Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım

1. Koleksiyon hazırlama Caenorhabditis nematodlarını araştırmak için bir yer belirleyin.NOT: Çoğu ılıman bölgede, C. elegans ve C. briggsae tarım alanları veya kırsal ve kentsel bahçeler gibi insanla ilişkili habitatlardan kolayca izole edilebilir1. Subtropikal ve tropikal bölgelerde, C. briggsae, C. elegans ve C. tropicalis, yukarıda listelenen insanla ilişkili habitatlarda, bazen birbirine yakın yerlerde bulunabilir. Bununla birlikte, C. elegans tropik habitatlardaki diğer türlerden daha serin ve daha kuru habitatları tercih ediyor gibi görünmektedir7,8. Türlerin her biri, insanlarla ilişkili olmayan vahşi habitatlardan da izole edilebilir, ancak bu habitatlar daha az sıklıkla örneklenir. Mobil veri toplama uygulamalarıyla toplama ve yalıtım verilerini düzenlemek için bir Dayanak noktası projesi oluşturun. Ücretsiz eğitim sözleşmesini kullanarak Fulcrum ile çevrimiçi olarak bir hesap oluşturun16. APP EKLE düğmesine17 tıklayarak Nematod Alan Örnekleme uygulamasını bir Fulcrum hesabına ekleyin. Uygulama EKLE düğmesine18 tıklayarak Nematod İzolasyon uygulamasını bir hesaba ekleyin.NOT: Bir konuma yapılan her seyahatin, 2020FebruaryAustralia gibi ‘YearMonthLocation’ adlandırma kuralı kullanılarak toplama projesi olarak düzenlenmesi önerilir. Koleksiyon projesine erişim izni vermek için kullanıcıları Fulcrum hesabına ekleyin. Her kullanıcının projeye katılmak için Fulcrum mobil uygulamasını indirdiğinden emin olun. Mobil uygulama ile koleksiyonları (C etiketleri) ve nematod izolasyonlarını (S etiketleri) izlemek için bir dizi QR kodu etiketi yazdırın. C etiketlerini fermuarlı plastik torbalara takın, etiketli torbaları 25’li gruplar halinde yuvarlayın ve paketleme için lastik bir bantla sarın. Laboratuvarda kullanılmak üzere S-etiket setini saklayın.NOT: Bu protokol boyunca, koleksiyonlar (sahadan alınan alt tabakalar) torbalarda veya plakalarda bulunur ve C etiketleriyle etiketlenir. İzole nematodlar S-etiketleri ile etiketlenmiştir. C etiketleri benzersiz koleksiyonları tanımlamak için kullanılır ve S-etiketleri benzersiz nematod izolatlarını tanımlamak için kullanılır. Bu iki etiket türü, belirli bir koleksiyon (C-etiketi) ile Fulcrum veritabanındaki bu koleksiyondan yalıtılmış nematodlar (S-etiketleri) arasındaki bağlantıyı kurmak için kullanılır. Bir koleksiyon projesi için C etiketleri olarak iki kat daha fazla S-etiketi yazdırın, çünkü koleksiyon başına ortalama iki nematod izole edilir. Gerekirse daha sonra daha fazla S-etiketi yazdırılabilir. Ekte 2.500 benzersiz C etiketi (Ek Dosya 1) ve 5.000 benzersiz S etiketi (Ek Dosya 2) verilmiştir. Koleksiyonlar için 10 cm NGMA plakaları ve nematodları izole etmek için 3,5 cm NGMA plakaları hazırlayın. Koleksiyon başına bir adet 10 cm’lik plaka ve en az iki adet 3,5 cm’lik plaka yapın21. Bu plakalar, belirlenmiş protokolleri takiben Escherichia coli suşu OP50 ile tohumlanır. Kullanmadan önce plakaları 4 ° C’de en fazla 1 ay saklayın. 