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Bioengineering

Impianto sottoretinico di RPE su un portatore in maialini: linee guida per preparazioni preoperatorie, tecniche chirurgiche e cure postoperatorie

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/63505
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1Eye Clinic, Department of Ophthalmology,University Hospital Giessen and Marburg GmbH, 2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging, 3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine,Charles University in Prague, 4Institute of Macromolecular Chemistry,Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics,Czech Academy of Sciences, 6Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 7Institute of Experimental Medicine,Czech Academy of Sciences, 8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine,University of Oslo, 9Moorfields Eye Hospitals UAE, 10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab,Research Center “Principe Felipe”, 11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology,Sigmund Freud University

Summary

L’impianto sottoretinico dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) è uno degli approcci più promettenti per il trattamento delle malattie degenerative della retina. Tuttavia, le prestazioni degli studi preclinici su modelli animali di grandi occhi rimangono impegnative. Questo rapporto presenta le linee guida per il trapianto sottoretinico di RPE su un vettore cellulare in maialini.

Abstract

Le malattie degenerative della retina (compresa la degenerazione maculare legata all’età), che hanno origine principalmente in corrispondenza o all’interno dello strato epiteliale pigmentato retinico (RPE), portano a una progressiva disorganizzazione dell’anatomia retinica e al deterioramento della funzione visiva. La sostituzione delle cellule RPE danneggiate (RPE) con cellule RPE in coltura in vitro utilizzando un vettore cellulare sottoretinico ha mostrato il potenziale per ristabilire la struttura anatomica degli strati retinici esterni ed è, pertanto, oggetto di ulteriori studi. Qui, presentiamo i principi di una tecnica chirurgica che consente l’efficace trapianto sottoretinico di un vettore cellulare con RPE coltivati in minipig. Gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia generale e comprendevano una vitrectomia pars plana standard (PPV) a tre porte, l’applicazione sottoretinica di una soluzione salina bilanciata (BSS), una retinotomia da 2,7 mm, l’impianto di un vettore cellulare nanofibroso nello spazio sottoretinico attraverso un’ulteriore sclerotomia da 3,0 mm, lo scambio fluido-aria (FAX), il tamponamento con olio di silicone e la chiusura di tutte le sclerotomie. Questo approccio chirurgico è stato utilizzato in 29 interventi chirurgici (18 animali) negli ultimi 8 anni con un tasso di successo del 93,1%. La verifica anatomica del posizionamento chirurgico è stata effettuata utilizzando l’imaging del fondo oculare in vivo (fotografia del fondo oculare e tomografia a coerenza ottica). Le fasi chirurgiche raccomandate per l’impianto sottoretinico di RPE su un portatore in occhi minipig possono essere utilizzate in futuri studi preclinici utilizzando modelli animali con occhi grandi.

Introduction

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è considerata la causa principale della perdita della vista centrale nei paesi sviluppati ed è una delle molte condizioni correlate alla disfunzione dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) 1,2. L’RPE si trova sulla membrana di Bruch (BM) localizzata in posizione basale e fornisce la manutenzione necessaria per i fotorecettori. La progressiva degenerazione dello strato RPE è un segno distintivo della prima forma atrofica di AMD e accompagna anche lo sviluppo della forma essudativa tardiva di AMD. Nonostante i molti progressi nella terapia delle malattie retiniche, lo sviluppo di una modalità di trattamento efficace rimane impegnativo3. Uno dei metodi promettenti è la sostituzione dell’RPE utilizzando uno strato di RPE coltivato in vitro. Questo trattamento è associato ai progressi nella ricerca sulle cellule staminali utilizzando RPE derivato da cellule staminali embrionali umane (hESC-RPE) e RPE derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. Negli ultimi anni, molti gruppi di ricerca si sono concentrati sullo sviluppo di diversi approcci per la sostituzione dell’RPE con il proof-of-concept inizialmente accettato 8,9,10,11,12,13,14,15. Le cellule RPE (RPE) vengono solitamente consegnate nello spazio sottoretinico sotto forma di sospensione cellulare, foglio cellulare autoportante o monostrato cellulare supportato da un vettore artificiale 3,16,17,18,19,20,21. L’iniezione di una sospensione cellulare è il metodo più semplice, ma la condizione compromessa del BM può spesso impedire l’attaccamento delle cellule trapiantate. Ciò può comportare un errato orientamento apicobasale degli RPE e la mancata formazione di un monostrato22,23. Il vantaggio principale degli altri due metodi (cioè un foglio cellulare autoportante e un monostrato cellulare supportato da un substrato artificiale) è che le cellule sono già in uno stato monostrato differenziato quando impiantate direttamente nello spazio sottoretinico24.

Molte tecniche chirurgiche che descrivono la consegna di portatori cellulari nello spazio sottoretinico sono state pubblicate negli ultimi anni 8,9,10,11,12,13,14,15. Questi studi hanno descritto l’uso di modelli animali con grandi occhi, i tipi di vettori cellulari, l’uso di colture cellulari trapiantate, gli strumenti di impianto, nonché le tecniche chirurgiche, e gli autori si sono concentrati principalmente sui risultati dell’impianto sottoretinico. Nel 2015, Popelka et al. hanno riportato l’uso di una membrana polimerica elettrofilata ultrasottile supportata da telaio per il trapianto di RPE negli occhi del cadavere suino8. La tecnica chirurgica qui descritta con l’impianto sottoretinico del supporto cellulare ha permesso una manipolazione relativamente precisa del supporto e un facile posizionamento dell’impalcatura nello spazio sottoretinico. Kozak et al. hanno valutato la fattibilità della tecnica di consegna di un vettore con una dimensione approssimativa di 2 mm x 5 mm in occhi suini9. Il design unico del supporto cellulare ha permesso il suo corretto posizionamento, impedendo al monostrato cellulare di piegarsi e raggrinzire6. Al-Nawaiseh et al. hanno presentato per la prima volta linee guida dettagliate passo-passo per l’impianto di scaffold sottoretinici nei conigli25. Stanzel et al. hanno poi pubblicato un protocollo simile nel 2019 per il trapianto in piccoli roditori, conigli, maiali e primati non umani26. Come pubblicato in precedenza, il trapianto di un monostrato RPE differenziato e polarizzato su un supporto solido ha comportato una migliore sopravvivenza e una migliore integrazione dell’innesto rispetto ad altre tecniche di consegna (Supplementary File 1)27.

Lo scopo di qualsiasi studio preclinico su animali eseguito in vivo è quello di rivelare i vari aspetti dell’impianto sottoretinico transvitreale chirurgico di un vettore cellulare con particolare attenzione alla sicurezza della procedura, alla sopravvivenza delle cellule trapiantate, alla risposta tissutale alle manovre sottoretiniche e agli esiti postoperatori a breve e lungo termine. L’uso di occhi suini come modello animale con occhi grandi è stato segnalato per essere rilevante in termini di portata dei dati ottenuti, che potrebbero essere utili e potenzialmente applicabili agli esseri umani10,11,14. Il nostro studio riporta la tecnica chirurgica utilizzata per l’impianto sottoretinico in vivo di un vettore cellulare in un modello animale di grande occhio. Presentiamo una descrizione dettagliata dei preparati preoperatori, la tecnica chirurgica di impianto del supporto cellulare sottoretinico e la cura postoperatoria degli occhi del maialino sulla base della nostra esperienza negli ultimi 8 anni. Descriviamo i principi chirurgici di base che possono essere utilizzati per studi sperimentali in vivo che coinvolgono l’impianto di diversi tipi di cellule e vettori cellulari.

