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Bioengineering

Subretinale Implantation von RPE auf einem Träger bei Minipigs: Leitlinien für präoperative Vorbereitungen, Operationstechniken und postoperative Versorgung

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/63505
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1Eye Clinic, Department of Ophthalmology,University Hospital Giessen and Marburg GmbH, 2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging, 3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine,Charles University in Prague, 4Institute of Macromolecular Chemistry,Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics,Czech Academy of Sciences, 6Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 7Institute of Experimental Medicine,Czech Academy of Sciences, 8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine,University of Oslo, 9Moorfields Eye Hospitals UAE, 10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab,Research Center “Principe Felipe”, 11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology,Sigmund Freud University

Summary

Die subretinale Implantation von retinalem Pigmentepithel (RPE) ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen. Die Leistung präklinischer Studien an großäugigen Tiermodellen bleibt jedoch eine Herausforderung. In diesem Bericht werden Leitlinien für die subretinale Transplantation von RPE auf einem Zellträger in Minischweine vorgestellt.

Abstract

Degenerative Erkrankungen der Netzhaut (einschließlich der altersbedingten Makuladegeneration), die vor allem an oder innerhalb der retinalen pigmentierten Epithelschicht (RPE) entstehen, führen zu einer fortschreitenden Desorganisation der Netzhautanatomie und einer Verschlechterung der Sehfunktion. Die Substitution von beschädigten RPE-Zellen (RPEs) durch in vitro kultivierte RPE-Zellen unter Verwendung eines subretinalen Zellträgers hat das Potenzial zur Wiederherstellung der anatomischen Struktur der äußeren Netzhautschichten gezeigt und wird daher weiter untersucht. Hier stellen wir die Prinzipien einer Operationstechnik vor, die die effektive subretinale Transplantation eines Zellträgers mit kultivierten RPEs in Minischweine ermöglicht. Die Operationen wurden unter Vollnarkose durchgeführt und umfassten eine standardmäßige linsenschonende Pars-Plana-Vitrektomie (PPV) mit drei Anschlüssen, die subretinale Anwendung einer balancierten Salzlösung (BSS), eine 2,7-mm-Retinotomie, die Implantation eines nanofaserigen Zellträgers in den subretinalen Raum durch eine zusätzliche 3,0-mm-Sklerotomie, einen Flüssigkeits-Luft-Austausch (FAX), eine Silikonöltamponade und einen Verschluss aller Sklerotomien. Dieser chirurgische Ansatz wurde in den letzten 8 Jahren bei 29 Operationen (18 Tiere) mit einer Erfolgsrate von 93,1% angewendet. Die anatomische Überprüfung der chirurgischen Platzierung erfolgte mittels in vivo Fundusbildgebung (Fundusfotografie und optische Kohärenztomographie). Die empfohlenen chirurgischen Schritte für die subretinale Implantation von RPEs auf einem Träger in Minischweinaugen können in zukünftigen präklinischen Studien mit großäugigen Tiermodellen verwendet werden.

Introduction

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) gilt in den Industrieländern als Hauptursache für den Verlust des zentralen Sehvermögens und ist eine von vielen Erkrankungen, die mit einer Dysfunktion des retinalen Pigmentepithels (RPE) zusammenhängen 1,2. Das RPE befindet sich auf der basal gelegenen Bruchschen Membran (BM) und sorgt für die notwendige Aufrechterhaltung der Photorezeptoren. Die fortschreitende Degeneration der RPE-Schicht ist ein Kennzeichen der frühen atrophischen Form der AMD und geht auch mit der Entwicklung der spätexsudativen Form der AMD einher. Trotz vieler Fortschritte in der Therapie von Netzhauterkrankungen bleibt die Entwicklung einer wirksamen Behandlungsmodalität eine Herausforderung3. Eine der vielversprechenden Methoden ist der RPE-Ersatz mit einer in vitro kultivierten RPE-Schicht. Diese Behandlung steht im Zusammenhang mit Fortschritten in der Stammzellforschung mit humanem embryonalem Stammzell-basiertem RPE (hESC-RPE) und induziertem pluripotentem Stammzell-abgeleitetem RPE (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. In den letzten Jahren haben sich viele Forschungsgruppen auf die Entwicklung verschiedener Ansätze für den RPE-Ersatz mit dem zunächst akzeptierten Proof-of-Concept 8,9,10,11,12,13,14,15 konzentriert. Die RPE-Zellen (RPEs) werden in der Regel in Form einer Zellsuspension, eines selbsttragenden Zellblatts oder einer Zellmonoschicht, die von einem künstlichen Träger 3,16,17,18,19,20,21 getragen wird, in den subretinalen Raum eingebracht. Die Injektion einer Zellsuspension ist die einfachste Methode, aber der beeinträchtigte Zustand des BM kann oft die Anheftung der transplantierten Zellen verhindern. Dies kann zu einer falschen apikobasalen Ausrichtung der RPEs und zur Bildung einer Monoschicht führen22,23. Der Hauptvorteil der beiden anderen Verfahren (d. h. einer selbsttragenden Zellschicht und einer Zellmonoschicht, die von einem künstlichen Substrat getragen wird) besteht darin, dass sich die Zellen bereits in einem differenzierten Monolagenzustand befinden, wenn sie direkt in den subretinalen Raum24 implantiert werden.

In den letzten Jahren wurden viele chirurgische Techniken veröffentlicht, die die Abgabe von Zellträgern in den subretinalen Raum beschreiben 8,9,10,11,12,13,14,15. Diese Studien beschrieben die Verwendung von großäugigen Tiermodellen, die Arten von Zellträgern, die Verwendung transplantierter Zellkulturen, die Implantationsinstrumente sowie die Operationstechniken, wobei sich die Autoren hauptsächlich auf die Ergebnisse der subretinalen Implantation konzentrierten. Im Jahr 2015 berichteten Popelka et al. über die Verwendung einer rahmengestützten, ultradünnen, elektrogesponnenen Polymermembran für die Transplantation von RPEs in Schweinekadaveraugen8. Die hier beschriebene Operationstechnik mit subretinaler Implantation des Zellträgers ermöglichte eine relativ präzise Handhabung des Trägers und eine einfache Positionierung des Gerüsts im subretinalen Raum. Kozak et al. bewerteten die Machbarkeit der Verabreichungstechnik eines Trägers mit einer ungefähren Größe von 2 mm x 5 mm in Schweineaugen9. Das einzigartige Design des Zellträgers ermöglichte seine korrekte Platzierung und verhinderte, dass sich die zelluläre Monoschicht faltet und faltet6. Al-Nawaiseh et al. präsentierten erstmals detaillierte Schritt-für-Schritt-Richtlinien für die subretinale Gerüstimplantation bei Kaninchen25. Stanzel et al. veröffentlichten dann 2019 ein ähnliches Protokoll für die Transplantation bei kleinen Nagetieren, Kaninchen, Schweinen und nichtmenschlichen Primaten26. Wie bereits veröffentlicht, führte die Transplantation einer differenzierten und polarisierten RPE-Monoschicht auf einen festen Träger zu einem verbesserten Überleben und einer besseren Integration des Transplantats im Vergleich zu anderen Verabreichungstechniken (Supplementary File 1)27.

Das Ziel aller präklinischen Tierstudien, die in vivo durchgeführt werden, besteht darin, die verschiedenen Aspekte der chirurgischen transvitrealen subretinalen Implantation eines Zellträgers aufzudecken, wobei der Schwerpunkt auf der Verfahrenssicherheit, dem Überleben der transplantierten Zellen, der Gewebereaktion auf die subretinalen Manöver sowie den kurz- und langfristigen postoperativen Ergebnissen liegt. Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Schweineaugen als Tiermodell mit großen Augen im Hinblick auf den Umfang der gewonnenen Daten relevant ist, was nützlich und potenziell auf den Menschen anwendbar sein könnte10,11,14. Unsere Studie berichtet über die Operationstechnik, die für die in vivo subretinale Implantation eines Zellträgers in einem großäugigen Tiermodell verwendet wird. Wir präsentieren eine detaillierte Beschreibung der präoperativen Vorbereitungen, der Operationstechnik der subretinalen Zellträgerimplantation und der postoperativen Versorgung der Minischweinaugen basierend auf unseren Erfahrungen der letzten 8 Jahre. Wir beschreiben die grundlegenden chirurgischen Prinzipien, die für experimentelle In-vivo-Studien mit der Implantation verschiedener Zelltypen und Zellträger verwendet werden können.