2. Alan koleksiyonu NOT: Caenorhabditis nematodları çoğunlukla meyveler, fındıklar, tohumlar, baklalar, çiçekler, saplar, bitkisel çöpler ve kompostlar dahil olmak üzere çürüyen bitkisel maddelerden izole edilir1,5,6,8. En iyi substratlar çürümüş ve meyve veya çiçek olarak neredeyse tanınamaz; Çok kuru veya ıslak olan yüzeylerden kaçının (Şekil 1). Substratlar, çiftler halinde çalışarak sahadan en verimli şekilde toplanır. Temassız kızılötesi termometreye sahip olan kişi, toplama için bir substrat seçecek ve numuneyi toplarken, ortakları toplama verilerini kaydetmek için Fulcrum’daki Nematod Alan Örneklemesi uygulamasını kullanacaktır. Kollektör çifti, istenen sayıda numune toplanana kadar bu işlemi tekrarlayacaktır. Saha çalışması için gerekli malzemelerin listesi (Ek Tablo 1)’de bulunmaktadır. Fulcrum mobil uygulamasını açın, açılır menüden Nematod Field Sampling öğesini seçin. Projede yeni bir kayıt başlatmak için + tuşuna basın (Şekil 2A). Alt tabakanın fotoğrafını çekin. Adım 1.2’de yapılan doğru toplama projesini seçmek için üst ortadaki kutuya tıklayın (Şekil 2B). Koleksiyon kaydının altındaki C etiketi alanına dokunun ve istem göründüğünde Tara’yı seçin. Mobil cihaz kamerasını kullanarak toplama çantasındaki barkodu tarayın , ardından ekranın sağ üst köşesindeki Bitti’ye dokunun. Alt tabaka alanına dokunun ve açılır menüden bir alt tabaka türü seçin. Alt Tabaka Notları alanına dokunup notları el ile girerek alt tabaka hakkında notlar ekleyin. Açılır menüden bir manzara seçin. Örnekleme alanını en iyi temsil eden manzarayı seçin. Bir gökyüzü görünümü seçin. Gökyüzü görünümünü seçerken, örnekleme alanındaki gökyüzü görünürlüğünü açıklayın (örneğin; Ağaçlardan veya diğer yapılardan engellenmiş görünümler olmadan tam gökyüzü görünümü = tam). Temassız termometreyi kullanarak substratın yüzey sıcaklığını ölçün ve substrat sıcaklık alanındaki değeri kaydedin.NOT: Sıcaklığı kaydederken temassız termometreyi alt tabakadan en fazla 14 inç uzakta tutun. El tipi cihaz ile ortam sıcaklığını ve nemini ölçün ve bu verileri uygun alanlara kaydedin.NOT: Ortam sıcaklığı ve nem cihazının Beklemede olmadığını kontrol edin. Ölçü birimi, düğme serbest bırakıldığında değişecektir. Düzensiz okumaları önlemek için cihazı dış cebinde tutun. Ekranın sol üst köşesindeki Kaydet’e dokunarak kaydı Dayanak Noktası’na kaydedin. Substratı almak için bir “eldiven” olarak kullanmak üzere toplama torbasını ters çevirerek çubuklar veya diğer sert parçalar olmadan substratın yaklaşık bir çorba kaşığı toplayın, ardından torbayı kapatın. Numune özellikle nemliyse torbaya bir kağıt havlu koyun.NOT: Sıcak iklimlerde, koleksiyonları serin tutmak için torbaları soğutucu paketlere sahip yumuşak soğutuculara yerleştirin. Tüm numuneler gün boyunca toplandıktan sonra, toplama ekipmanını temizleyin, pilleri problardan çıkarın, pilleri şarj edin, dondurucu paketlerini yeniden dondurun. Nematod Field Sampling uygulamasının sol üst köşesindeki Sync düğmesine dokunarak Fulcrum toplama verilerini senkronize edin.NOT: Yüklemeler güçlü bir hücresel