Modello animale di grandi dimensioni
La mandria sperimentale di maialini Liběchov è stata fondata importando cinque animali dal ceppo Hormel dagli Stati Uniti nel 1967. Questi animali sono stati incrociati per studi sui gruppi sanguigni suini con diverse altre razze o ceppi: Landrace, Large White, Cornwall, maiali vietnamiti e maiali in miniatura di origine Göttingen28,29. A 5 mesi di età e circa 20 kg di peso corporeo (BW), i maialini raggiungono la maturità sessuale. La sopravvivenza delle razze parentali minipig (Hormel e Göttingen) è riportata in 12-20 anni. L’impianto sottoretinico del vettore cellulare colpisce la porzione centrale della retina. La retina dei maialini manca di macula e fovea. Tuttavia, ha regioni di fotorecettori conici altamente concentrati chiamati area centralis e striature visive30,31. Queste regioni sono responsabili della massima acuità visiva.

Gli interventi chirurgici sono stati eseguiti da quattro chirurghi vitreoretinici esperti con l’assistenza di un assistente chirurgico esperto (TA). Prima degli esperimenti in vivo , i chirurghi sono stati istruiti e hanno ottenuto conoscenze speciali sull’anatomia dell’occhio di minimaiale, come ad esempio per quanto riguarda il rapporto inferiore tra lente e volume vitreo, la lunghezza assiale più corta (15-19 mm), l’assenza della membrana di Bowman nella cornea, il volume vitreo più piccolo (2,8-3,2 ml), l’assenza della macula e della fovea, l’assenza dell’anello di Zinn e il diametro del disco ottico (verticale/orizzontale: 1,5 mm/2,1 mm). In tutti i casi, l’intervento chirurgico è stato eseguito in anestesia generale in una sala operatoria appositamente organizzata con l’implementazione di misure asettiche e antisettiche standard.