Großtiermodell
Die Versuchsherde der Liběchov-Minischweine wurde 1967 durch den Import von fünf Tieren des Hormel-Stammes aus den USA gegründet. Diese Tiere wurden für Schweineblutgruppenstudien mit mehreren anderen Rassen oder Stämmen gekreuzt: Landrasse, Large White, Cornwall, vietnamesische Schweine und Miniaturschweine Göttinger Herkunft28,29. Im Alter von 5 Monaten und ca. 20 kg Körpergewicht (KG) erreichen die Minischweine die Geschlechtsreife. Die Überlebenszeit der elterlichen Minischweinerassen (Hormel und Göttingen) wird mit 12-20 Jahren angegeben. Die subretinale Implantation des Zellträgers zielt auf den zentralen Teil der Netzhaut ab. Der Netzhaut von Minischweinen fehlen eine Makula und eine Fovea. Es gibt jedoch Regionen mit hochkonzentrierten Zapfen-Photorezeptoren, die als Area centralis bezeichnet werden, und visuelle Streifen30,31. Diese Regionen sind für die höchste Sehschärfe verantwortlich.

Die Operationen wurden von vier erfahrenen vitreoretinalen Chirurgen mit Unterstützung eines erfahrenen chirurgischen Assistenten (TA) durchgeführt. Vor den In-vivo-Experimenten wurden die Chirurgen geschult und erhielten spezielle Kenntnisse über die Anatomie des Minischweinauges, z. B. in Bezug auf das geringere Verhältnis von Linsen- zu Glaskörpervolumen, die kürzere axiale Länge (15-19 mm), das Fehlen der Bowman-Membran in der Hornhaut, das kleinere Glaskörpervolumen (2,8-3,2 ml), das Fehlen der Makula und Fovea, das Fehlen des Rings von Zinn und der Durchmesser der Papille (vertikal/horizontal: 1,5 mm/2,1 mm). In allen Fällen wurde die Operation unter Vollnarkose in einem speziell organisierten Operationssaal unter Anwendung von aseptischen und antiseptischen Standardmaßnahmen durchgeführt.