bağlantı olmadan birkaç dakika sürebilir, bu nedenle WiFi erişimini beklemek en iyisi olabilir. Veriler mobil cihazlarda kalır ve bulutla senkronize edilir. Numuneleri bir gecede nakliye kutusuna yerleştirerek bir ev kurumuna gönderin. Yüklerin taşındığı günlerde paketler göndererek numunelerin 11 °C’nin altındaki veya 25 °C’nin üzerindeki sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirin.NOT: Çoğu nakliye tesisi, uzak yerlerde hafta sonları bir gecede kargo göndermez. 3. Laboratuvarda saha koleksiyonlarının kaplanması NOT: Bu bölümde, numunelerin etiketli toplama torbalarından etiketli plakalara aktarımının nasıl organize edileceği açıklanmaktadır. Numuneler bir gecede yapılan bir gönderiden veya doğrudan sahadan gelebilir. Koleksiyonların gönderisini alın ve kırık torbalar veya diğer hasar kanıtları için kontrol edin. Torbalar kırılırsa, malzemeyi atın ve kırılmamış toplama torbalarını% 70 etanol ile temizleyin; Etanol içeren torbadaki C etiketinden kaçının, çünkü etiketin rengini değiştirir ve okunmasını zorlaştırır. Her fermuarlı torba için, torbanın üzerindeki C etiketini not edin ve OP50 bakterileriyle lekelenmiş 10 cm’lik bir plakanın kapağına eşleşen bir C etiketi takın.NOT: Etiketli 10 cm’lik plakalar, protokolün geri kalanı için ‘C-plakaları’ olarak adlandırılır. Numuneleri organize etmenin en kolay yolu, toplama torbalarını üstte eşleşen C-plakası bulunan bir laboratuvar tezgahına yerleştirmektir (Şekil 3). Her koleksiyon için, temiz bir plastik kaşık kullanarak toplama torbasından C plakasına yaklaşık bir çorba kaşığı numune aktarın. Numuneyi bakteri çiminin etrafına hilal veya halka şeklinde ekleyin, bakteri çimini tamamen örtmeyin (Şekil 4).NOT: Yemek kaşığı, kullanılmadığı zamanlarda etanollük bir beherin içine koyarak temiz tutun. Ek numuneleri aktarmadan önce çorba kaşığı kurutmak için bir kağıt havlu kullanın. Koleksiyonların toplama torbalarından C plakalarına aktarıldığı zamanı kaydedin ve bölüm 4’teki nematodları izole etmeye çalışmadan önce C plakalarını oda sıcaklığında (RT) en az 24 saat tutun. 4. Nematodların koleksiyonlardan izole edilmesi Mobil cihazda Fulcrum uygulamasını açın ve uygulama menüsünden Nematod İzolasyonu’nu seçin (Şekil 5A). Sağ alttaki + simgesine dokunarak yeni bir yalıtım kaydı yapın (Şekil 5B). Yeni yalıtım kaydı ekranında, üst ortadaki kutuda görüntülenen proje adını işaretleyerek doğru toplama projesini onaylayın. Yanlış proje görüntülenirse, doğru projeye geçmek için proje adına dokunun (Şekil 5C). Nematodların izole edildiği örnekle ilişkili C etiketini bulmak için C-label alanının altındaki Seç düğmesine dokunun (Şekil 5D). Ara simgesine dokunun, ardından C plakasındaki C etiketli QR kodunu cihaz kamerasıyla taramak için Tara simgesine dokunun. QR kodu tarandıktan sonra, C etiketi alanında bir C etiketi kaydı görünür. Cihaz kamerasını açmak için Fotoğraflar alanındaki Kamera simgesine dokunun ve QR kodu görünür durumdayken C plakasındaki numunenin fotoğrafını çekmek için kullanın (Şekil 5E). İzolasyon ekranına