげを切ることは避けてください。 蓋の検鏡(リーベルマンタイプまたはクックアイスペキュラム)を挿入します。必要に応じて、硝化膜を8-0で皮膚に固定しますポリグラクチン縫合糸。 外科用鉗子とウェストコット結膜ハサミを使用して強膜を露出させるために、リンバスから2 mmから3 mmの鼻側の結膜を開きます。 3バルブの25 Gトロカールをリンバスから2.5〜3 mm、パースプラナの領域に挿入します(7時、10時、11時に置きます)。挿入中は、後網膜に向かってわずかに斜め(100°〜110°)で回転運動を使用し、鉗子でトロカールを保持します(図6)。 浸透圧性角膜浮腫を防ぐために、手術中は角膜を濡らしておくか、メチルセルロースでコーティングしてください。 扁平硝子体切除術(PPV)標準的な3ポートパープラナ硝子体切除アプローチで硝子体の中央部分を取り除きます。将来の大硬化切開術の領域でレンズの後ろの硝子体を慎重に取り除きます。 制御された後部硝子体剥離を行うために、硝子体内2〜4mgのトリアムシノロンアセトニド(TA)注射(50〜100μL)を使用して、通常は網膜に付着したままである後部硝子体を染色する。 その後、0.05〜0.1 mLのBSSの網膜下注射をゆっくりと行い、41 Gのカニューレをより中央に行い、末梢に向かってブレブが形成されないようにします。 一過性の網膜血管閉塞を防ぐために、網膜下注射中に灌漑システムで眼圧設定を15mmHgまで下げます。. 鼻ブレブ基部の近くに27 Gのエンドジアテルミープローブを使用して、網膜の線形の大きなエンドジアテルミーを実行します。 その後、25 G MVRブレードまたは垂直ハサミを使用して3 mmの大きな網膜切開を行い、灌漑システムの眼圧(IOP)設定を最大60 mmHgに3分間〜5分間上げます。網膜切開術による出血がないことを確認してから、IOPを25 mmHgに下げます。 強膜の表面に穏やかなタッチを適用することにより、27Gの内視鏡プローブを使用して、リンバスから2.5〜3 mmの2つの鼻トロカールの間の上膜血管のエキソジアテルミーを実行します。 強膜切開の拡大後、水分消費量が一時的に多いため、強膜切開を拡大する前に輸液ボトルの液面を確認してください。 2.75 mmのファコナイフを使用して、リンバスから3 mmのところに3.0 mmの大きな硬化性切開術を行います。 大強膜切開術内の強膜血管および毛様体からの出血の可能性に注意してください。出血の場合は、27 Gのエンドジアテルミープローブを使用して損傷した血管を凝固させます。インジェクターの先端(0.8 mm x 2.8 mm)を収容するために、サテンナイフで硬化切開術を3.0 mmに拡大します。 硝子体で大きな強膜切開部位の脱出した硝子体を取り除きます。地球儀の崩壊を避けるために硝子体切除術システムを使用してBSSの注入を25〜30 mmHgのレベルに維持します。 細胞担体の移植利き手でインジェクターを大きな強膜切開術を通して硝子体腔にそっと挿入します。抵抗がある場合は、強膜切開のサイズを拡大します。 網膜切開術を通して細胞キャリアを網膜下腔に移植する。必要に応じて、移植の制御を改善するために、追加の硬化切開術とシャンデリアライトを備えたバイマニュアル技術を使用してください。 インジェクターを目から引き出し、8-0で大硬化膜切開を閉じます眼内低張に関連する合併症を回避するためのポリグラクチン縫合糸。 完全な流体 – 空気交換(FAX)を行い、シリコンチップカニューレで網膜下液の排液を行います。 その後、眼圧が正常になるまで、硝子体切除システムとシリコーンオイル注入用のチューブシステムを使用して、シリコーンオイル(1,000 cSt)を硝子体腔に注入します。 術中のイメージングとドキュメンテーションビデオ録画システムを使用して、移植の重要なステップの写真文書化を使用して、手術全体を通してビデオ録画を実行します。 眼底採取スキーマを使用して、硬化切開、網膜切開術、網膜下インプラント、および発生した合併症の位置を文書化することにより、眼底図を完成させます。 手術後の手順手術の終わりに、トロカールを取り除き、3つの硬化切開と結膜を8-0で閉じますポリグラクチン縫合糸。 結膜嚢を5%ポビドンヨード溶液ですすいでください。 20 mgのゲンタマイシン、2 mgのデキサメタゾン、および2%キシロカインの0.3 mL結膜下注射を行います。 