Protocol

Diese Studie hält sich an die Grundsätze der Richtlinien der Deklaration von Helsinki und an ethische Grundsätze für die medizinische Forschung am Menschen. Alle Versuche wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und nach der Gesellschaft für Seh- und Augenforschung (ARVO) für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von der Kurfachkommission des CAS für die Genehmigung von Tierversuchsprojekten am Institut für Tierphysiologie und Genetik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (Liběchov, Tschechische Republik) genehmigt (genehmigte Protokolle Nr. 60/2016 und Nr. 64/2019). 1. Überlegungen bei der subretinalen Transplantation von Zellen auf einem Träger in Minischweine Auswahl der TiereLiběchov-Minischweine im Alter von 12 bis 36 Monaten, beiderlei Geschlechts, und mit einem Körpergewicht von etwa 40 bis 80 kg (KG) zu beschaffen und zu verwenden. Halten Sie die Minischweine im Stall in einem klimatisierten Tierstall mit Temperaturen zwischen 18 und 22 °C, einem künstlichen Hell-Dunkel-Zyklus von 13 h/11 h, standardisierten Einzelbuchten, freiem Zugang zu Wasser und zweimal täglicher Fütterung. Vorbereitung vor der OperationÜberprüfen Sie die chirurgische Ausrichtung des Auges und zeichnen Sie die Fundusschemata. Dazu wird die Netzhaut der Minischweine auf der Funduszeichnung mit einem Stift mit einer vertikalen Linie schematisch in die temporale (von der Papille zum Ohr), die Nase (von der Papille in Richtung der Schnauze des Schweins) und die zentrale (zwischen den großen Netzhautgefäßen auf der Nasenseite) unterteilt (Abbildung 1A, B). Wählen Sie nur gesunde Tiere ohne Verhaltens- und neurologische Pathologie und mit normaler Qualität der Haut, der Körperöffnungen, des Kots und der Nahrungsaufnahme aus. Lassen Sie die klinische Beobachtung von einem erfahrenen Tierarzt durchführen und die Tiere auswählen. Injizieren Sie am Tag der Operation intramuskulär 3 mg/kg Körpergewicht Ceftiofurhydrochlorid (1 ml/kg). Präoperative ImmunsuppressionHerstellung von Tacrolimus-freisetzenden Polymermikrosphären, wie in Wang et al. und Sevc et al. 32,33 beschrieben, mit Modifikation. Stellen Sie sicher, dass die Tacrolimus-Konzentration in den Polymer-Mikrosphären 51,3 mg/g beträgt, wie durch HPLC (Table of Materials) bestimmt. Führen Sie 6 Tage vor der Augenoperation eine subkutane Injektion von Tacrolimus-beladenen Polymermikrosphären in einer Dosis von 0,25 mg/kg KGV durch, um die Abstoßung des Zelltransplantats zu verhindern. Dies geschieht, um das Überleben der humanen RPE-Spenderzellen während der xenogenen Transplantation in die Augen des Minischweins zu sichern. Injizieren Sie den Tieren am Tag der Operation intramuskulär 80 mg Depo-Medrol und Benzylpenicillin in einer Dosis von 1 ml/10 kg entsprechend dem Körpergewicht. AnästhesieVor der Operation ist eine Vollnarkose mit einer intramuskulären Injektion einer Mischung aus Tiletamin (2 mg/kg), Zolazepam (2 mg/kg), Ketamin (2 mg/kg) und Xylazin (0,4 mg/kg)-TKX34,35 einzuleiten. Überprüfen Sie die Narkosetiefe durch einen Zustand der Bewusstlosigkeit und durch die Überprüfung des Pedalreflexes (eine Zwickung der Zwischenzehenhaut des Hinterbeins), des Hornhautreflexes (eine leichte Berührung der Hornhaut), des Pupillenreflexes (Reaktion auf das Licht) und des Lidreflexes (eine Berührung des Augenlids). Achten Sie darauf, dass das Tier nicht blinzelt. Bestätigen Sie die Regelmäßigkeit der Herz- und Atemfrequenz. Nach der Narkoseeinleitung wird das sedierte Tier auf einem Hubwagen in den Operationssaal transportiert (Abbildung 2A). Legen Sie das Tier auf der linken Seite auf den Operationstisch, um eine Operation am rechten Auge zu ermöglichen (Abbildung 2B). Führen Sie die Anpassung des Kopfes des Tieres mit Styroporpolstern durch, um die für die Implantation am besten geeignete Position der zentralen Netzhaut zu erreichen (d. h. horizontal und parallel zum Boden) (Abbildung 2C). Augentropfen mit 0,5%iger Proparacainhydrochlorid-Augenlösung im Abstand von dreimal 1 Minute in den Bindehautsack geben, um eine Lokalanästhesie einzuleiten. Führen Sie eine Venenkanüle ein und intubieren Sie das Tier mit einem Endotrachealtubus zur inhalativen Aufrechterhaltung der Anästhesie (1,5 % Isofluran) mit einem Anästhesiegerät, das mit einem Patientenmonitor ausgestattet ist (Abbildung 2A, B). Verabreichen Sie ca. 15 Minuten vor Beginn der Augenoperation eine intramuskuläre Injektion von 1 ml Eficur pro 16 kg Körpergewicht und 20 mg Depo-Medrol 1 (Materialtabelle). Halten Sie die physiologische Körpertemperatur aufrecht, indem Sie das Tier mit isothermer Folie abdecken und die Operation wie in Abschnitt 3 beschrieben durchführen. Überwachen Sie während der Operation die Temperatur des Tieres zusammen mit der Herzfrequenz und der Blutsauerstoffsättigung mit einem Ohrclip und einem Patientenmonitor. Vermeiden Sie es, die Körpertemperatur während des Eingriffs unter 38 °C zu senken, was als sicherer Grenzwert36 gilt. Halten Sie die Sauerstoffsättigung (>96%) und die Pulsfrequenz (70-90 Schläge pro Minute) während des gesamten Experiments aufrecht. Wenn die Operation abgeschlossen ist, schalten Sie den Isofluranfluss ab und extubieren Sie das Tier. Nach der spontanen Atmung und dem Erwachen bringen Sie die Tiere in ihre Gehege. Einrichtung des OperationssaalsRichten Sie den Operationssaal entsprechend den Bedürfnissen der Operation an den Augen des großäugigen Tiermodells ein (Abbildung 3A, B). Passen Sie die Höhe der Chirurgenstühle sowie die Höhe des Mikroskops an, um eine bequeme Position für die Chirurgen in Bezug auf die Position der Schweineschnauze zu erreichen. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Netzhautzonen bei Minischweinen. (A) Schematische Darstellung der Netzhautzonen in Bezug auf den Kopf des Minischweins; Die gelbe Ellipse stellt den gewünschten Bereich der subretinalen Implantation dar, T bezieht sich auf den temporalen Netzhautbereich und N bezieht sich auf den nasalen Netzhautbereich. (B) Beispiel für das Fundusschema nach subretinaler Implantation des Zellträgers (gelb) durch Retinotomie (rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Transport und Unterbringung des Tieres . (A) Transport des sedierten Tieres in den Operationssaal. (B) Platzierung des Tieres während der Intubation. (C) Anpassung des Kopfes des Tieres für einen optimalen Zugang zur zentralen Netzhaut während der Operation (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Der Standard-OP-Setup. (A) Schematische Darstellung der Position des Chirurgen (S = Chirurg, A = Assistent) in Bezug auf die Position des OP-Tisches mit dem Minipig, dem Operationsmikroskop (OM), dem Vitrektomiegerät (VM), dem Instrumententisch (IT) und dem Anästhesiegerät (AM). Es gibt zwei mögliche Positionen des Vitrektomiegeräts (gelb und grau). (B) Reale Umgebung im Operationssaal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 2. Zellträger, kultivierte Zellkulturen und Implantationsinjektor ZellträgerSchneiden Sie den 30 μm breiten ovalen Rahmen mit den Außenmaßen 1,7 mm x 4,8 mm, ausgestattet mit dreieckigen Vorsprüngen, die asymmetrisch auf dem Rahmen angeordnet sind (Bild 4A), mit einem Femtosekundenlaser aus einer biaxial ausgerichteten 36 μm dicken Polyethylenterephthalat (PET)-Folie. Poly(L-lactid-co-DL-lactid) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) Polymerlösung in Pyridin in einer Konzentration von 11 Gew.