dönmek için Bitti’ye dokunun.NOT: Bu yalıtım kaydı fotoğrafları, alt tabakanın belirli özniteliklerini daha sonra keşfetmek için kullanılabilir. C-plakasındaki nematodları aramak için diseksiyon mikroskobu kullanın. Numune üzerindeki nematodların varlığını kaydetmek için Worms on Sample alanına dokunun (Şekil 5F). C plakasında nematodlar varsa Evet’e , nematod yoksa Hayır’a dokunun. Yalnızca nematod izleri varsa İzler’e dokunun. Nematodlar yoksa, C plakasını parafilm haline getirin ve biyolojik tehlike kutusuna atın.NOT: C plakasını biyolojik tehlike atık kutusunun üzerine ters çevirin ve numune alınan tüm substratları yerinden çıkarmak için plakanın arkasına hafifçe dokunun. Bu adım, C plakasındaki substratın altında bulunabilecek nematodları bulmayı ve izole etmeyi kolaylaştırır. Nematodlar varsa, C plakasından beş adede kadar nematodu izole edin. Bir nematodu izole etmek için, bir platin tel toplama kullanarak bir nematodu C plakasından bir S plakasına aktarın. Mümkünse sağlıklı, gravid yetişkinleri izole edin. Bununla birlikte, yetişkinler bulunmazsa diğer aşamaları izole edin.NOT: İzolasyondan sonra, en fazla beş S-plakasının her birinde tek bir nematod bulunacaktır. Bu S-plakalarını aynı C-plakasından izole nematodlarla birlikte, Dayanak Noktasına girene kadar diğer S-plakalarından uzakta düzgün bir yığın halinde birlikte organize edilmiş halde tutun. Bu yalıtım için kullanılan S plakalarını girmek için S etiketli Plakalar alanına dokunun. Sağ alttaki + işaretine dokunun. S-etiketine dokunun ve ardından cihaz kamerasını açmak için Tara’ya tıklayın. S plakasındaki S-label QR kodunu taramak için cihaz kamerasını kullanın.NOT: S-label kodunun plaka üzerindeki kodla eşleştiğinden emin olun. Eşleşirse, Bitti’ye dokunun. Eşleşmezse , İptal’e dokunun ve eşleşene kadar yeniden tarayın, ardından Bitti’ye tıklayın. Bazen yakındaki plakaların QR kodları yanlışlıkla taranır. Her bir S-plakasını girdikten sonra, girişi sağ üstteki Kaydet düğmesiyle kaydedin. Giriş kaydedilmezse kaybolur. C plakasından izole edilen tüm nematodlar girilene kadar gerekirse daha fazla S etiketli plaka eklemek için sağ alttaki + işaretine dokunun. İzolasyon kaydı için tüm S etiketli plakaları ekledikten sonra, izolasyon kaydı ekranına geri dönmek için sol üstteki < düğmesine dokunun.NOT: Hatalar çözülemediği için bir yalıtım kaydını iptal etmek için sol üstteki İptal’e tıklayın. Bu adım, kaydın kaydedilmeden atılıp atılamayacağını soran bir iletişim kutusu açar. İsterseniz, Evet, At’a tıklayın. İzolasyon kaydında tüm bilgiler doğru şekilde eklendikten sonra sağ üstteki Kaydet düğmesine dokunun. Daha sonra S-plakalarını izole nematodlarla parafilm haline getirin ve bunları nematodlarla S-plakalarını tutmak için belirlenmiş bir alana koyun. C plakasını parafilm haline getirin ve biyolojik tehlike kutusuna atın. Tüm verileri Fulcrum’a yüklemek için Senkronize Et simgesine dokunun. Tüm S plakalarını alfasayısal düzende sıralayın, sonra S plakalarını karton kutulara yerleştirin. S plakalarının kapak tarafı aşağı ve parafilme alındığından emin olun. Dört adede kadar S plakasını kutuda tek bir konuma yerleştirin ve karton kutuyu proje adı, tarih, saat ve benzersiz bir kutu numarasıyla etiketleyin. Etiketli kutuları RT’de saklayın. Bu izolatlar proliferasyon açısından 48 saatte ve gerekirse tekrar 168 saatte kontrol edilecektir. 