Protocol

Questo studio aderisce ai principi delle linee guida della Dichiarazione di Helsinki e ai principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani. Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e secondo l’Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l’uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. Il protocollo di studio è stato approvato dalla Commissione professionale del CAS per l’approvazione di progetti di esperimenti sugli animali presso l’Istituto di fisiologia e genetica animale dell’Accademia ceca delle scienze (Liběchov, Repubblica ceca) (protocollo approvato n. 60/2016 e n. 64/2019). 1. Considerazioni durante il trapianto sottoretinico di cellule su un vettore in minipig Selezione degli animaliProcurarsi e utilizzare maialini Liběchov di 12-36 mesi, di entrambi i sessi, e circa 40-80 kg di peso corporeo (BW). Tenere i maialini in casa in una casetta per animali climatizzata con temperature comprese tra 18-22 °C, esposizione a un ciclo artificiale di luce/buio di 13 ore / 11 ore, recinti individuali standardizzati, libero accesso all’acqua e alimentazione due volte al giorno. Preparazione prima dell’intervento chirurgicoControllare l’orientamento chirurgico dell’occhio e disegnare gli schemi del fondo oculare. Per fare ciò, dividere schematicamente la retina dei maialini sul disegno del fondo usando una penna con una linea verticale nelle regioni temporali (dal disco ottico verso l’orecchio), nasali (dal disco ottico verso il muso del maiale) e centrali (tra i principali vasi retinici sul lato nasale) (Figura 1A, B). Selezionare solo animali sani senza alcuna patologia comportamentale e neurologica e con qualità normale della pelle, orifizi corporei, feci e consumo di cibo. Chiedi a un veterinario esperto di eseguire l’osservazione clinica e selezionare gli animali. Iniettare per via intramuscolare 3 mg/kg di peso corporeo di ceftiofur cloridrato (1 ml/kg) il giorno dell’intervento. Immunosoppressione preoperatoriaPreparare microsfere polimeriche a rilascio di tacrolimo come descritto in Wang et al. e Sevc et al. 32,33 con modifica. Assicurarsi che la concentrazione di tacrolimus nelle microsfere polimeriche sia di 51,3 mg/g come determinato da HPLC (Table of Materials). Eseguire un’iniezione sottocutanea di microsfere polimeriche caricate con tacrolimos alla dose di 0,25 mg/kg di peso corporeo 6 giorni prima dell’intervento chirurgico agli occhi per impedire il rigetto dell’innesto cellulare. Questo viene fatto per garantire la sopravvivenza delle cellule donatrici di RPE umane durante il trapianto xenogenico negli occhi del maialino. Iniettare gli animali per via intramuscolare il giorno dell’intervento con 80 mg di depo-medrol e benzilpenicillina a 1 ml/10 kg in base al peso corporeo. AnestesiaIndurre l’anestesia generale con un’iniezione intramuscolare di una miscela di tiletamina (2 mg/kg), zolazepam (2 mg/kg), ketamina (2 mg/kg) e xilazina (0,4 mg/kg)-TKX34,35 prima dell’intervento. Controllare la profondità dell’anestesia da uno stato di incoscienza e controllando il riflesso del pedale (un pizzico della pelle interdigitale della zampa posteriore), il riflesso corneale (un leggero tocco della cornea), il riflesso pupillare (reazione alla luce) e il riflesso palpebrale (un tocco alla palpebra). Assicurati che l’animale non batta ciglio. Confermare la regolarità del cuore e della frequenza respiratoria. Dopo l’induzione dell’anestesia, trasportare l’animale sedato in sala operatoria su un carrello elevatore (Figura 2A). Posizionare l’animale sul tavolo operatorio sul lato sinistro per consentire l’intervento chirurgico sull’occhio destro (Figura 2B). Eseguire la regolazione della testa dell’animale utilizzando cuscinetti di polistirolo per ottenere la posizione più adatta della retina centrale per l’impianto (cioè orizzontale e parallela al pavimento) (Figura 2C). Introdurre colliri di soluzione oftalmica di proparacaina cloridrato allo 0,5% nel sacco congiuntivale tre volte l’uno dall’altro di 1 minuto per indurre l’anestesia locale. Inserire una cannula venosa e intubare l’animale con un tubo endotracheale per il mantenimento per inalazione dell’anestesia (isoflurano all’1,5%) utilizzando una macchina per anestesia dotata di un monitor paziente (Figura 2A, B). Somministrare un’iniezione intramuscolare di 1 mL di Eficur per 16 kg di peso corporeo e 20 mg di Depo-Medrol 1 circa 15 minuti prima dell’inizio dell’intervento oculare (Tabella dei materiali). Mantenere la temperatura corporea fisiologica coprendo l’animale con un foglio isotermico ed eseguire l’intervento chirurgico come descritto nel paragrafo 3. Durante l’intervento chirurgico, monitorare la temperatura dell’animale insieme alla frequenza cardiaca e alla saturazione di ossigeno nel sangue utilizzando una clip per le orecchie e un monitor paziente. Evitare l’abbassamento della temperatura corporea al di sotto di 38 °C durante le procedure, che è considerato un limite di sicurezza36. Mantenere la saturazione di ossigeno (>96%) e la frequenza cardiaca (70-90 battiti al minuto) durante l’intero esperimento. Quando l’intervento è completo, spegnere il flusso di isoflurano ed estubare l’animale. Dopo la respirazione spontanea e il risveglio, trasferire gli animali nelle loro penne. Allestimento sala operatoriaDisporre la sala operatoria in base alle esigenze dell’intervento chirurgico sugli occhi del modello animale dall’occhio grande (Figura 3A, B). Regolare l’altezza delle sedie del chirurgo, così come l’altezza del microscopio, per ottenere una posizione comoda per i chirurghi rispetto alla posizione del muso del maiale. Figura 1: Disegno schematico delle zone retiniche nei maialini. (A) Disegno schematico delle zone retiniche in relazione alla testa del maialino; l’ellisse gialla raffigura l’area desiderata di impianto sottoretinico, T si riferisce all’area retinica temporale e N si riferisce all’area retinica nasale. (B) Esempio dello schema del fondo oculare dopo l’impianto sottoretinico del vettore cellulare (giallo) attraverso la retinotomia (rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Trasporto e collocazione dell’animale. (A) Trasporto dell’animale sedato alla sala operatoria. (B) Collocazione dell’animale durante l’intubazione. (C) Regolazione della testa dell’animale per un accesso ottimale alla retina centrale durante l’intervento chirurgico (freccia rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Configurazione standard della sala operatoria. (A) Rappresentazione schematica della posizione del chirurgo (S = chirurgo, A = assistente) in relazione alla posizione del tavolo operatorio con il minimaiale, il microscopio operatorio (OM), la macchina per vitrectomia (VM), il tavolo strumentale (IT) e la macchina anestesiologica (AM). Ci sono due possibili posizioni della macchina per vitrectomia (gialla e grigia). (B) Ambiente reale in sala operatoria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 2. Trasportatore cellulare, colture di cellule coltivate e iniettore di impianto Vettore cellulareTagliare il telaio ovale largo 30 μm con dimensioni esterne di 1,7 mm x 4,8 mm, dotato di sporgenze triangolari posizionate asimmetricamente sul telaio (Figura 4A), da una lamina di polietilene-tereftalato (PET) biassiale di 36 μm di spessore utilizzando un laser a femtosecondi. Preparare la soluzione polimerica di poli(L-lattide-co-DL-lattide) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) in piridina ad una concentrazione dell’11% in peso con l’aggiunta di 2,2 μL di acido formico per 1 g di soluzione. Preparare la membrana nanofibrosa con un telaio di supporto incorporato (Figura 4B) mediante elettrofilatura della soluzione polimerica in tre fasi8: (1) depositare il primo strato di nanofibre su un substrato di silicio, (2) posizionare il telaio sullo strato e (3) depositare il secondo strato di nanofibre.NOTA: Depositare ogni strato per 7 minuti per raggiungere uno spessore totale della membrana di 3,7 μm. Utilizzare i seguenti parametri per ottenere una membrana composta da fibre spesse 380 nm e con una dimensione media dei pori di 0,4 μm e una porosità di circa il 70: un ago interamente in acciaio da 20 G, una tensione di 7,1 kV, uno spazio di 10 cm, una portata di 250 μL/min e una temperatura di 25,0 °C ± 0,5 °C. Rimuovere con attenzione la membrana con il telaio incorporato dal substrato di silicio e fissarla al corpo di un inserto commerciale per coltura cellulare a 12 pozzetti privo della membrana originale per facilitare la semina e la crescita delle cellule. Trattare la membrana nanofibrosa prima