-% unter Zugabe von 2,2 μl Ameisensäure pro 1 g Lösung herstellen. Bereiten Sie die nanofaserige Membran mit einem eingebetteten Stützrahmen (Abbildung 4B) durch das Elektrospinnen der Polymerlösung in drei Schritten8 vor: (1) Abscheiden der ersten Schicht von Nanofasern auf einem Siliziumsubstrat, (2) Auflegen des Rahmens auf die Schicht und (3) Abscheiden der zweiten Schicht von Nanofasern.Anmerkungen: Jede Schicht 7 Minuten lang auftragen, um eine Gesamtmembrandicke von 3,7 μm zu erreichen. Um eine Membran aus 380 nm dicken Fasern mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,4 μm und einer Porosität von etwa 70 zu erhalten, verwenden Sie die folgenden Parameter: eine 20-G-Ganzstahlnadel, eine Spannung von 7,1 kV, einen Spalt von 10 cm, eine Flussrate von 250 μl/min und eine Temperatur von 25,0 °C ± 0,5 °C. Entfernen Sie vorsichtig die Membran mit dem eingebetteten Rahmen vom Silikonsubstrat und befestigen Sie sie am Körper eines handelsüblichen 12-Well-Zellkultureinsatzes ohne die ursprüngliche Membran, um die Aussaat und das Wachstum der Zellen zu erleichtern. Behandeln Sie die nanofaserige Membran vor der Zellaussaat 30 s lang in Luft-Plasma bei einer Leistung von 70 W in einem Plasmareiniger. Zellkulturen, die für die Kultivierung auf dem Zellträger verwendet werdenHINWEIS: Die folgenden Zellträger können verwendet werden: 1) nanofaserige Zellträger ohne Zellen; 2) nanofaserige Zellträger mit primären humanen RPEs (hRPEs); 3) nanofaserige Zellträger mit humanen iPSC-abgeleiteten RPE-Zellen.Kultivierung von primären hRPEs Primäre hRPE-Zellen aus menschlichen Spenderaugen nach einer zuvor beschriebenen Technikisolieren 38. Die Zellen werden durch enzymatische Behandlung der Netzhaut für 30 Minuten gewonnen. Anschließend werden die primären hRPE-Zellen (Passage 0) bis zu 2 Wochen lang in DMEM/F12 kultiviert, die mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) ergänzt werden. Sobald die Zellkulturen zusammenfließen, wechseln Sie das Medium auf 1 % FBS und kultivieren Sie es für weitere 30 Tage. Säen Sie die primären hRPEs auf Transwell-Platten und auf einen lamininbeschichteten nanofaserigen Zellträger mit einer Dichte von 2.000 Zellen/mm2. Nach einer weiteren 30-tägigen Inkubation in 1% FBS werden die Zellträger mit primären hRPEs für die subretinale Implantation in Minischweine verwendet. Humane iPSC-abgeleitete RPEsVerwenden Sie hiPS-Zellen, die von MERTK-assoziierten Retinitis pigmentosa-Fibroblasten 39 abgeleitet sind, die mit dem CRISPR/Cas9-System (RP1-FiPS4F1-GC2)40 in zwei Allelen genkorrigiert werden, sowie hiPS-Zellen, die aus den Fibroblasten eines gesunden Probanden gewonnen werden (Strg2-FiPS5F2)41 , die als Kontrolle verwendet werden. Generierung und anschließende Differenzierung beider hiPS-Zelllinien in Richtung RPE-Zellen (hiPSC-RPE), wie zuvor berichtet42. Die hiPSC-RPEs werden bei 200.000 Zellen/cm2 auf lamininbeschichteten Zellkultureinsätzen mit nanofaserigen Membranen aus Poly(L-lactid-co-DL-lactid) mit ovalen Implantationsrahmen in RPE-Medium mit Knockout-DMEM, 20 % Knockout-Serum, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,23 mM β-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 10 mM Nicotinamid plattiert. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag und kultivieren Sie das hiPSC-RPE 2 Monate lang vor der Implantation, um ein polarisiertes Wachstum zu fördern. Implantations-InjektorEine Kunststoffkapillare mit einem rechteckigen Querschnitt von 2,8 mm x 0,8 mm wird durch Blasformen aus einem Kunststoffrohr mit einem Außendurchmesser von 1,75 mm/Innendurchmesser 1,10 mm hergestellt. Schneiden Sie ein Ladefenster von 4 mm x 2,2 mm 6 mm vom Ende entfernt in die Kunststoffkapillare. Montieren Sie den Injektor aus der Kunststoffkapillare, einem Silikongriff, einem Stahlklingenkolben und einem Kolben (Abbildung 5A). Laden Sie den Träger durch ein Ladefenster in den Injektor und werfen Sie ihn später durch Drücken des Kolbens in den subretinalen Raum aus, wie in Schritt 3.5.2 beschrieben (Abbildung 5B). Präparation des nanofaserigen Trägers und Beladung des InjektorsFüllen Sie eine kleine Kunststoff-Petrischale mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Nehmen Sie eine Einlage mit der vorbereiteten Zellschicht heraus, legen Sie sie auf eine halbweiche Styroporschale und zentrieren Sie sie unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie einen speziell modifizierten Stempel, um den Träger mit einem Mikroskop entlang des ovalen Rahmens auszuschneiden. Die Trägermaße sollten 2 mm x 5 mm betragen. Verwenden Sie einen speziell angefertigten Injektor mit flachem transparentem Schlauch zum Beladen des Trägers. 6 mm vom distalen Ende der Kapillare entfernt befindet sich ein Fenster zum Beladen des Trägers. Füllen Sie das Fenster des Injektors mit PBS. Lösen Sie die Probe mit der Pinzette vom Boden der Schale, heben Sie sie aus der Flüssigkeit und transportieren Sie sie zum Fenster des Injektors, während Sie zuerst die seitlichen Ausrichtungsmarkierungen auf dem Rahmen überprüfen, um die Oberseite des Trägers mit anhaftenden Zellen zu erkennen. Ein ovaler Rahmen erleichtert die Handhabung mit dem Träger. Positionieren Sie den Träger mit einer Dentalsonde (ein zahnärztliches Instrument aus Edelstahl mit scharfem Ende) im Fenster des Injektors. Schieben Sie den Träger mit dem Kolben in den geschlossenen und sicheren oberen Teil des Injektors. Bereiten Sie dann den Träger für die Operation vor. Überprüfen Sie bei jedem Schritt die seitliche Ausrichtung des Trägers. Entladen Sie den nanofaserigen Träger aus dem Injektor, indem Sie den Metallkolben drücken. Abbildung 4: Nanofaseriger Träger mit eingebettetem PET-Stützrahmen. (A) Drei sichtbare Markierungen auf dem Rahmen ermöglichen die Kontrolle der Seitenausrichtung des Trägers (weiße Pfeile). (B) Vergrößerung des in die nanofaserige Membran eingebetteten PET-Rahmenfragments (weiße Pfeile) des Zellträgers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Implantationsinjektor . (A) Teile des Injektors. (B) Nanofaseriger Zellträger mit eingebettetem PET-Stützrahmen, der in die rechteckige Kunststoffkapillare des Implantationsinjektors geladen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 3. Chirurgischer Eingriff Chirurgische AusrüstungVerwenden Sie die folgenden chirurgischen Geräte: ein ophthalmologisches Operationsmikroskop, ein Betriebssystem für Operationen am vorderen und hinteren Augenabschnitt, ein berührungsloses vitreoretinales chirurgisches System, ein Laser-Photokoagulationsgerät und eine Digitalkamera.HINWEIS: Die Standardparameter, die bei Vitrektomie-, Exo- und Endokauterisations- und Laser-Photokoagulationsgeräten verwendet werden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Chirurgische InstrumenteSterilisieren Sie die wiederverwendbaren chirurgischen Instrumente mit einem mobilen Autoklaven-Dampfsterilisator oder ähnlichem nach einem Standardprotokoll. Die chirurgischen Einweginstrumente und -materialien, die während der Operation benötigt werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Vorbereitung auf die OperationsschritteNach der Betäubung des Tieres, wie in Schritt 1.4.1 beschrieben, 1 % Tropicamid Lösung Augentropfen und 10 % Phenylephrinhydrochloridlösung 15 Minuten vor dem Eingriff in den Bindehautsack auftragen, um eine medikamenteninduzierte Mydriasis zu provozieren. Nähern Sie sich dem Operationstisch mit dem Chirurgen in der oberen Position und dem Assistenten in der Seitenposition (Abbildung 3). Rasieren Sie den Bereich um das Auge mit einem Einweg-Rasierer und entfernen Sie den groben Schmutz. Desinfizieren Sie den Bindehautsack mit 5%iger Povidon-Jod-Lösung für 5 min. Desinfizieren Sie den periorbitalen Bereich mit Wattestäbchen, indem Sie von den Augenlidern bis zur Peripherie schrubben. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung und lassen Sie ihn 5 Minuten einwirken. Decken Sie das Operationsfeld mit dem Auge in der Mitte mit einem sterilen Standard-Brillentuch mit klebriger transparenter Folie ab. Bewegen Sie die Wimpern vom Augapfel weg. Vermeiden Sie es, die Wimpern zu schneiden, um das Risiko einer postoperativen Endophthalmitis zu verringern. Setzen Sie das Deckelspekulum (Liberman-Typ oder Cook-Augenspekulum) ein. Optional können Sie die Nickhaut mit 8-0 auf der Haut befestigen Polyglactin-Naht. Öffnen Sie die Bindehaut auf der Nasenseite 2 mm bis 3 mm vom Limbus entfernt, um die Sklera für die Sklerotomien mit einer chirurgischen Zange und einer Westcott-Bindehautschere freizulegen. Die dreiventiligen 25 G-Trokare 2,5-3 mm vom Limbus entfernt im Bereich der Pars plana einsetzen (bei 7 Uhr, 10 Uhr und 11 Uhr platzieren). Verwenden Sie während der Insertion Drehbewegungen in leicht schräger Richtung (100°-110°) in Richtung der hinteren Netzhaut und halten Sie den Trokar mit der Pinzette fest (Abbildung 6). Halten Sie die Hornhaut während der gesamten Operation feucht oder beschichten Sie sie mit Methylcellulose, um ein osmotisches Hornhautödem zu verhindern. Pars-plana-Vitrektomie (PPV)Entfernen Sie den mittleren Teil des Glaskörpers mit dem standardmäßigen Pars-Plana-Vitrektomieansatz mit drei Anschlüssen. Entfernen Sie vorsichtig den Glaskörper hinter der Linse im Bereich der zukünftigen großen Sklerotomie. Verwenden Sie eine intravitreale Injektion von 2-4 mg Triamcinolonacetonid (TA) (50-100 μl), um den hinteren Glaskörper, der normalerweise an der Netzhaut haftet, zu färben, um eine kontrollierte hintere Glaskörperablösung durchzuführen. Führen Sie danach langsam eine subretinale Injektion von 0,05-0,1 ml BSS mit einer 41-G-Kanüle zentraler durch, um die Bildung einer Blase in Richtung Peripherie zu vermeiden. Reduzieren Sie den Augeninnendruck mit dem Spülsystem während der subretinalen Injektion auf 15 mmHg, um einen vorübergehenden retinalen Gefäßverschluss zu verhindern. Führen Sie eine lineare große Endodiathermie der Netzhaut mit einer 27 G Endodiathermiesonde 3 mm in der Nähe der Nasenblasenbasis durch. Führen Sie anschließend eine 3 mm große Retinotomie mit einer 25 G MVR-Klinge oder einer vertikalen Schere mit erhöhtem Augeninnendruck (IOD) des Spülsystems auf 60 mmHg für 3 min bis 5 min durch. Stellen Sie sicher, dass es bei der Retinotomie keine Blutungen gibt, und reduzieren Sie dann den Augeninnendruck auf 25 mmHg. Führen Sie eine Exodialthermie der episkleralen Gefäße zwischen den beiden Nasentrokaren 2,5-3 mm vom Limbus entfernt mit einer 27 G Endothothermiesonde durch, indem Sie die Oberfläche der Sklera sanft berühren. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand der Infusionsflasche, bevor Sie die Sklerotomie vergrößern, da nach einer Sklerotomievergrößerung der Flüssigkeitsverbrauch vorübergehend hoch ist. Machen Sie eine 3,0 mm große Sklerotomie, 3 mm vom Limbus entfernt, mit einem 2,75 mm Phakomesser. Achten Sie auf mögliche Blutungen aus den Skleragefäßen und dem Ziliarkörper innerhalb der großen Sklerotomie. Verwenden Sie bei Blutungen eine 27-G-Endothermiesonde, um die beschädigten Gefäße zu koagulieren. Vergrößern Sie die Sklerotomie mit einem Satinmesser auf 3,0 mm, um die Spitze des Injektors aufzunehmen (0,8 mm x 2,8 mm). Entfernen Sie den vorgefallenen Glaskörper an der Stelle der großen Sklerotomie mit einem Vizerektor. Halten Sie die Infusion von BSS mit dem Vitrektomiesystem auf einem Niveau von 25-30 mmHg, um einen Kollaps des Bulbus zu vermeiden. Implantation des ZellträgersFühren Sie den Injektor vorsichtig mit der dominanten Hand durch die große Sklerotomie in die Glaskörperhöhle ein. Im Falle eines Widerstands vergrößern Sie die Sklerotomie. Implantieren Sie den Zellträger durch die Retinotomie in den subretinalen Raum. Verwenden Sie bei Bedarf eine bimanuelle Technik mit zusätzlicher Sklerotomie und Kronleuchterlicht, um die Kontrolle der Implantation zu verbessern. Ziehen Sie den Injektor aus dem Auge und schließen Sie die große Sklerotomie mit einem 8-0 Polyglactin-Naht, um Komplikationen im Zusammenhang mit intraokularer Hypotonie zu vermeiden. Führen Sie einen vollständigen Flüssigkeits-Luft-Austausch (FAX) und eine Drainage der subretinalen Flüssigkeit mit einer Silikonkanüle durch. Danach wird Silikonöl (1.000 cSt) mit dem Vitrektomiesystem und dem Schlauchsystem für die Silikonölinjektion in die Glaskörperhöhle injiziert, bis der Augeninnendruck normal ist. Intraoperative Bildgebung und DokumentationFühren Sie während der gesamten Operation eine Videoaufzeichnung mit Fotodokumentation der wichtigsten Schritte der Implantation mit einem Videoaufzeichnungssystem durch. Vervollständigen Sie die Funduszeichnung, indem Sie die Lage der Sklerotomien, der Retinotomie, des subretinalen Implantats und aller Komplikationen, die aufgetreten sind, anhand von Funduszeichnungsschemata dokumentieren. Postoperative SchritteEntfernen Sie am Ende der Operation die Trokare und schließen Sie die drei Sklerotomien und die Bindehaut mit 8-0 Polyglactin-Nähte. Spülen Sie den Bindehautsack mit 5%iger Povidon-Jod-Lösung. Führen Sie eine 0,3 ml subkonjunktivale Injektion von 20 mg Gentamicin, 2 mg Dexamethason und 2 % Xylocain durch. Überprüfen Sie den Zustand des Fundus und der Linse mit einer mikroskopischen Ansicht. Entfernen Sie die Naht(en) von der Nickhaut mit einer chirurgischen Pinzette und einer Westcott-Bindehautschere (optional). Tragen Sie Neomycin-Salbe oder Ofloxacin-Augensalbe in den Bindehautsack auf. Abbildung 6: Einsetzen der Trokare in das Auge eines Minischweins. (A) Schematische Darstellung der Trokare, die beim menschlichen Auge senkrecht in die Sklera zur Mitte der Glaskörperhöhle eingeführt werden (graue Farbe) und schräg zur hinteren Netzhaut im Minischweinauge (blaue Farbe), um eine Schädigung der Linse zu vermeiden. Die Linse des Minischweins (blau gefärbt) ist größer als beim Menschen und relativ zur Glaskörpergröße. (B) Intraoperative Ansicht der eingesetzten Trokare in einem PPV mit drei Anschlüssen. Die Hornhaut ist mit Methylcellulose bedeckt, um Austrocknung und Schwellung zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 4. Nachsorge Fünfmal täglich topisches Bacitracin, Zink/Hydrocortisonacetat/Neomycinsulfat oder 0,3 % Loxacin in den Bindehautsack der Tiere auftragen. Postoperativ sind folgende Augenparameter zu kontrollieren: Turgor der Weichteile des Auges durch Abtasten, Entzündungsreaktion auf der Augenoberfläche und Schielen als Schutzreaktion der Augenlider mit einer Handspaltlampe oder einem indirekten Ophthalmoskop. Für die systemische postoperative Versorgung sind folgende Antibiotika zu verwenden:Injizieren Sie intramuskulär Ceftiofurhydrochlorid in einer Dosis von 3 mg/kg KG/(1 ml/kg) am zweiten und dritten Tag der Stabilität. Injektion von Tulathromycin (1 ml/40 kg KG) nach 72 Stunden postoperativ zur Vorbeugung einer bakteriellen Sekundärinfektion. Führen Sie 3 Tage nach der Operation alle 24 Stunden eine intramuskuläre Injektion von Flunixin (2 ml/45 kg Lebendgewicht) und Tramadolhydrochlorid (100 mg) durch, um Schmerzen vorzubeugen. Halten Sie die Minischweine in einer speziellen klimatisierten Anlage mit einem Temperaturbereich von 18-22 °C und einem künstlichen Hell-Dunkel-Regime von 13 h/11 h. Stellen Sie sicher, dass sie freien Zugang zu Wasser und Standardfütterung haben (zweimal täglich). 5. Postoperative Verfahren Postoperative ophthalmologische UntersuchungenIn der postoperativen Phase untersuchen Sie die Augen mit einem indirekten Ophthalmoskop auf das Vorhandensein einer Entzündung (d. h. Rötung, Gewebeschwellung oder Schleimstau im Bindehautsack). Messen Sie den Augeninnendruck im operierten Auge mit der Palpationsmethode. Postoperative BildgebungInduzieren Sie die Sedierung des Minischweins durch die intramuskuläre Injektion einer TKX-Mischung vor der Fundusfotografie und der OCT-Untersuchung. 1 % Tropicamid und 10 % Phenylephrinhydrochlorid Augentropfen in den Bindehautsack des Minischweins träufeln, um Mydriasis zu induzieren. Verwenden Sie ein Lidspekulum, um die Augen offen zu halten. Um die Augenoberfläche mit Feuchtigkeit zu versorgen und ein klares OCT-Bild zu erhalten, waschen Sie die Hornhaut des Tieres alle 30-60 s mit Kochsalzlösung (0,9 % NaCl). Positionieren Sie das Minipig auf dem Operationstisch auf die gleiche Weise wie während der Operation (Abbildung 2B,C, Abbildung 3A). Die Hauptanforderung besteht darin, den Kopf seitlich und senkrecht zum Scanteil des OCT-Geräts zu platzieren. Verwenden Sie Styroporpolster unter der Schnauze des Tieres, um den Kopf zu stabilisieren und die Augenoberfläche in eine horizontale Position zu bringen. Erfassen Sie Farbfundusbilder mit einer nicht-mydriatischen Farbfunduskamera, da dies die Dokumentation des vorderen Augenabschnitts, der Netzhaut und der Papille ermöglicht. Machen Sie zusätzlich ein rotfreies Bild der Netzhaut mit der nicht-mydriatischen Funduskamera. Führen Sie optische Kohärenztomographie-Bildgebung mit dem Spektralbereichs-OCT-System durch. Neigen Sie während der OCT- oder Fundusbildgebung den Kopf des Minischweins manuell in Richtung der OCT-Linsen oder Funduskameralinsen, um die Sicht auf die hintere Netzhaut und den Implantationsbereich zu optimieren (Abbildung 2C). Für eine optimale Bildgebung des implantierten Trägers auf dem Fundus wenden Sie das Infrarot-Reflexionslicht des OCT-Geräts an, um auf das Implantat zu fokussieren (Abbildung 2C). Verwenden Sie die OCT-Crossline- und Retina-Map-Scan-Modi. Tragen Sie Ofloxacin Augensalbe am Ende der Untersuchung unter dem Augenlid des Tieres auf. Bringen Sie das Minischwein in die Innenanlage und beobachten Sie seinen Allgemeinzustand bis zum Ende der Sedierung (ca. 2 h bis 5 h). 6. Enukleation des Auges post mortem nach Euthanasie Sedieren Sie die Minischweine mit einer intramuskulären Injektion der TKX-Mischung, gefolgt von einer intravenösen (über eine 22-G-Ohrkanüle) Bolusgabe von 1 % Propofol (20 ml/Tier) und anschließender Ausblutung. Verwenden Sie keine allgemeinen Fixiermittel. Opfern Sie die Tiere durch Ausblutung während tiefer Vollnarkose 7 Tage, 14 Tage, 28 Tage und 42 Tage nach der Implantation des Zelltransplantats. Verwenden Sie eine Pinzette und eine Schere, um das obere und untere Augenlid zu entfernen. Entfernen Sie das dritte Augenlid und schneiden Sie die Bindehaut durch. Durchtrennen Sie die Augenmuskeln und den Sehnerv. Entkernen Sie die Augen post mortem mit einer chirurgischen Schere und einer chirurgischen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass der Eingriff von einer erfahrenen Person durchgeführt wird.