5. Fulcrum’dan S-plakalarının dışa aktarılması NOT: Bu bölümde, yalıtım işleminde kullanılan S etiketlerinin Fulcrum proje veritabanından nasıl dışa aktarılacağı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu S-etiketleri, bölüm 6-9’da sekans kimliği ile tanımlanırken çoğalan izodişi çizgileri izlemek için kullanılacaktır. Fulcrum web sitesinde oturum açın ve Nematod İzolasyonu uygulamasını seçin. Ekranın sol tarafındaki Dışa Aktarıcı’ya tıklayın. İstediğiniz projeyi seçmek için tıklatın ve Nematod İzolasyonu kutusunu işaretleyin. ‘.zip’ dosyasını içeren bir nematode_isolation_s_labeled_plates.csv dosyası indirmek için İleri’yi tıklayın. ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ dosyasını açın ve artan düzende ‘S-etiketi’ sütununa göre sıralayın (en küçük S-etiketi üstte olacaktır). Tüm S etiketlerini seçin ve e-tablodan kopyalayın. Bir web tarayıcısı kullanarak vahşi soyat genotipleme şablonu google sayfasına (wild_isolate_genotyping_template) gidin19. Genotyping Template (Genotipleme Şablonu) sekmesini sağ tıklayıp Yeni E-tabloya Kopyala seçeneğini belirleyerek bu google sayfasının bir kopyasını oluşturun. Yeni google sayfasını görüntülemek için E-Tabloyu Aç’ı seçin. Bu yeni sayfaya, dayanak noktası proje adının ardından ‘wild_isolate_genotyping’ (ör. “2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping) ile ad verin.NOT: Bu sayfa, protokolün geri kalanında ‘genotipleme sayfası’ olarak adlandırılır. ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ ‘s_label’ sütunundan kopyalanan S etiketlerini, ‘s_label’ başlıklı genotipleme sayfası sütununa yapıştırın. ‘1’ler için ‘s_label_repeat_error’ sütununu kontrol edin. Bu sütundaki ‘1’ değeri, S-etiketinin genotipleme sayfasında bir yerde çoğaltıldığı anlamına gelir. Çoğaltmalar keşfedilirse, ilerlemeden önce bunları araştırın ve düzeltin. Tüm S etiketleri için genotipleme sayfası ‘isolation_box_number’ sütununu doldurun. 6. S plakalarında çoğalma olup olmadığını kontrol edin İzolasyondan 48 saat sonra S plakalarında çoğalan hayvanları kontrol edin (zamanlamayı yönlendirmek için 4.11 adımındaki kutudaki son izolasyonun tarihini ve saatini kullanın).NOT: Çoğalan nematodlar, S plakasındaki yavrularla karakterize edilir. Bir S-plakası çoğalıyorsa, genotipleme sayfasındaki proliferation_48 sütununa ‘1’ girin, sonra S-plakasını ’48 saat çoğalma, kutu 1′ etiketli bir kutuya taşıyın. Bir çoğaltma kutusuna maksimum 88 S plakası yerleştirin, ardından ’48 saat çoğalma, kutu 2′ etiketli yeni bir kutu doldurmaya başlayın. S etiketlerinin 48 saatlik çoğalma kutularında alfasayısal sırayla düzenlendiğinden emin olun.NOT: Çoğalmayan S plakalarını atmayın; Bu plakalar izolasyon sonrası saat 168’de tekrar kontrol edilecektir. İsterseniz, bu S plakalarını ’48 saat çoğalmaz, X kutusu’ etiketli kutularda sayısal sırayla birleştirin, ancak yeni kutuda 168 saat denetiminin gerçekleşmesi gerektiğinde kaydetmeyi unutmayın. 