della semina cellulare in aria-plasma per 30 s ad una potenza di 70 W in un pulitore al plasma. Colture cellulari utilizzate per la coltivazione sul supporto cellulareNOTA: È possibile utilizzare i seguenti vettori cellulari: 1) vettori cellulari nanofibrosi senza cellule; 2) vettori cellulari nanofibrosi con RPE umane primarie (hRPE); 3) vettori cellulari nanofibrosi con cellule RPE umane derivate da iPSC.Coltura di hRPE primari Isolare cellule hRPE primarie dagli occhi di donatori umani secondo una tecnica precedentemente riportata38. Ottenere le cellule mediante trattamento enzimatico della retina per 30 minuti. Quindi, coltivare le cellule hRPE primarie (passaggio 0) per un massimo di 2 settimane in DMEM / F12 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Una volta che le colture cellulari raggiungono la confluenza, cambiare il mezzo all’1% di FBS e coltura per altri 30 giorni. Seminare gli hRPE primari su piastre trans-pozzetto e su un vettore cellulare nanofibroso rivestito di laminina ad una densità di 2.000 cellule / mm2. Dopo ulteriori 30 giorni di incubazione in FBS all’1%, utilizzare i vettori cellulari con hRPE primari per l’impianto sottoretinico in maialini. RPE derivati da iPSC umaniUtilizzare hiPSCs derivate da fibroblasti derivati da pazienti affetti da retinite pigmentosa associata a MERTK39 che sono corretti gene-in due alleli utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 (RP1-FiPS4F1-GC2)40, così come hiPSCs derivate dai fibroblasti di un soggetto sano (Ctrl2-FiPS5F2)41 che vengono utilizzati come controllo. Generare e successivamente differenziare entrambe le linee cellulari hiPSCs verso le celle RPE (hiPSC-RPE) come riportato in precedenza42. Placcare gli hiPSC-RPE a 200.000 cellule/cm2 su inserti di coltura cellulare rivestiti di laminina con membrane nanofibrose di poli(L-lattide-co-DL-lattide) con telai di impianto ovali in mezzo RPE contenente DMEM knockout, siero knockout al 20%, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 0,23 mM β-mercaptoetanolo, 100 U/mL di penicillina, 0,1 mg/ml di streptomicina e 10 mM di nicotinamide. Cambiare il terreno a giorni alterni e coltivare l’hiPSC-RPE per 2 mesi prima dell’impianto per incoraggiare la crescita polarizzata. Iniettore di impiantoPreparare un capillare di plastica con una sezione trasversale rettangolare di 2,8 mm x 0,8 mm mediante soffiaggio da un tubo di plastica di OD 1,75 mm / ID 1,10 mm. Tagliare una finestra di carico di 4 mm x 2,2 mm nel capillare di plastica a 6 mm dall’estremità. Assemblare l’iniettore dal capillare di plastica, una maniglia in silicone, uno stantuffo a lama in acciaio e un pistone (Figura 5A). Caricare il supporto nell’iniettore attraverso una finestra di carico e successivamente espellerlo nello spazio sottoretinico premendo lo stantuffo, come descritto al punto 3.5.2 (Figura 5B). Preparazione del vettore nanofibroso e carico dell’iniettoreRiempire una piccola capsula di Petri di plastica con 2 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Estrarre un inserto con lo strato cellulare preparato, posizionarlo su una piastra di polistirolo semi-morbido e centrarlo al microscopio ottico. Utilizzare un punzone modificato su misura per ritagliare il supporto lungo la cornice ovale utilizzando un microscopio. Le dimensioni del supporto devono essere 2 mm x 5 mm. Utilizzare un iniettore su misura con tubo trasparente piatto per caricare il supporto; A 6 mm dall’estremità distale del capillare, c’è una finestra per caricare il vettore. Riempire la finestra dell’iniettore con PBS. Utilizzando la pinza, rilasciare il campione dal fondo del piatto, sollevarlo dal liquido e trasportarlo alla finestra dell’iniettore controllando prima i segni di orientamento laterale sul telaio per rilevare il lato superiore del supporto con celle aderenti. Una cornice ovale facilita la manipolazione con il corriere. Utilizzando una sonda dentale (uno strumento dentale in acciaio inossidabile con una punta affilata), posizionare il supporto nella finestra dell’iniettore. Utilizzare lo stantuffo per spingere il supporto nella parte superiore chiusa e sicura dell’iniettore. Quindi, preparare il corriere per un intervento chirurgico. Controllare l’orientamento laterale del supporto ad ogni passo. Scaricare il vettore nanofibroso dall’iniettore spingendo lo stantuffo metallico. Figura 4: Supporto nanofibroso con un telaio in PET di supporto incorporato. (A) Tre segni visibili sul telaio consentono di controllare l’orientamento laterale del supporto (frecce bianche). (B) Vista di ingrandimento del frammento di telaio in PET incorporato nella membrana nanofibrosa (frecce bianche) del vettore cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Iniettore di impianto . (A) Parti dell’iniettore. (B) Vettore cellulare nanofibroso con telaio in PET di supporto incorporato caricato sul capillare rettangolare di plastica dell’iniettore di impianto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 3. Procedura chirurgica Attrezzature chirurgicheUtilizzare le seguenti attrezzature chirurgiche: un microscopio chirurgico oftalmico, un sistema operativo per interventi chirurgici sui segmenti oculare anteriore e posteriore, un sistema chirurgico vitreoretinale senza contatto, un dispositivo di fotocoagulazione laser e una fotocamera digitale.NOTA: I parametri standard utilizzati nella vitrectomia, nell’eso- e nell’endo-cauterizzazione e nelle apparecchiature di fotocoagulazione laser sono rappresentati nella Tabella 1. Strumenti chirurgiciSterilizzare gli strumenti chirurgici riutilizzabili con una sterilizzatrice a vapore autoclave mobile o simile secondo un protocollo standard. Gli strumenti chirurgici monouso e i materiali richiesti durante l’intervento chirurgico sono elencati nella tabella dei materiali. Preparazione per le fasi chirurgicheDopo aver anestetizzato l’animale come descritto al punto 1.4.1, applicare collirio di soluzione di tropicamide all’1% e soluzione di fenilefrina cloridrato al 10% nel sacco congiuntivale 15 minuti prima della procedura per provocare midriasi indotta da farmaci. Avvicinarsi al tavolo operatorio con il chirurgo in posizione superiore e l’assistente in posizione laterale (Figura 3). Rasare l’area intorno all’occhio usando un rasoio da barba monouso e rimuovere lo sporco ruvido. Disinfettare il sacco congiuntivale con una soluzione di povidone-iodio al 5% per 5 minuti. Disinfettare l’area periorbitale con tamponi di cotone strofinando dalle palpebre alla periferia. Ripetere il processo tre volte utilizzando una soluzione di povidone-iodio al 10% e lasciare in posa per 5 minuti. Coprire il campo operatorio con l’occhio al centro utilizzando un drappo oftalmico sterile standard con pellicola trasparente appiccicosa. Allontanare le ciglia dal globo oculare. Evitare di tagliare le ciglia per ridurre il rischio di endoftalmite postoperatoria. Inserire lo speculum del coperchio (tipo Liberman o speculum occhio di Cook). Opzionalmente, fissare la membrana nittitante alla pelle con 8-0 sutura di poliglactina. Aprire la congiuntiva sul lato nasale da 2 mm a 3 mm dal limbus per esporre la sclera per le sclerotomie usando una pinza chirurgica e forbici congiuntivali Westcott. Inserire i trocar da 25 G a tre valvole a 2,5-3 mm dal limbus nell’area della pars plana (posizionarli a ore 7, ore 10 e ore 11). Utilizzare movimenti rotanti durante l’inserimento in modo leggermente obliquo (100°-110°) verso la retina posteriore e tenere il trocar con la pinza (Figura 6). Mantenere la cornea bagnata o rivestirla con metilcellulosa durante l’intero intervento chirurgico per prevenire l’edema corneale osmotico. Vitrectomia pars plana (PPV)Rimuovere la porzione centrale del corpo vitreo con l’approccio vitrectomia pars plana standard a tre porte. Rimuovere con cura il vitreo dietro la lente nell’area della futura sclerotomia di grandi dimensioni. Utilizzare un’iniezione intravitreale di 2-4 mg di triamcinolone acetonide (TA) (50-100 μL) per colorare il vitreo posteriore, che di solito rimane aderente alla retina, al fine di eseguire un distacco vitreo posteriore controllato. Successivamente, eseguire lentamente un’iniezione sottoretinica di 0,05-0,1 ml di BSS con una cannula da 41 G più centralmente, evitando la formazione di un bleb verso la periferia. Ridurre le impostazioni della pressione intraoculare con il sistema di irrigazione fino a 15 mmHg durante l’iniezione sottoretinica al fine di prevenire un’occlusione vascolare retinica transitoria. Eseguire una grande endodiatermia lineare della retina con una sonda endodiatermica da 27 G a 