Representative Results

Die Ergebnisse der subretinalen Implantation des Zellträgers in Liběchov-Minischweinen werden in Table 2 vorgestellt. Eine erfolgreiche Implantation wurde definiert als die Gewinnung ausreichender Daten für histologische und immunhistochemische Untersuchungen. Fehlgeschlagene Fälle wurden als Augen mit schweren intraoperativen Komplikationen definiert, die eine weitere Beobachtung des Augengewebes unmöglich machten. Die Anwendung der vorgeschlagenen Technik unter Verwendung einer Silikonöltamponade ermöglicht es, den Zustand des subretinalen Transplantats mit bildgebenden Verfahren ab dem nächsten Tag nach der Operation bis zum Zeitpunkt der Enukleation zu kontrollieren (Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9). Fundusbildgebung und SD-OCTDie Minischweine wurden in der postoperativen Phase mittels Fundusbildgebung, rotfreier Bildgebung und optischer Kohärentomographie im Spektralbereich untersucht (Abbildung 7). Eine qualitativ hochwertige Fundusbildgebung wurde durch die Verwendung klarer optischer Medien, einschließlich einer klaren Linse und der Verwendung einer Silikonöltamponade, ermöglicht (Abbildung 7A). Die Stelle der Retinotomie zeigte keine Anzeichen einer proliferativen Reaktion (Abbildung 7A, gelbe Pfeile), und das PTE-Gerüst des Zellträgers war durch die halbtransparenten Schichten der Schweinenetzhaut deutlich sichtbar. In der rotfreien Bildgebung unterschied sich das Reflexionsvermögen der kultivierten hRPEs auf dem Träger nicht von dem Reflexionsvermögen der endogenen porcinen RPE-Schicht (Abbildung 7B). Beim SD-OCT verursachte der PTE-Rahmen nur eine geringe Abschattung der darunter liegenden anatomischen Strukturen und eine leichte Verdickung der Netzhaut (Abbildung 7C, rote Pfeile). Auf dem SD-OCT wurden keine atypischen hypo- oder hyperreflektierenden Zonen festgestellt, und auch die Bruchsche Membran schien unbeschädigt zu bleiben. Abbildung 8 zeigt Fundus- und iOCT-Bilder des Gerüsts, das 1 Monat nach der Operation mit primären humanen RPE-Zellen kultiviert wurde (Abbildung 8). Der Zellträger selbst (ohne Zellen) verursachte keine signifikante Zunahme der Netzhautdicke (Abbildung 9C). Diese Befunde deuten darauf hin, dass der intraoperative iatrogene Einfluss des Implantats minimal war und dass der implantierte Zellträger eine ausreichende Anpassung der implantierten Zellen an die darüber liegenden Photorezeptorzellen und das neuroretinale Gewebe erfuhr. Abbildung 7: Postoperative Bildgebung der Netzhaut bei Minischweinen . (A) Fundusbildgebung, (B) Rot-freies Bild und (C) optische Kohärenztomographie-Bildgebung des nanofibrösen Trägers mit primären humanen RPE-Zellen in einem 1-wöchigen Follow-up nach subretinaler Transplantation in einem Minischweinauge. (A) Die gelben Pfeile zeigen die Stelle der Retinotomie an. (B) Rote Pfeile zeigen die Ränder des nanofaserigen Zellträgers. (C) Die roten Pfeile zeigen die leichte Abschattung des OCT-Signals, die durch den stützenden PET-Rahmen des nanofaserigen Trägers verursacht wird, der in den subretinalen Raum implantiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: Fundusbildgebung und iOCT-Bilder der Scaffolds 30 Tage nach subretinaler Implantation bei den Minipigs. A, B, C, D und E entsprechen den Schweinen 169, 182, 179, 199 bzw. 224. Die gelben Pfeile zeigen den Rahmen des Gerüsts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Histologische und immunhistochemische AnalyseNach der Euthanasie der Tiere wurden ganze Minischweinaugen entfernt und für 24 h in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Der vordere Teil des Auges wurde entfernt, und der implantierte nanofaserige Träger wurde in der nasalen zentralen Netzhaut identifiziert und mit der Sklera isoliert. Alle Gewebe wurden in abgestuften Saccharoselösungen kryogeschützt, und vertikale Gefrierschnitte wurden geschnitten, wie im Detail43 beschrieben. Die Histologie der nanofibrösen Membran ohne RPE-Zellen nach 4-wöchiger Implantation ergab Netzhaut ohne Entzündung und degenerative Veränderungen (Abbildung 9A). Das Vorhandensein der nanofaserigen Membran wurde in polarisiertem Licht nachgewiesen (Abbildung 9B). Abbildung 9: Histologische Analyse der implantierten azellulären nanofibrösen Membran. Hämatoxylin-Eosin-Färbung der azellulären nanofibrösen Membran 4 Wochen nach der Implantation (A) mit Standardbeleuchtung und (B) mit Polarisationsmikroskopie. Der weiße Pfeil zeigt die Lokalisation der nanofaserigen Membran an (Maßstabsbalken: 50 μm). (C) In vivo optische Kohärenztomographie-Aufnahmen der azellulären nanofibrösen Membran nach 4 Wochen nach Implantation zeigen eine gute Akzeptanz und Adhärenz der nanofibrösen Membran im subretinalen Raum. Der weiße Pfeil zeigt die Lage des Implantats im Querschnittsbild der Netzhaut an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 10 zeigt die Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung des Netzhautbereichs, der die implantierten primären hRPE-Zellen enthält, auf einem nanofibrösen Träger (gelber Pfeil) im Minischweinauge. Das pigmentierte Erscheinungsbild der implantierten primären hRPEs bildete eine durchgehende, aber unregelmäßig pigmentierte Schicht (Abbildung 10, rote Pfeile). Nach längerer Beobachtungszeit (6 Wochen) zeigte die Neuroretina unter den Implantaten ein rosettenartiges oder hypertrophes reaktionsähnliches Erscheinungsbild um die Retinotomiestelle, wahrscheinlich als Folge einer iatrogenen Manipulation. Diese morphologischen Ergebnisse sind vergleichbar mit den SD-OCT-Befunden und unterstützen die Evidenz für den minimalen Einfluss der Trägerverabreichung auf das Netzhautgewebe. Abbildung 10: Histologische Analyse der implantierten nanofibrösen Membran mit den primären hRPEs. Hämatoxylin-Eosin-Färbung des Netzhautareals mit dem implantierten nanofibrösen Träger (gelber Pfeil) mit den primären hRPEs im Minischweinauge. Das Tier wurde eingeschläfert und 6 Wochen nach der Implantation analysiert. Die primären hRPEs unterschieden sich deutlich durch ihre Größe, runde Form und Pigmentierung (rote Pfeile) im subretinalen Raum gegenüber den Photorezeptoren. Die Photorezeptorkerne im ONL bilden rosettenartige Strukturen. Der subretinale Raum erscheint hypertroph. Abkürzungen: hRPE = primäres humanes retinales pigmentiertes Epithel, ONL = äußere Kernschicht, INL = innere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die Immunfärbung wurde mit einer zweistufigen indirekten Methode durchgeführt. Die Schnitte wurden über Nacht bei Raumtemperatur in CRALBP, einem monoklonalen Primärantikörper, in einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Die Immunfluoreszenz wurde mit Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörpern durchgeführt. Die implantierten primären hRPEs waren im Bereich der Implantation vorhanden und exprimierten den typischen RPE-CRALBP-Marker, ähnlich den endogenen Minischwein-RPE-Zellen (Abbildung 11A). Im Gegensatz dazu schien die Morphologie der implantierten Zellen nach der Implantation keine Monoschichtform anzunehmen, sondern innerhalb des definierten subretinalen Raums lokalisiert zu bleiben (Abbildung 11A,B, weiße Pfeile). Die folgenden RPE/Netzhautmarker und das morphologische Erscheinungsbild blieben nach der 6-wöchigen Postimplantationsphase positiv: das Vorhandensein von Pigment-/Melaningranula, die netzhautspezifischen neuronalen Marker für die Stäbchen-Bipolarität (PKC-alpha) und die Zapfen-Photorezeptoren (PNA) sowie die GFAP-Positivität – ein Zeichen für die Aktivierung der Mikroglia. Abbildung 11: Immunmarkierung mit dem RPE-Zellmarker CRALBP (zelluläres Retinaldehyd-bindendes Protein) in einem Minischwein 6 Monate nach Implantation von primären hRPEs. (A) Vertikale Tiefkühlschnitte des behandelten Schweineauges wurden mit monoklonalen CRALLP-Antikörpern (grün) immunmarkiert und mit DAPI (blau) gegengefärbt. (B) Einzeldarstellung der Zellkernmarkierung mit DAPI in Schwarz-Weiß, da bei hohem Kontrast die runde Form der einzelnen hRPE-Zellen erkennbar ist (teilweise mit weißen Pfeilen dargestellt). Abkürzungen: hRPE = humanes retinales Pigmentepithel, ONL = äußere Kernschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. AugenkomplikationenInsgesamt wurden 27 von 29 (93,1 %) Operationen erfolgreich durchgeführt. Die Definition “erfolgreich durchgeführte Operationen” wurde auf diejenigen Fälle angewendet, in denen das operierte Auge bis zum Zeitpunkt der Enukleation keine klinisch signifikanten postoperativen Komplikationen aufwies, die die histologische und immunhistochemische Untersuchung beeinflussen könnten. Die verminderte Transparenz der optischen Medien wirkte sich in vier Fällen (13,7%) auf die postoperative Bildgebung aus; Nichtsdestotrotz wurden diese Augen mit weiteren histologischen und immunhistochemischen Analysen bearbeitet. In vier Fällen (13,8%) kam es zu einer intraoperativen peripheren Netzhautablösung. In zwei Fällen wurde sie durch Aspiration der subretinalen Flüssigkeit während des Flüssigkeits-Gas-Austauschs und die Anwendung einer Laser-Photokoagulation der Netzhaut im Bereich der Ablösung bewerkstelligt. In den beiden anderen Fällen (6,9 %) war die Netzhautablösung mit massiven Netzhaut- und subretinalen Blutungen verbunden, die die Implantation des Zellträgers unmöglich machten und zum Abbruch der Operation und zur sofortigen Euthanasie des Minischweins auf dem Operationstisch führten. Nein Parameter Standardmäßig verwendete Einstellungen 1 Vitrektomie-Geschwindigkeit (Schnittgeschwindigkeit) bis zu 20.000 Schnitte/min 2 Venturi-Pumpe 50-180 mmHg 3 Anstiegszeit 1 Sek 4 Bewässerungsdruck 18-25 mmHg 5 Luft-Infusionsdruck 20-25 mmHg 6 Bipolare Exodiathermie 18-26% 7 Monopolare Endodialthermie 16-18% 8 Laser-Photokoagulation der Netzhaut, 532 nm Leistung 100-150 mW Intervall 100 ms Dauer 100 ms Tabelle 1: Standardparameter, die bei der Vitrektomie und Laser-Photokoagulation verwendet werden. Tiere gesamt, n 18 Augen gesamt, n 36 Operierte Augen, n 29 Erfolgreiche Implantation, n 27 Fehlgeschlagene Fälle, n 2 Durchschnittliche Operationszeit, min 57 Erfolgsquote, % 93.1 Tabelle 2: Ergebnisse der standardisierten Operationstechnik mit subretinaler Implantation des Zellträgers bei Liběchov-Minischweinen zwischen 2016 und 2020. Ergänzendes Dossier 1: Zusammenfassung der Studien, die sich mit der subretinalen Implantation von RPE-Zellen auf dem Zellträger befassen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die subretinale Implantation von RPE-Zellen unterschiedlicher Herkunft ist ein vielversprechender Trend in der Augenforschung zur Behandlung von degenerativen Netzhauterkrankungen wie AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Die Hauptidee dieses Ansatzes besteht darin, die beschädigten RPEs durch gesunde RPEs zu ersetzen, die ex vivo kultiviert wurden (Supplementary File 1)44,45,46,47,48. Die Verwendung von Zellträgern zur Transplantation der kultivierten RPE-Zellen stellt den sinnvollsten Ansatz dar, da die porösen Membranen die polarisierte RPE-Zellschicht in der richtigen Ausrichtung in Bezug auf die photosensorische Schicht halten.