48 saatte çoğalan tüm S-etiketlerini belirledikten sonra, 48 saatte çoğalan S-plakaları için bölüm 7’ye geçin. İzolasyon sonrası 48 saatte çoğalmayan S plakalarını izolasyon sonrası 168 saatte tekrar kontrol edin. Bir S-plakası şimdi çoğalıyorsa, genotipleme sayfasındaki proliferation_168 sütununa ‘1’ girin ve ardından S-plakasını ‘168 saat çoğalma, kutu 1’ etiketli bir kutuya taşıyın. Bir çoğaltma kutusuna maksimum 88 S plakası yerleştirin, ardından ‘168 saat çoğalma, kutu 2’ etiketli yeni bir kutu doldurmaya başlayın. S etiketlerini 168 saatlik çoğalma kutularında alfasayısal sırada düzenlediğinizden emin olun. 168 saat sonra çoğalmayan S plakalarını atın. 168 saatte çoğalan S-plakaları için bölüm 7’ye geçin. 7. İzodişi çizgilerin lizisi NOT: Bu adım, çoğaltma kutularındaki S plakaları için lizis çalışma sayfalarının yazdırılmasına yardımcı olmak üzere google sayfalardaki veri filtresi aracını kullanır. Lizis çalışma sayfalarının amacı, personele tezgahtaki lizis şeridi tüplerinde S-etiketleri için doğru pozisyonları sağlamaktır. İstediğiniz proje için genotipleme sayfasını açın ve Cmd+A yazarak tüm hücreleri seçin. Her sütun başlığına bir filtre düğmesi eklemek için Veri > Filtre Oluştur’a tıklayın. Yalnızca genotiplendirilecek S-plakalarını görüntülemek için Filtre düğmelerini kullanın. Örneğin, 48 saatte çoğalan tüm S plakaları lize edilecekse: ‘proliferation_48’ sütunundaki Filtre düğmesine tıklayın ve ‘1’i seçin. Genotipleme google sayfası filtrelendikten sonra, çalışma sayfasına yazdırılacak S-etiketleri olduklarından emin olmak için görüntülenen S etiketlerinin listesini gözden geçirin. Genotyping google sayfasının ‘strip_tube_number’ sütununa, her 11 satırda bir benzersiz bir sayı girin. Bir projenin şerit tüp numaralarını 1’den başlayarak ve hiçbir zaman çoğaltılmamış olarak ardışık sırayla girin. “strip_tube_position”, her şerit tüp numarası için 2 ile 12 arasında girin.NOT: Lizis için 12 tüplü şerit tüpler kullanın. İlk pozisyon (strip_tube_position 1) kontrol olacaktır, ancak kontroller lizis çalışma sayfalarına eklenmez (yalnızca strip_tube_positions eklenir, 2-12). Lizis sırasında, pozitif kontrol suşu ‘N2’, pozitif bir kontrol olarak her çift numaralı şerit tüpünün 1. konumuna eklenecektir. Her tek numaralı şerit tüpünün 1. konumuna negatif kontrol olarak solucan eklenmez. Genotipleme google sayfasını daha fazla filtreleyerek yalnızca S-etiketlerini lize edilecek bir çoğalma kutusuna ekleyin, ardından ‘s_label’ ile ‘lysis_notes’ sütunlarını seçin. Lize edilecek her çoğalma kutusu için bir lizis çalışma sayfası yazdırın. Print (Yazdır) alanındaki açılır menüye tıklayın ve Selected Cells (Seçili Hücreler) öğesini seçin. Sağ üstteki İleri’ye tıklayın, ardından çoğaltma kutusunun lizis çalışma sayfasını yazdırmak için iletişim