3 mm vicino alla base del bleb nasale. Successivamente, eseguire una retinotomia di 3 mm con una lama MVR da 25 G o forbici verticali con un’elevata pressione intraoculare (IOP) del sistema di irrigazione fino a 60 mmHg per 3 minuti a 5 minuti. Assicurarsi che non vi sia sanguinamento dalla retinotomia, quindi ridurre la IOP a 25 mmHg. Effettuare un’esodiatermia dei vasi episclerali tra i due trocar nasali a 2,5-3 mm dal limbus con una sonda endodiatermica da 27 G applicando un tocco delicato sulla superficie della sclera. Controllare il livello del liquido del flacone per infusione prima di ingrandire la sclerotomia, poiché dopo l’allargamento della sclerotomia, il consumo di liquidi è temporaneamente elevato. Fai una sclerotomia grande 3,0 mm, a 3 mm dal limbus, usando un coltello phaco da 2,75 mm. Prestare attenzione al possibile sanguinamento dai vasi sclerali e dal corpo ciliare all’interno della grande sclerotomia. In caso di sanguinamento, utilizzare una sonda endodiatermica da 27 G per coagulare i vasi danneggiati. Ingrandire la sclerotomia a 3,0 mm con un coltello satinato per ospitare la punta dell’iniettore (0,8 mm x 2,8 mm). Rimuovere il corpo vitreo prolasso sul sito della grande sclerotomia con un vitrettore. Mantenere l’infusione di BSS al livello di 25-30 mmHg con il sistema di vitrectomia per evitare il collasso del globo. Impianto del vettore cellulareInserire delicatamente l’iniettore con la mano dominante nella cavità vitreale attraverso la grande sclerotomia. In caso di resistenza, ingrandire le dimensioni della sclerotomia. Impiantare il vettore cellulare attraverso la retinotomia nello spazio sottoretinico. Se necessario, utilizzare una tecnica bimanuale con sclerotomia aggiuntiva e luce del lampadario al fine di migliorare il controllo dell’impianto. Ritirare l’iniettore dall’occhio e chiudere la grande sclerotomia con un 8-0 sutura di poliglactina per evitare complicazioni associate a ipotonia intraoculare. Eseguire uno scambio completo fluido-aria (FAX) e il drenaggio del liquido sottoretinico con una cannula con punta in silicone. Successivamente, iniettare olio di silicone (1.000 cSt) nella cavità vitreale utilizzando il sistema di vitrectomia e il sistema di tubi per l’iniezione di olio di silicone fino a quando la IOP è normale. Imaging e documentazione intraoperatoriaEseguire una registrazione video durante l’intero intervento chirurgico con documentazione fotografica delle fasi chiave dell’impianto utilizzando un sistema di registrazione video. Completare il disegno del fondo oculare documentando la posizione delle sclerotomie, della retinotomia, dell’impianto sottoretinico e di eventuali complicazioni che si sono verificate utilizzando gli schemi di disegno del fondo oculare. Fasi post-operatorieAlla fine dell’intervento, rimuovere i trocar e chiudere le tre sclerotomie e la congiuntiva con 8-0 suture di poliglactina. Risciacquare il sacco congiuntivale con una soluzione di iodio povidone al 5%. Eseguire un’iniezione subcongiuntivale da 0,3 ml di 20 mg di gentamicina, 2 mg di desametasone e xilocaina al 2%. Controllare le condizioni del fondo e della lente utilizzando una vista microscopica. Rimuovere la sutura dalla membrana nittitante usando una pinza chirurgica e le forbici congiuntivali Westcott (opzionali). Applicare unguento neomicina o ofloxacina unguento oftalmico nel sacco congiuntivale. Figura 6: Inserimento dei trocar nell’occhio di un maialino. (A) Rappresentazione schematica dei trocar, che sono inseriti perpendicolarmente nella sclera verso il centro della cavità vitreale nell’occhio umano (colore grigio) e in modo obliquo verso la retina posteriore nell’occhio del maialino (colore blu) per evitare danni al cristallino. La lente del maialino (di colore blu) è più grande di quella degli esseri umani e relativa alle dimensioni della cavità vitreale. (B) Vista intraoperatoria dei trocar inseriti in un PPV a tre porte. La cornea è ricoperta di metilcellulosa per prevenire l’essiccazione e il gonfiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 4. Assistenza postoperatoria Applicare bacitracina topica zinco / idrocortisone acetato / neomicina solfato o 0,3% ofloxacina nel sacco congiuntivale degli animali cinque volte al giorno. Dopo l’intervento, controllare i seguenti parametri oculari: turgore dei tessuti molli dell’occhio mediante palpazione, reazione infiammatoria sulla superficie oculare e strabismo come reazione protettiva delle palpebre utilizzando una lampada a fessura portatile o oftalmoscopio indiretto. Per la cura postoperatoria sistemica, utilizzare i seguenti antibiotici:Iniettare ceftiofur cloridrato per via intramuscolare alla dose di 3 mg/kg di peso corporeo (1 ml/kg) il secondo e il terzo giorno di stabilità. Iniettare tulatromicina (1 mL/40 kg p.c.) dopo 72 ore post-operatorie per la prevenzione dell’infezione batterica secondaria. Eseguire un’iniezione intramuscolare di flunixina (2 ml / 45 kg di peso vivo) e tramadolo cloridrato (100 mg) ogni 24 ore per 3 giorni dopo l’intervento chirurgico per prevenire il dolore. Tenere i maialini in una struttura specializzata climatizzata con un intervallo di temperatura di 18-22 °C e un regime artificiale di luce/buio di 13 ore / 11 ore. Assicurati che abbiano libero accesso all’acqua e all’alimentazione standard (due volte al giorno). 5. Procedure postoperatorie Esami oftalmici postoperatoriNel periodo postoperatorio, ispezionare gli occhi con un oftalmoscopio indiretto per la presenza di infiammazione (cioè arrossamento, gonfiore dei tessuti o congestione del muco nel sacco congiuntivale). Misurare la pressione intraoculare nell’occhio operato utilizzando il metodo di palpazione. Imaging postoperatorioIndurre la sedazione nel maialino mediante iniezione intramuscolare di una miscela di TKX prima della fotografia del fondo oculare e dell’esame OCT. Instillare gocce oculari all’1% di tropicamide e fenilefrina cloridrato al 10% nel sacco congiuntivale del maialino per indurre midriasi. Utilizzare uno speculum coperchio per mantenere gli occhi aperti. Per idratare la superficie oculare e per ottenere un’immagine chiara dell’OCT, lavare la cornea dell’animale con soluzione salina (0,9% NaCl) ogni 30-60 s. Posizionare il maialino sul tavolo operatorio nello stesso modo in cui viene eseguito durante l’operazione (Figura 2B,C, Figura 3A). Il requisito principale è quello di posizionare la testa sul lato e perpendicolarmente al pezzo di scansione del dispositivo OCT. Utilizzare cuscinetti di polistirolo sotto il muso dell’animale per stabilizzare la testa, portando la superficie dell’occhio in posizione orizzontale. Raccogli le immagini del fondo oculare a colori con una fotocamera del fondo oculare a colori non midriatica, in quanto ciò consente di documentare il segmento anteriore, la retina e il disco ottico. Inoltre, scatta un’immagine senza rosso della retina con la fotocamera del fondo oculare non midriatica. Eseguire la tomografia a coerenza ottica utilizzando il sistema OCT a dominio spettrale. Durante l’imaging OCT o fundus, inclinare manualmente la testa del minipig verso le lenti OCT o le lenti della fotocamera del fondo oculare per ottimizzare la visione della retina posteriore e dell’area di impianto (Figura 2C). Per un’imaging ottimale del supporto impiantato sul fondo oculare, applicare la luce di riflettanza infrarossa del dispositivo OCT per concentrarsi sull’impianto (Figura 2C). Utilizzare le modalità di scansione della linea trasversale e della mappa retina dello Strumento di personalizzazione di Office. Applicare ofloxacina unguento oftalmico alla fine dell’esame sotto il coperchio dell’occhio dell’animale. Spostare il maialino nella struttura interna e osservare le sue condizioni generali fino alla fine della sedazione (circa 2 ore a 5 ore). 6. Enucleazione dell’occhio post mortem dopo l’eutanasia Sedare i maialini con un’iniezione intramuscolare della miscela di TKX seguita da un’applicazione endovenosa (attraverso una cannula auricolare da 22 G) dell’1% di propofol (20 ml/animale) seguita da dissanguamento. Non usare fissativi generali. Sacrificare gli animali mediante dissanguamento durante l’anestesia generale profonda 7 giorni, 14 giorni, 28 giorni e 42 giorni dopo l’impianto dell’innesto cellulare. Utilizzare pinze e forbici per rimuovere le palpebre superiori e inferiori. Rimuovere la terza palpebra e tagliare la congiuntiva. Taglia i muscoli oculari e il nervo ottico. Enucleare gli occhi post mortem usando forbici chirurgiche e pinze chirurgiche. Assicurarsi che la procedura venga eseguita da una persona esperta.