Optimales Tiermodell
Ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung solcher Behandlungsansätze ist die Verwendung des optimalen Tiermodells49. In der Vergangenheit wurden kleine und große Tiermodelle verwendet, darunter Kaninchen, Hunde, Schweine und nichtmenschliche Primaten 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. In diesem Artikel schlagen wir die Verwendung des Liběchov-Minischweinmodells vor und beschreiben die präoperativen, chirurgischen und postoperativen Schritte, die eine robuste Transplantationseffizienz ermöglichen. Das Liběchov-Minischwein wurde ursprünglich vor etwa 20 Jahren gezüchtet und wurde häufig in der biomedizinischen Forschung auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und Chorea Huntington eingesetzt29,50. Da das Schwein ein relativ großes Gehirn mit einer Blutversorgung und immunologischen Reaktion besitzt, die denen des Menschen ähnelt, wurde es auch als Tiermodell für allogene Transplantationsexperimente verwendet51,52,53,54. Auch wenn die Netzhaut der Minischweine keine menschenähnliche Makula und Fovea besitzt, enthält sie die Area centralis und visuelle Streifen, das sind Regionen der Netzhaut mit einer hohen Konzentration von Zapfen-Photorezeptoren30. Die ähnliche Größe wie das menschliche Auge, das Vorhandensein einer mit Zapfen angereicherten zentralen Netzhaut, das gut beschriebene Immunsystem und das Vorhandensein von Methoden zur Beurteilung der Morphologie und Funktion nach der Operation sind wichtige Argumente für den Einsatz dieses Großtiermodells in der vorliegenden Studie.

Chirurgischer Eingriff
Unseres Wissens gibt es keine standardisierten und allgemein akzeptierten Operationstechniken für die vitreoretinale Transplantation von RPE-Zellen auf Trägern. Eines der Hauptprobleme der Zellersatztherapie ist die anspruchsvolle Operationstechnik, die ein Risiko für intra- und postoperative Komplikationen birgt, die mit Netzhautablösung, Hypotonie, episkleralen, choroidalen und/oder Netzhautblutungen und hoher intraokularer Turbulenz verbunden sind, die zu Gerüstschäden führen können. Postoperativ besteht das Risiko einer proliferativen Vitreoretinopathie, Endophthalmitis, Hypotonie, Netzhautablösung und Kataraktbildung 4,10,13,14,15.

Die ersten Studien zu Ansätzen mit Zellträgern wurden an Chinchilla-Bastardkaninchen durchgeführt13,16,25. Auch wenn es sich bei diesen Tieren um ein Kleintiermodell handelt, waren die Ergebnisse, die sich auf die technischen Aspekte der Operation konzentrierten, entscheidend für die Entwicklung der Verfahren in Großtiermodellen und werden daher im Folgenden zusammengefasst.

Zunächst wurde eine speziell angefertigte 23-G-Infusionskanüle mit zwei seitlichen Ports verwendet, um den Jetstream umzuleiten, was dazu beitrug, den Kollaps der Blase und die daraus resultierende Netzhautablösung zu beheben13. In der vorliegenden Studie konnten wir keinen solchen Kollaps der Bläsche feststellen. Der mögliche Grund dafür könnte die größere Größe des Augapfels und die Leistung der Kernvitrektomie mit geschontem Glaskörper an der Peripherie an der Kanüleninfusionsstelle sein, was die Kraft des gerichteten Jetstreams verringern könnte.

Schwierigkeiten beim Auswurf des Zellträgers aus dem Instrument waren ein weiteres intraoperatives Hindernis in den Kleintiermodellen, die als “mit dem Instrument gefangen” kategorisiert wurden. Darüber hinaus schlugen die Autoren vor, dass der auf der Netzhautoberfläche verbleibende Glaskörper nach der Implantation einen “Sprung” des Trägers aus der Retinotomieöffnung nach hinten verursachen könnte. Dieses Problem kann mit einer enzymgestützten Vitrektomie gelöst werden, die einen sanften, kontinuierlichen Auswurf des Zellträgers in den subretinalen Raum ermöglicht. In den meisten Fällen repositionierten die Autoren den Träger, um eine weiter entfernte Position des Implantats weg von der Retinotomie zu erhalten. In unserer Fallserie haben wir auch eine Situation erlebt, in der der Zellträger an der Spitze des Injektors befestigt blieb. Dies wurde jedoch durch langsame und sanfte Manipulation des Lichtleiters und der Spitze des Injektors erreicht. Wir beobachteten in keinem unserer Fälle einen Restglaskörper an der Stelle der Retinotomie. Die Verwendung von TA-assistiertem PPV in den Operationen kann als Methode vorgeschlagen werden, um das Risiko von resthaftem Glaskörper zu reduzieren. Eine mehrfache Färbung mit TA kann notwendig sein, um den darüber liegenden Glaskörper vollständig zu entfernen.

In einer anderen Studie wurden die Ergebnisse der subretinalen Implantation von humanen RPE-Stammzellen, die als polarisierte zelluläre Monoschicht auf einer Polyestermembran gezüchtet wurden, berichtet24. Während der Experimente wurde die gleiche zuvor beschriebene Operationstechnik verwendet13, jedoch wurde ein PPV-Ansatz mit zwei Ports angewendet. Schließlich wurde ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die subretinale Implantation von Zellträgeroperationen bei Kaninchen veröffentlicht25. Diese Studie bietet eine sehr detaillierte und leicht wiederholbare Beschreibung des chirurgischen Vorgehens, einschließlich präoperativer und postoperativer Versorgung, die ebenfalls auf früheren Erfahrungen basiert.

Bei der Verwendung von Großtiermodellen in nachfolgenden Studien wurden nicht nur technische Fragen behandelt, sondern auch Fragen zur Immunreaktion auf die transplantierten Zellen sowie Fragen zur Zellträgergröße. In einer Studie mit Cynomolgus-Affen (Macaca fascicularis) wurden die Ergebnisse der subretinalen Implantation von RPE-Monoschichten aus menschlichen Stammzellen beschrieben15. Alle Tiere wurden einer systemischen Immunsuppression unterzogen, die aus Sirolimus (Aufsättigungsdosis von 2 mg, Tagesdosis von 1 mg) und Tetracyclin (7,5 mg/kg-KG) bestand, die 7 Tage vor der Operation begann und 3 Monate nach der Operation andauerte. Der chirurgische Eingriff wurde gemäß den zuvor beschriebenen Protokollendurchgeführt 24,25. Die Autoren verwendeten einen 25-G-PPV-Ansatz mit drei Anschlüssen und Kronleuchter-Endobeleuchtung. Wichtig ist, dass eine TA-gestützte PVD verwendet wurde, um eine restliche vitreoretinale Adhäsion auf der hinteren Netzhaut auszuschließen. Als Ergänzung zum ursprünglich beschriebenen Verfahren entfernten die Autoren die Wirts-RPE-Schicht im Bereich der zukünftigen Implantation mit einem speziell angefertigten 20 G ausziehbaren Loop-Instrument.

In unserer Minipig-Studie haben wir auch eine systemische Immunsuppression eingesetzt. Die Art der Immunsuppression unterschied sich jedoch von der oben beschriebenen. Wir verabreichten eine subkutane Injektion von Tacrolimus-freisetzenden Polymermikrosphären als Depot in einer Dosis von 0,25 mg/kg KG, um die Abstoßung von Zelltransplantaten und Entzündungsreaktionen zu hemmen. Wir haben die RPE-Zellschicht des Wirts während der Operation nicht entfernt, da unser primäres Ziel darin bestand, die Sicherheit des Verfahrens und die Lebensfähigkeit der implantierten Zellen zu analysieren, nicht aber deren Integration in die Netzhaut des Wirts.

Zuvor wurde die Sicherheit und Durchführbarkeit der subretinalen Implantation einer Monoschicht aus hESC-abgeleiteten RPEs auf einer faltbaren, nicht abbaubaren, netzgestützten Submikron-Parylene-C-Membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm dick) an 14 weiblichen Yucatán-Minischweinen10 untersucht. Nach der Kultivierung wurden die Zellen auf eine netzgestützte Membran gesät. Die Immunsuppression erfolgte durch die systemische Verabreichung von Tacrolimus (kein Regime und keine Dosis indiziert) und intravitreale Injektionen von 0,7 mg eines Dexamethason-Implantats am Ende der Operation. PPV wurde mit einem 20 G-Ansatz durchgeführt. Die Autoren verwendeten eine intravitreale Injektion von Triamcinolonacetonid zur besseren Visualisierung des Glaskörpers. Die große Sklerotomie war 2 mm bis 3 mm groß. Nach der subretinalen Injektion wurde die Netzhaut mit einer temporären Injektion von Perfluorkohlenwasserstoffflüssigkeit abgeflacht. Nach dem Flüssigkeits-Luft-Austausch wurde eine Silikonöltamponade (1.000/5.000 cSt) durchgeführt. Die postoperative Versorgung umfasste die augenärztliche Anwendung von Dexamethason/Neomycin/Polymyxin B-Salbe 1 Woche nach der Operation. Die Autoren berichteten von einer Erfolgsrate von 91% (d.h. effiziente subretinale Implantation und ausreichende postoperative Bildgebungsdaten). In unserer Studie wurde die intravitreale Injektion von TA-Kristallen intraoperativ und hauptsächlich zur Visualisierung des Glaskörpers eingesetzt. Die lokale immunsuppressive Wirkung dieses Medikaments bleibt jedoch unklar. Die in unserer Studie verwendeten nanofaserigen Zellträger waren 5,2 mm x 2,1 mm groß, 3,7 μm dick und hatten Porengrößen von 0,4 μm. Während der Operation führten wir ein direktes Fax durch, anstatt eine Perfluorkohlenwasserstoffflüssigkeit zu injizieren. Unsere chirurgische Erfolgsrate (93,1%) entsprach der von Koss et al.10 und war etwas besser.