kutusunu kullanın. Her çoğaltma kutusu için bir lysis çalışma sayfası yazdırmak üzere 7.3-7.5 arasındaki adımları yineleyin.NOT: Her proliferasyon kutusu, sekiz adet 12 delikli şerit tüpüne karşılık gelen 88 adede kadar S plakası tutar. Lize edilecek tüm numuneler için 12 delikli şerit tüpler hazırlayın. Bir şerit tüpünü, lizis çalışma sayfasında atanmış benzersiz bir ‘strip_tube_number’ ile etiketleyin. Bu etiket, ayrıldıklarında karışıklığı önlemek için kapak şeridine ve şerit tüpüne yazılmalıdır. EVEN şerit tüpleri, 1. konumda pozitif bir kontrole (N2 solucanları) sahiptir. ODD şerit tüpleri, 1. konumda negatif bir kontrole (solucan yok) sahiptir. Tüm numuneler için yeterli lizis tamponu (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.2, 5 mM MgCl2, %0.9 IGEPAL, %0.9 Ara 20, 0.4 mg/mL’lik son konsantrasyona proteinaz K eklenmiş %0.02 jelatin) oluşturun ve pipet hatası için %5 ekstra ilave ekleyin. Gerektiği gibi ölçeklendirin.NOT: Lizis tamponu, proteinaz K hariç tüm bileşenlerin birleştirilmesi ve -20 °C’de 10-50 mL alikotlarda dondurulmasıyla en iyi şekilde hazırlanır. Alikotları çözün ve kullanmadan önce 4 ° C’de tutun; Kullanmadan hemen önce, proteinaz K ekleyin ve iyice karıştırın. Çalışırken lizis tamponunu buz üzerinde tutun. Basılı lizis çalışma sayfasını kılavuz olarak kullanarak belirli bir şerit tüp için S plakalarını düzenleyin. Bir şerit tüpün kapağını açın ve tekrarlanan bir pipetleyici ile her kapağa 8 μL lizis tamponu ekleyin. Lizis tamponunu bir seferde bir kapak şeridine ekleyin, çünkü lizis tamponu RT’de bırakılırsa ve açıkta bırakılırsa buharlaşır. Kaynak plakalardan (pozitif kontroller için S-plakası veya N2 stok plakası) 3-5 hayvanı lizis çalışma sayfasında belirtilen uygun kapak konumlarına seçin. Lizis çalışma sayfasının lysis_notes bölümünde lizise 5’ten az solucan eklenmiş herhangi bir S plakası için notları kaydedin. Nematodları şerit tüpünün her bir konumuna yükledikten sonra, kapak şeridini tekrar şerit tüpüne yerleştirin. İşaretli kapağı (konum 1) işaretli tüple (konum 1) eşleştirin. Kapatıldıktan sonra, nematodlar tüpün dibinde olana kadar şerit tüpünü kısa bir süre santrifüj edin. Şeridi tamamen donana kadar (en az 10 dakika) -80 °C dondurucuya yerleştirin. Tüm şeritlerde lizis için nematodlar eklenene kadar 7,9 ile 7,11 arasındaki adımları tekrarlayın. Tüp şeritlerini sayısal sırayla düzenleyin. Şerit tüp setlerini çıkarın ve lizis programını bir termosikletörde çalıştırın: 60 ° C’de 1 saat, 95 ° C’de 15 dakika, 12 ° C’de tutun. Lizis programı tamamlandığında, numuneleri RT’de 15 s için 300 x g’da döndürün ve lizatları 1 haftaya kadar -80 ° C’de saklayın. 96 delikli plaka tutucuları kullanarak tüp şeritlerini sayısal sırayla düzenleyin ve çoğalma kutusu numarası, şerit tüp numarası aralığı, tarih ve araştırmacının baş harflerini içeren bir etiket ekleyin. ‘lysis_date’ ve ‘lysis_notes’ genotipleme sayfası sütunlarını lizis çalışma sayfasındaki bilgilerle güncelleyin. 