Representative Results

I risultati dell’impianto sottoretinico del vettore cellulare nei maialini di Liběchov sono presentati in grado2. Il successo dell’impianto è stato definito come l’ottenimento di dati sufficienti per lo studio istologico e immunoistochimico. I casi falliti sono stati definiti come occhi con gravi complicanze intraoperatorie, che hanno reso impossibile un’ulteriore osservazione dei tessuti oculari. L’applicazione della tecnica proposta con l’uso del tamponamento con olio di silicone consente di controllare la condizione del trapianto sottoretinico utilizzando modalità di imaging a partire dal giorno successivo all’intervento fino al momento dell’enucleazione (Figura 7, Figura 8 e Figura 9). Imaging del fondo oculare e SD-OCTI maialini sono stati esaminati nel periodo postoperatorio utilizzando l’imaging del fondo oculare, l’imaging privo di rosso e la tomografia coerente ottica del dominio spettrale (Figura 7). L’imaging del fondo oculare di alta qualità è stato reso possibile utilizzando supporti ottici trasparenti, tra cui una lente trasparente e l’uso di tamponamento con olio di silicone (Figura 7A). Il sito della retinotomia non mostrava segni di una reazione proliferativa (Figura 7A, frecce gialle) e la struttura PTE del vettore cellulare era chiaramente visibile attraverso gli strati semitrasparenti della retina suina. Nell’imaging privo di rosso, la riflettività degli hRPE coltivati sul vettore non differiva dalla riflettività dello strato di RPE suino endogeno (Figura 7B). Sulla SD-OCT, il frame PTE ha causato solo un piccolo oscuramento delle strutture anatomiche sottostanti e un leggero ispessimento della retina (Figura 7C, frecce rosse). Non sono state notate zone ipo- o iper-riflettenti atipiche sulla SD-OCT, e anche la membrana di Bruch sembrava rimanere intatta. La Figura 8 presenta le immagini del fondo oculare e dell’iOCT dello scaffold coltivato con cellule RPE umane primarie 1 mese dopo l’intervento chirurgico (Figura 8). Il vettore cellulare stesso (senza cellule) non ha causato alcun aumento significativo dello spessore della retina (Figura 9C). Questi risultati suggeriscono che l’impatto iatrogeno intraoperatorio dell’impianto è stato minimo e che il vettore cellulare impiantato ha subito un adattamento sufficiente delle cellule impiantate alle cellule fotorecettrici sovrastanti e al tessuto neuroretinico. Figura 7: Imaging postoperatorio della retina nei maialini . (A) imaging del fondo oculare, (B) immagine priva di rosso e (C) imaging della tomografia a coerenza ottica del vettore nanofibroso con cellule RPE umane primarie in un follow-up di 1 settimana dopo trapianto sottoretinico in un occhio di maialino. (A) Le frecce gialle indicano la sede della retinotomia. (B) Le frecce rosse dimostrano i margini del vettore cellulare nanofibroso. (C) Le frecce rosse mostrano la leggera ombreggiatura del segnale OCT causata dal telaio PET di supporto del vettore nanofibroso, che è stato impiantato nello spazio sottoretinico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 8: Immagini del fondo oculare e iOCT degli scaffold 30 giorni dopo l’impianto sottoretinico nei maialini. A, B, C, D ed E corrispondono rispettivamente ai suini 169, 182, 179, 199 e 224. Le frecce gialle raffigurano la cornice del patibolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Analisi istologiche e immunoistochimicheDopo l’eutanasia degli animali, gli occhi interi di maialino sono stati rimossi e fissati in paraformaldeide (PFA) al 4% per 24 ore. La parte anteriore dell’occhio è stata rimossa e il vettore nanofibroso impiantato è stato identificato nella retina centrale nasale e isolato con la sclera attaccata. Tutti i tessuti sono stati crioprotetti in soluzioni di saccarosio graduato e sono state tagliate sezioni congelate verticali, come descritto in dettaglio43. L’istologia della membrana nanofibrosa senza cellule RPE dopo 4 settimane di impianto ha rivelato retine senza infiammazione e cambiamenti degenerativi (Figura 9A). La presenza della membrana nanofibrosa è stata rilevata in luce polarizzata (Figura 9B). Figura 9: Analisi istologica della membrana nanofibrosa acellulare impiantata. Colorazione con matossilina-eosina della membrana nanofibrosa acellulare 4 settimane dopo l’impianto (A) con illuminazione standard e (B) con microscopia a luce polarizzata. La freccia bianca indica la localizzazione della membrana nanofibrosa (barra di scala: 50 μm). (C) Le immagini di tomografia a coerenza ottica in vivo della membrana nanofibrosa acellulare dopo 4 settimane dall’impianto mostrano una buona accettazione e aderenza della membrana nanofibrosa nello spazio sottoretinico. La freccia bianca indica la posizione dell’impianto nell’immagine della sezione trasversale della retina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. La figura 10 mostra la colorazione dell’ematossilina-eosina (H & E) dell’area retinica contenente le cellule hRPE primarie impiantate su un vettore nanofibroso (freccia gialla) nell’occhio del maialino. L’aspetto pigmentato degli hRPE primari impiantati formava uno strato pigmentato continuo ma irregolare (Figura 10, frecce rosse). Dopo periodi di osservazione più lunghi (6 settimane), la neuroretina sotto gli impianti ha mostrato un aspetto simile a una rosetta o a una reazione ipertrofica intorno al sito di retinotomia, probabilmente a causa di manipolazione iatrogena. Questi risultati morfologici sono paragonabili ai risultati SD-OCT e supportano l’evidenza dell’impatto minimo della somministrazione del vettore sul tessuto retinico. Figura 10: Analisi istologica della membrana nanofibrosa impiantata con gli hRPE primari. Colorazione dell’ematossilina-eosina dell’area retinica contenente il vettore nanofibroso impiantato (freccia gialla) con gli hRPE primari nell’occhio del maialino. L’animale è stato sottoposto a eutanasia e analizzato 6 settimane dopo l’impianto. Gli hRPE primari erano chiaramente distinguibili per le loro dimensioni, forma rotonda e pigmentazione (frecce rosse) nello spazio sottoretinico opposto ai fotorecettori. I nuclei dei fotorecettori nell’ONL costruiscono strutture simili a rosette. Lo spazio sottoretinico appare ipertrofico. Abbreviazioni: hRPE = epitelio pigmentato retinico umano primario, ONL = strato nucleare esterno, INL = strato nucleare interno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. L’immunocolorazione è stata eseguita utilizzando un metodo indiretto in due fasi. Le sezioni sono state incubate a temperatura ambiente durante la notte in CRALBP, un anticorpo primario monoclonale, ad una diluizione di 1:100. L’immunofluorescenza è stata eseguita utilizzando l’anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 488. Gli hRPE primari impiantati erano presenti nell’area di impianto ed esprimevano il tipico marcatore RPE CRALBP simile alle cellule RPE minigene endogene (Figura 11A). Al contrario, la morfologia delle cellule impiantate sembrava non assumere una forma monostrato dopo l’impianto, ma rimaneva localizzata all’interno dello spazio sottoretinico definito (Figura 11A, B, frecce bianche). I seguenti marcatori RPE/retinici e l’aspetto morfologico sono rimasti positivi dopo il periodo post-impianto di 6 settimane: la presenza di pigmento / granuli di melanina, i marcatori neuronali specifici della retina allo stadio terminale per il bipolare bastoncello (PKC-alfa) e i fotorecettori del cono (PNA) e la positività GFAP, un segno di attivazione microgliale. Figura 11: Immunomarcatura con il marcatore cellulare RPE CRALBP (proteina legante la retinaldeide cellulare) in un maialino 6 mesi dopo l’impianto di hRPE primari. (A) Le sezioni congelate verticali dell’occhio di maiale trattato sono state immunomarcate con l’anticorpo monoclonale CRALBP (verde) e controcolorate con DAPI (blu). (B) Rappresentazione singola dell’etichettatura dei nuclei cellulari con DAPI in bianco e nero, poiché l’alto contrasto rivela la forma rotonda delle singole celle hRPE (alcune mostrate con frecce bianche). Abbreviazioni: hRPE = epitelio pigmentato retinico umano, ONL = strato nucleare esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Complicanze oculariIn totale, ci sono stati 27 su 29 (93,1%) operazioni eseguite con successo. La definizione “interventi chirurgici eseguiti con successo” è stata applicata a quei casi in cui l’occhio operato non ha mostrato complicanze postoperatorie clinicamente significative fino al momento dell’enucleazione che potrebbero influenzare lo studio istologico e immunoistochimico. La ridotta trasparenza del supporto ottico ha avuto un impatto sull’imaging postoperatorio in quattro casi (13,7%); Tuttavia, questi occhi sono stati elaborati con ulteriori analisi istologiche e immunoistochimiche. Il distacco intraoperatorio della retina periferica si è verificato in quattro casi (13,8%). In due casi, è stato gestito mediante aspirazione del fluido sottoretinico durante lo scambio fluido-gas e l’applicazione della fotocoagulazione laser della retina nell’area di distacco. Negli altri due casi (6,9%), il distacco di retina è stato associato a sanguinamento massiccio della retina e del sottoretino, che ha reso impossibile l’impianto del portatore cellulare e ha portato alla cessazione dell’intervento e all’immediata eutanasia del maialino mentre era sul tavolo operatorio. No Parametri Impostazioni standard utilizzate 1 Velocità della vitrectomia (velocità di taglio) fino a 20.000 tagli/min 2 Pompa Venturi 50-180 mmHg 3 Tempo di salita 1 secondi 4 Pressione di irrigazione 18-25 mmHg 5 Pressione di infusione dell’aria 20-25 mmHg 6 Esodiatermia bipolare 18-26% 7 Endodiatermia monopolare 16-18% 8 Fotocoagulazione laser della retina, 532 nm Potenza 100-150 mW Intervallo 100 ms Durata 100 ms Tabella 1: Parametri standard utilizzati durante la vitrectomia e la fotocoagulazione laser. Totale animali, n 18 Occhi totali, n 36 Occhi operati, n 29 Impianto riuscito, n 27 Casi falliti, n 2 Tempo medio di intervento, min 57 Tasso di successo, % 93.1 Tabella 2: Risultati della tecnica chirurgica standardizzata con impianto sottoretinico del vettore cellulare nei maialini di Liběchov tra il 2016 e il 2020. Scheda supplementare 1: Sintesi degli studi dedicati all’impianto sottoretinico di cellule RPE sul vettore cellulare. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

L’impianto sottoretinico di cellule RPE con origini diverse è una tendenza molto promettente nella ricerca oculare per il trattamento delle malattie degenerative della retina, come AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . L’idea principale di questo approccio è quella di sostituire gli RPE danneggiati con RPE sani coltivati ex vivo (Supplementary File 1)44,45,46,47,48. L’uso di vettori cellulari per trapiantare le cellule RPE coltivate rappresenta l’approccio più ragionevole, poiché le membrane porose mantengono lo strato cellulare RPE polarizzato nel corretto orientamento rispetto allo strato fotosensoriale.