Die subretinale Transplantation von vollständig abbaubaren Zellträgern (Scaffold) zur subretinalen Implantation wurde erstmals 2019 an Yorkshire-Schweinenuntersucht 14. Die Studie konzentrierte sich hauptsächlich auf die biologisch abbaubaren Eigenschaften von Fibrin-Hydrogel-Implantaten. Die Autoren stellten fest, dass die aggressive Immunsuppression, die bei den Hausschweinen angewendet wird, eine lokale Entzündungsreaktion hemmen könnte, die möglicherweise während des biologischen Abbaus der Fibrin-Hydrogel-Implantate verursacht wird. Die immunsuppressive Therapie der Schweine wurde jedoch nicht spezifiziert. Während der PPV führten sie eine 3,6 mm lange Sklerotomie durch, um die subretinale Implantationsvorrichtung parallel und etwa 3,5 mm posterior des Limbus einzuführen. Darüber hinaus verwendeten sie ein pneumatisch angetriebenes Injektionssystem, das darauf abzielte, die durch Fingermanipulation verursachte Instabilität der Handplatzierung zu reduzieren. In unserer Fallserie waren alle Sklerotomien 2,5 mm bis 3,0 mm vom Limbus entfernt. Die große Sklerotomie zum Einsetzen des Injektors war 3 mm lang. Der in unserer Studie verwendete Implantationsinjektor wurde von Hand bedient. Eine gründliche Kauterisation der Pars plana des Ziliarkörpers und ein ausreichender Schnitt innerhalb der großen Sklerotomie scheinen entscheidend zu sein, um intraoperative Komplikationen wie iatrogene periphere Netzhautablösung, Blutungen und Verlust des Implantats zu vermeiden.

Zusammenfassend beschreiben wir die Verwendung des Liběchov-Minischweinmodells für die Transplantation von RPE-Zellen auf biologisch abbaubare Träger als Behandlungsoption für erbliche und erworbene Netzhauterkrankungen. Ähnlichkeiten in der Anatomie und Physiologie der Augen sowie in Bezug auf das Immunsystem ermöglichen es uns, die chirurgischen Techniken und Instrumente für die subretinale Implantation von Zellen zu entwickeln und zu verbessern, die sich leicht auf die Behandlung menschlicher Augenerkrankungen übertragen lassen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass Operationen an Minischweinen mit den gleichen Instrumenten (einschließlich der Implantationsverabreichungswerkzeuge) durchgeführt werden, wie sie in Humanoperationen eingesetzt werden, um die Anwendung der gewonnenen Erfahrungen und des Know-hows auf den Menschen zu erleichtern. Alternative großäugige Tiermodelle mit Makulaarealen, wie z.B. nicht-menschliche Primaten, könnten für die Nachverfolgung und Analyse der anatomischen und funktionellen Veränderungen nach subretinaler Implantation im zentralen Netzhautbereich nützlich sein. Die detaillierte Beschreibung der präoperativen, chirurgischen und postoperativen Versorgungsverfahren wird für zukünftige Studien nützlich sein, indem sie die effiziente und standardisierte Datengenerierung erhöht.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das Projekt wurde von der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (Projektnummer 18-04393S) und der Norway Grants and Technology Agency der Tschechischen Republik (Kappa-Programm, Projektnummer TO01000107) unterstützt.

Materials

Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 Mindray, Shenzhen, China Wato Ex-65 anesthesia machine
R-Evolution CR Optikon, Rome, Italy R-Evolution CR phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α Meridian, Thun, Switzerland Merilas 532α ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) Hi-R NEO 900A ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD Sony, Tokyo, Japan PMW-10MD full HD medical 2-piece 
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM Volk, Mentor, OH, USA MERLIN BIOM BIOM
Steam sterilizer Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL 3870 HSG sterilizer
iCam100 Optovue, Fremont, CA, USA iCAM100 funduscamera
iVue OCT100-2 Optovue, Fremont, CA, USA iVue OCT100-2 OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum Katena, New Jersey, US K1-5403 15mm blades
Ophthalmology surgical drape Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA 79304 132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) DORC, Zuidland, Netherlands 1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula DORC, Zuidland, Netherlands 1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up Surgical Specialties Corporation, Reading, USA 72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) DORC, Zuidland, Netherlands 1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe BBraun, Melsungen, Germany 4617022V 3ml
1ml soft-inject Tuberculin Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany 5010.200V0 1ml
8-0 Coated Vicryl Ethicon, Puerto Rico, USA J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml (FCI, Paris, France) S5.7170 1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga Synergetics, O'Fallon, USA 10.24.23PIN 23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps Alcon, Geneva, Switzerland 706.44 Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe  Synergetics, O’Fallon, USA 55.21.23
FCI Protect 2.0% FCI Ophthalmics, Paris, France S5.9100 viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 1-501 Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 2-100-1E 0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 2-504E 6mm
DK Needle Holder, Straigh Duckworth & Kent, Hertfordshire, England 3-201 9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.  UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic tropicamidum 10 mg/ml eye drops
Diprophos Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands betamethasonum 7 mg/ml 1ml
Alcon BSS Irrigation Solution Alcon, Geneva, Switzerland balance salt solution (BSS) 500ml
Betaisodona Mundipharma, Cambridge, United Kingdom povidon-Iodine 1g/10ml 30ml
Depo-medrol 120mg Pfizer, New Yourk, USA methylprednisolon 5ml/200mg
Shotapen Virbac Carros Cedex, France benzylpenicillin, dihydrostreptomycin 250ml
Flunixin a.u.v. Norbrook, Newry, Northern Ireland flunixinum 50,0 mg 250ml
Tramal 100MG/2ML Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland tramadol 2ml
Zoletil 100 Virbac Carros Cedex, France tiletamine, zolazepam 100mg
Narkeran 10 Vetoquinol, Magny-Vernois, France ketamin 2ml
Rometar 20mg/ml Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic xylazinum 20mg
Braunol 75mg/g B.Braun medical, Prague, Czech republic povidone iodine 75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland propofol 10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom isoflurane 100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml Unimed pharma, Bratislava, Slovakia oxybuprakaine 10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.  Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland fenylefrin chloride 10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate 5mg
Floxal ung. Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany ofloxacin 0.30%
Eficur inj.  Hipra, Amer, Spain ceftiofurum hydrochloridum  50mg / 1ml
Draxxin Zoetis Inc., New Jersey, USA tulathromycinum 100mg / 1ml
Tramal Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland tramadoli hydrochloridum 100mg / 2ml
Xylapan Vetoquinol, Magny-Vernois, France xylazinum 0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA Proparacaine hydrochlorid 0.50%
Prograf  Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA Tacrolimus powder 1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts Corning Inc., Kenneburg, ME, USA 353103
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher Scientific, MA, USA 12604021
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific, MA, USA 11320033
Biolaminin 521 LN (LN521) BioLamina, Sundbyberg, Sweden LN521-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific, MA, USA 35050061
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific, MA, USA J66742.0B
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA P4333
CRALBP Novus Biologicals, Abingdon, UK NB100-74392
Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Germany  21202
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Subretinal ImplantationRPEMinipigsAMDAge-related Macular DegenerationRPE Cell ReplacementCell CarrierSurgical TechniquePars Plana VitrectomyPosterior Vitreous DetachmentSubretinal Injection

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Lytvynchuk, L., Stranak, Z., Studenovska, H., Rais, D., Popelka, Š., Tichotová, L., Nemesh, Y., Kolesnikova, A., Nyshchuk, R., Brymová, A., Ellederová, Z., Čížková, J., Juhásová, J., Juhás, Š., Jendelová, P., Nagymihály, R., Kozak, I., Erceg, S., Binder, S., Müller, B., Stieger, K., Motlik, J., Petrovski, G., Ardan, T. Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care. J. Vis. Exp. (189), e63505, doi:10.3791/63505 (2022).
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