眼底と水晶体の状態を顕微鏡で確認します。 外科用鉗子とウェストコット結膜はさみ(オプション)を使用して、乳炎膜から縫合糸を取り除きます。 ネオマイシン軟膏またはオフロキサシン眼軟膏を結膜嚢に塗布する。 図6:ミニブタの目へのトロカールの挿入。 (A)水晶体の損傷を避けるために、ヒトの眼では硝子体腔の中心に向かって強膜に垂直に挿入され(灰色)、ミニブタの眼では後網膜に向かって斜めに挿入されるトロカールの概略図(青色)。ミニブタの水晶体(青色)は、ヒトのそれよりも大きく、硝子体腔のサイズに比べて大きい。(B)3ポートPPVに挿入されたトロカールの術中ビュー。角膜はメチルセルロースで覆われており、乾燥や腫れを防ぎます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4.術後ケア 局所バシトラシン亜鉛/酢酸ヒドロコルチゾン/硫酸ネオマイシンまたは0.3%オフロキサシンを動物の結膜嚢に1日5回塗布します。. 術後、次の眼のパラメータを確認してください:触診を使用した眼の軟部組織の膨満、眼表面の炎症反応、およびハンドヘルドスリットランプまたは間接検眼鏡を使用したまぶたの保護反応としての斜視。 全身術後ケアには、以下の抗生物質を使用してください。安定性の2日目と3日目に3 mg / kg BW(1 mL / kg)の用量で塩酸セフチオフルを筋肉内注射します。. 二次細菌感染の予防のために、術後72時間後にツラスロマイシン(1 mL / 40 kg BW)を注射します。. 痛みを防ぐために、フルニキシン(2 mL / 45 kgの生体重)と塩酸トラマドール(100 mg)を手術後3日間、24時間ごとに筋肉内注射を行います。. ミニブタは、18〜22°Cの温度範囲と人工的な13時間/ 11時間の明暗体制を備えた特殊な空調施設に保管してください。 彼らが水と標準的な給餌(1日2回)に自由にアクセスできるようにします。 5.術後処置 術後眼科検査術後の期間に、間接検眼鏡で炎症の存在(すなわち、結膜嚢の発赤、組織の腫脹、または粘液の鬱血)を検査します。触診法を用いて手術眼の眼圧を測定します。 術後イメージング眼底写真およびOCT検査の前にTKX混合物の筋肉内注射によってミニブタに鎮静を誘発する。散瞳を誘発するために、1%トロピカミドと10%塩酸フェニレフリン点眼薬をミニブタの結膜嚢に注入します。. 開いた目を維持するために蓋検鏡を使用します。目の表面に潤いを与え、鮮明なOCT画像を得るために、動物の角膜を生理食塩水(0.9%NaCl)で30〜60秒ごとに洗浄します。 手術中と同じ方法でミニピッグを手術台に置きます(図2B、C、図3A)。主な要件は、ヘッドをOCTデバイスのスキャンピースに対して垂直に側面に配置することです。動物の鼻の下に発泡スチロールのパッドを使用して頭を安定させ、目の表面を水平位置にします。 カラー非散瞳眼底カメラでカラー眼底画像を収集すると、前眼部、網膜、視神経乳頭を記録できます。さらに、非散瞳眼底カメラで網膜の赤のない画像を撮ります。 スペクトル領域OCTシステムを用いた光干渉断層撮影イメージングを行う。OCTまたは眼底イメージング中に、ミニブタの頭をOCTレンズまたは眼底カメラレンズに向かって手動で傾けて、後網膜の視野と移植領域を最適化します(図2C)。眼底に埋め込まれたキャリアを最適にイメージングするには、OCTデバイスの赤外線反射光をインプラントに焦点を合わせます(図2C)。OCT クロスラインおよび網膜マップ スキャン モードを使用します。 動物の眼の蓋の下に検査の最後にオフロキサシン眼科用軟膏を塗布する。 ミニブタを屋内施設に移動し、鎮静が終了するまで(約2時間から5時間)その一般的な状態を観察します。 6.安楽死後の眼の摘出 TKX混合物の筋肉内注射とそれに続く1%プロポフォール(20 mL /動物)の静脈内(22 G耳カニューレによる)ボーラス適用とそれに続く放血でミニブタを鎮静させます。.一般的な固定剤は使用しないでください。 細胞移植移植後7日、14日、28日、および42日の深部全身麻酔中に放血によって動物を屠殺する。 鉗子とはさみを使用して、上まぶたと下まぶたを取り外します。3番目のまぶたを外し、結膜を切ります。目の筋肉と視神経を切断します。 外科用ハサミと外科用鉗子を使用して死後に目を除核します。手順が経験豊富な人によって実行されることを確認してください。