Modello animale ottimale
Un passo fondamentale nello sviluppo di tali approcci terapeutici è l’uso del modello animale ottimale49. In passato sono stati utilizzati modelli animali piccoli e grandi, tra cui conigli, cani, maiali e primati non umani 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. In questo articolo, proponiamo l’uso del modello minipig di Liběchov e descriviamo le fasi preoperatorie, chirurgiche e postoperatorie che consentono una robusta efficacia del trapianto. Il maialino Liběchov è stato originariamente allevato circa 20 anni fa ed è stato frequentemente utilizzato nella ricerca biomedica nel campo delle malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington 29,50. Poiché il maiale possiede un cervello relativamente grande con un apporto di sangue e una risposta immunologica simili a quelli degli esseri umani, è stato utilizzato come modello animale per esperimenti di trapianto allogenico anche 51,52,53,54. Anche se la retina dei maialini non possiede una macula e una fovea simili a quelle umane, contiene l’area centralis e le striature visive, che sono regioni della retina con un’alta concentrazione di fotorecettori dei coni30. Le dimensioni simili all’occhio umano, la presenza di una retina centrale arricchita di coni, il sistema immunitario ben descritto e la presenza di metodi per valutare la morfologia e la funzione post-operatoria sono argomenti importanti per l’uso di questo grande modello animale nello studio presentato.

Procedura chirurgica
Per quanto ne sappiamo, non esistono tecniche chirurgiche standardizzate e ampiamente accettate per il trapianto vitreorenico di cellule RPE su vettori. Uno dei problemi chiave della terapia di sostituzione cellulare è la tecnica chirurgica impegnativa che ha un rischio di complicanze intraoperatorie e postoperatorie legate al distacco della retina, all’ipotonia, al sanguinamento episcolerale, coroideale e / o retinico e all’elevata turbolenza intraoculare, che può portare a danni all’impalcatura. Postoperatorio, esiste il rischio di vitreoretinopatia proliferativa, endoftalmite, ipotonia, distacco di retina e formazione di cataratta 4,10,13,14,15.

I primi studi sugli approcci che utilizzano vettori cellulari sono stati condotti in conigli bastardi di cincillà13,16,25. Anche se questi animali rappresentano un piccolo modello animale, i risultati incentrati sugli aspetti tecnici della chirurgia sono stati cruciali nello sviluppo delle procedure in modelli animali di grandi dimensioni e sono, quindi, riassunti di seguito.

Inizialmente è stata utilizzata una cannula per infusione da 23 G su misura con due porte laterali per reindirizzare la corrente a getto, che ha contribuito a risolvere il collasso del bleb e il conseguente distacco di retina13. Nel presente studio, non abbiamo notato alcun collasso del bleb. La possibile ragione di ciò potrebbe essere la maggiore dimensione del bulbo oculare e le prestazioni della vitrectomia centrale con vitreo risparmiato alla periferia nel sito di infusione della cannula, che potrebbe ridurre la forza della corrente a getto diretta.

Le difficoltà durante l’espulsione del supporto cellulare dallo strumento erano un altro ostacolo intraoperatorio nei piccoli modelli animali, che sono stati classificati come “intrappolati con lo strumento”. Inoltre, gli autori hanno suggerito che il vitreo residuo sulla superficie retinica potrebbe causare un “salto” all’indietro del vettore fuori dall’orifizio della retinotomia dopo l’impianto. Questo problema può essere risolto con una vitrectomia enzimatica, che consente un’espulsione regolare e continua del vettore cellulare nello spazio sottoretinico. Nella maggior parte dei casi, gli autori hanno riposizionato il vettore per ottenere una posizione più distante dell’impianto lontano dalla retinotomia. Nella nostra serie di casi, abbiamo anche sperimentato una situazione in cui il vettore cellulare rimaneva attaccato alla punta dell’iniettore. Tuttavia, ciò è stato gestito da una manipolazione lenta e delicata del tubo luminoso e della punta dell’iniettore. Non abbiamo osservato alcun vitreo residuo nel sito di retinotomia in nessuno dei nostri casi. L’uso di PPV assistiti da TA-negli interventi chirurgici può essere suggerito come metodo per ridurre il rischio di vitreo residuo attaccato. Può essere necessaria una colorazione multipla con TA per rimuovere completamente il vitreo sovrastante.

In un altro studio, i risultati dell’impianto sottoretinico di cellule staminali RPE umane cresciute come monostrato cellulare polarizzato su una membrana di poliestere sono stati riportati24. Durante gli esperimenti, è stata utilizzata la stessa tecnica chirurgica descritta in precedenza13, ma è stato applicato un approccio PPV a due porte. Infine, successivamente è stato pubblicato un protocollo passo-passo per l’impianto sottoretinico della chirurgia del vettore cellulare nei conigli25. Questo studio presenta una descrizione molto dettagliata e facilmente ripetibile della procedura chirurgica, comprese le cure preoperatorie e postoperatorie, che si basano anche sull’esperienza precedente.

Durante l’uso di modelli animali di grandi dimensioni negli studi successivi, sono state affrontate non solo questioni tecniche, ma anche domande riguardanti la reazione immunitaria alle cellule trapiantate, nonché problemi relativi alle dimensioni del vettore cellulare. Uno studio su scimmie cynomolgus (Macaca fascicularis) ha descritto i risultati dell’impianto sottoretinico di monostrati RPE derivati da cellule staminali umane15. Tutti gli animali sono stati sottoposti a immunosoppressione sistemica, che consisteva in sirolimus (dose di carico di 2 mg, dose giornaliera di 1 mg) e tetraciclina (7,5 mg/kg– p.c.) a partire da 7 giorni prima dell’intervento e per 3 mesi dopo l’intervento. La procedura chirurgica è stata eseguita secondo i protocolli descritti in precedenza24,25. Gli autori hanno utilizzato un approccio PPV a tre porte da 25 G con illuminazione endoscopica del lampadario. È importante sottolineare che è stato utilizzato un PVD assistito da TA per escludere l’adesione vitreoretinica residua sulla retina posteriore. In aggiunta alla procedura originariamente descritta, gli autori hanno rimosso lo strato RPE ospite nell’area del futuro impianto utilizzando uno strumento ad anello estensibile su misura da 20 G.

Nel nostro studio minipig, abbiamo anche usato l’immunosoppressione sistemica. Tuttavia, il tipo di immunosoppressione differiva da quello sopra descritto. Abbiamo somministrato un’iniezione sottocutanea di microsfere polimeriche a rilascio di tacrolimo come deposito alla dose di 0,25 mg / kg di peso corporeo per ostacolare il rigetto dell’innesto cellulare e le reazioni infiammatorie. Non abbiamo rimosso lo strato cellulare RPE ospite durante l’intervento chirurgico, poiché il nostro obiettivo principale era quello di analizzare la sicurezza della procedura e la vitalità delle cellule impiantate, ma non la loro integrazione nella retina ospite.

In precedenza, la sicurezza e la fattibilità dell’impianto sottoretinico di un monostrato di RPE derivati da hESC su una membrana submicronica parylene-C pieghevole non degradabile supportata da mesh (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm di spessore) è stata valutata in 14 minipig femmine dello Yucatan10. Dopo la coltivazione, le cellule sono state seminate su una membrana supportata da maglie. L’immunosoppressione è stata eseguita utilizzando la somministrazione sistemica di tacrolimus (nessun regime e dose indicati) e iniezioni intravitreali di 0,7 mg di un impianto di desametasone alla fine dell’intervento. PPV è stato eseguito con un approccio 20 G. Gli autori hanno utilizzato un’iniezione intravitreale di triamcinolone acetonide per una migliore visualizzazione del corpo vitreo. La grande sclerotomia aveva dimensioni comprese tra 2 e 3 mm. Dopo l’iniezione sottoretinica, la retina è stata appiattita con un’iniezione temporanea di liquido perfluorocarbonico. Dopo lo scambio fluido-aria, è stato eseguito un tamponamento con olio di silicone (1.000/5.000 cSt). Le cure postoperatorie includevano l’applicazione oculare di desametasone/neomicina/polimixina B unguento 1 settimana dopo l’intervento. Gli autori hanno riportato un tasso di successo del 91% (cioè un impianto sottoretinico efficiente e sufficienti dati di imaging postoperatorio). Nel nostro studio, l’iniezione intravitreale di cristalli di TA è stata utilizzata intraoperatoriamente e principalmente per visualizzare il corpo vitreo. Tuttavia, l’azione immunosoppressiva locale di questo farmaco rimane poco chiara. I vettori cellulari nanofibrosi utilizzati nel nostro studio erano 5,2 mm x 2,1 mm e 3,7 μm di spessore, con dimensioni dei pori di 0,4 μm. Durante l’intervento, abbiamo eseguito FAX diretto invece di iniettare liquido perfluorocarbonico. Il nostro tasso di successo chirurgico (93,1%) era coerente e leggermente migliore di quello di Koss et al.10.

Il trapianto sottoretinico di portatori cellulari completamente degradabili (scaffold) per l’impianto sottoretinico è stato studiato per la prima volta nel 2019 nei suini dello Yorkshire14. Lo studio si è concentrato principalmente sulle caratteristiche biodegradabili degli impianti di idrogel di fibrina. Gli autori hanno notato che l’immunosoppressione aggressiva utilizzata sui suini domestici potrebbe inibire una reazione infiammatoria locale potenzialmente causata durante la biodegradazione degli impianti di idrogel di fibrina. Tuttavia, non hanno specificato la terapia immunosoppressiva utilizzata nei suini. Durante la PPV, hanno eseguito una sclerotomia lunga 3,6 mm per l’inserimento del dispositivo di impianto sottoretinico parallelo e circa 3,5 mm posteriore al limbus. Inoltre, hanno utilizzato un sistema di iniezione pneumatico che mira a ridurre l’instabilità del posizionamento della mano causata dalla manipolazione delle dita. Nella nostra serie di casi, tutte le sclerotomie erano da 2,5 mm a 3,0 mm dal limbus. La grande sclerotomia per l’inserimento dell’iniettore era lunga 3 mm. L’iniettore di impianto utilizzato nel nostro studio è stato azionato a mano. Un cauterizzazione approfondita della pars plana del corpo ciliare e un taglio sufficiente all’interno della grande sclerotomia sembrano essere cruciali per evitare complicanze intraoperatorie come il distacco iatrogeno della retina periferica, il sanguinamento e la perdita dell’impianto.

In sintesi, descriviamo l’uso del modello minipig di Liběchov per il trapianto di cellule RPE su vettori biodegradabili come opzione di trattamento per le malattie retiniche ereditarie e acquisite. Le somiglianze nell’anatomia e nella fisiologia dell’occhio, nonché per quanto riguarda il sistema immunitario, ci permettono di sviluppare e migliorare le tecniche chirurgiche e la strumentazione per l’impianto sottoretinico delle cellule, che possono essere facilmente trasferite al trattamento dei disturbi dell’occhio umano. È importante assicurare che gli interventi chirurgici sui maialini vengano eseguiti utilizzando la stessa strumentazione (compresi gli strumenti di consegna dell’impianto) quando utilizzati negli interventi chirurgici umani, facilitando così l’applicazione dell’esperienza acquisita e del know-how agli esseri umani. Modelli animali alternativi con grande occhio con presenza di un’area maculare, come i primati non umani, potrebbero essere utili per il follow-up e l’analisi dei cambiamenti anatomici e funzionali dopo l’impianto sottoretinico nell’area retinica centrale. La descrizione dettagliata delle procedure di cura preoperatoria, chirurgica e postoperatoria sarà utile per studi futuri aumentando la generazione di dati efficienti e standardizzati.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il progetto è stato sostenuto dalla Czech Science Foundation (numero di progetto 18-04393S) e dalla Norway Grants and Technology Agency della Repubblica ceca (programma KAPPA, numero di progetto TO01000107).

Materials

Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 Mindray, Shenzhen, China Wato Ex-65 anesthesia machine
R-Evolution CR Optikon, Rome, Italy R-Evolution CR phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α Meridian, Thun, Switzerland Merilas 532α ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) Hi-R NEO 900A ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD Sony, Tokyo, Japan PMW-10MD full HD medical 2-piece 
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM Volk, Mentor, OH, USA MERLIN BIOM BIOM
Steam sterilizer Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL 3870 HSG sterilizer
iCam100 Optovue, Fremont, CA, USA iCAM100 funduscamera
iVue OCT100-2 Optovue, Fremont, CA, USA iVue OCT100-2 OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum Katena, New Jersey, US K1-5403 15mm blades
Ophthalmology surgical drape Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA 79304 132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) DORC, Zuidland, Netherlands 1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula DORC, Zuidland, Netherlands 1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up Surgical Specialties Corporation, Reading, USA 72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) DORC, Zuidland, Netherlands 1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe BBraun, Melsungen, Germany 4617022V 3ml
1ml soft-inject Tuberculin Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany 5010.200V0 1ml
8-0 Coated Vicryl Ethicon, Puerto Rico, USA J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml (FCI, Paris, France) S5.7170 1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga Synergetics, O'Fallon, USA 10.24.23PIN 23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps Alcon, Geneva, Switzerland 706.44 Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe  Synergetics, O’Fallon, USA 55.21.23
FCI Protect 2.0% FCI Ophthalmics, Paris, France S5.9100 viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 1-501 Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 2-100-1E 0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 2-504E 6mm
DK Needle Holder, Straigh Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 3-201 9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.  UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic tropicamidum 10 mg/ml eye drops
Diprophos Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands betamethasonum 7 mg/ml 1ml
Alcon BSS Irrigation Solution Alcon, Geneva, Switzerland balance salt solution (BSS) 500ml
Betaisodona Mundipharma, Cambridge, United Kingdom povidon-Iodine 1g/10ml 30ml
Depo-medrol 120mg Pfizer, New Yourk, USA methylprednisolon 5ml/200mg
Shotapen Virbac Carros Cedex, France benzylpenicillin, dihydrostreptomycin 250ml
Flunixin a.u.v. Norbrook, Newry, Northern Ireland flunixinum 50,0 mg 250ml
Tramal 100MG/2ML Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland tramadol 2ml
Zoletil 100 Virbac Carros Cedex, France tiletamine, zolazepam 100mg
Narkeran 10 Vetoquinol, Magny-Vernois, France ketamin 2ml
Rometar 20mg/ml Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic xylazinum 20mg
Braunol 75mg/g B.Braun medical, Prague, Czech republic povidone iodine 75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland propofol 10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom isoflurane 100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml Unimed pharma, Bratislava, Slovakia oxybuprakaine 10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.  Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland fenylefrin chloride 10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate 5mg
Floxal ung. Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany ofloxacin 0.30%
Eficur inj.  Hipra, Amer, Spain ceftiofurum hydrochloridum  50mg / 1ml
Draxxin Zoetis Inc., New Jersey, USA tulathromycinum 100mg / 1ml
Tramal Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland tramadoli hydrochloridum 100mg / 2ml
Xylapan Vetoquinol, Magny-Vernois, France xylazinum 0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA Proparacaine hydrochlorid 0.50%
Prograf  Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA Tacrolimus powder 1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts Corning Inc., Kenneburg, ME, USA 353103
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 12604021
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11320033
Biolaminin 521 LN (LN521) BioLamina, Sundbyberg, Sweden LN521-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific, MA, USA 35050061
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific, MA, USA J66742.0B
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA P4333
CRALBP Novus Biologicals, Abingdon, UK NB100-74392
Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Germany  21202
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Subretinal ImplantationRPEMinipigsAMDAge-related Macular DegenerationRPE Cell ReplacementCell CarrierSurgical TechniquePars Plana VitrectomyPosterior Vitreous DetachmentSubretinal Injection

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Lytvynchuk, L., Stranak, Z., Studenovska, H., Rais, D., Popelka, Š., Tichotová, L., Nemesh, Y., Kolesnikova, A., Nyshchuk, R., Brymová, A., Ellederová, Z., Čížková, J., Juhásová, J., Juhás, Š., Jendelová, P., Nagymihály, R., Kozak, I., Erceg, S., Binder, S., Müller, B., Stieger, K., Motlik, J., Petrovski, G., Ardan, T. Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care. J. Vis. Exp. (189), e63505, doi:10.3791/63505 (2022).
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