8. SSU ve ITS2 dizilerinin PCR’si NOT: Bu bölümde, her lize S-plakası için iki ayrı PCR’nin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin talimatlar sağlanacaktır. İlk astar seti, 18S rDNA küçük alt birim geninin (SSU) 500-bp fragmanını güçlendirir; oECA1271 = ileri astar TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = ters primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12. Bu PCR, şablon DNA’nın kalitesini kontrol etmek için kullanılır. PCR, neredeyse tüm nematod türleri için SSU bölgesini güçlendirir. SSU PCR yükseltemezse, bu sonuç lizis kalitesinin düşük olduğunu ve lizisin bu S-plakası için tekrarlanması gerektiğini düşündürmektedir. İkinci astar seti, 5.8S ve 28S rDNA genleri (ITS2) arasındaki dahili transkribe edilmiş ara parça bölgesinin 2.000-bp fragmanını güçlendirir; oECA1687 = ileri astar CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = ters primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. ITS2 PCR ürünü Sanger’ın sıralandığı ve sekans, Caenorhabditis cinsindeki nematodları dizi benzerliği ile tür seviyesine tanımlamak için kullanılır. Genotipleme sayfasındaki filtreleme aracını kullanarak yalnızca PCR için kullanılacak S-etiketlerini görüntüleyin. pcr_plate_number güncelleştirin ve genotipleme sayfasındaki sütunları pcr_well. Lizis malzemesinin bozulmasını önlemek için, SSU ve ITS2 PCR’ler aynı anda çalıştırılır. ITS2 ve SSU PCR’ler için ayrı plakalarda ayrı reaksiyonlar olsa bile aynı pcr_plate_number kullanın. ‘SSU’ veya ‘ITS2’ etiketleriyle ayırt edilecekler. Sekiz veya daha az şerit tüpe bir pcr_plate_number atayın (96 delikli PCR plakasının sırası başına bir şerit tüpü, artan düzende düzenlenmiş, örneğin, üstteki en düşük şerit tüp numarası). Ardından, şerit tüplerindeki her bir S-etiketine bir pcr_plate_well atayın.NOT: Şerit tüpler, A satırına atanan en düşük şerit tüp numarası ve H satırındaki en yüksek sayı ile artan düzende düzenlenmiştir. Bu nedenle, 1 numaralı şerit tüpü, pozisyon 1, PCR plaka numarası 1, kuyu A01’e atanacaktır. PCR için kullanılacak numuneleri yerleştirmek için 96 delikli PCR plakalarını etiketleyin. Her PCR plakasını aşağıdaki bilgilerle etiketleyin: proje adı, PCR tipi, PCR plaka numarası ve PCR tarihi (örneğin, 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Ayrıca, plakayı her sıraya yüklenecek şerit tüp numaralarıyla etiketleyin. Lizis malzemesini -80 °C dondurucudan çıkarın ve lizis malzemesini içeren şerit tüpleri buz üzerinde çözün. Lizis malzemesi çözülürken, ITS2 ve SSU master karışımlarını buz üzerinde ayrı tüplerde hazırlayın. SSU ve ITS2 PCR tarifleri Ek Tablo 2’de bulunur.NOT: Pipetleme hatasına izin vermek için her 96 delikli plaka için 100 reaksiyonluk PCR ana karışımı hazırlayın. Büyük hacimler kullanılacaksa ana karışımı tutmak için 15 mL veya 50 mL konik kullanın. Vortex ana karışımı, Taq karışım boyunca dağıtılana kadar nazikçe karıştırın. Karıştırıldıktan sonra, ana maddenin aliquot 38 μL’si buz üzerindeki PCR plakalarının uygun kuyucuklarına karışır. Ana karışımı PCR plakalarına aktarmak için steril tek kullanımlık v tabanlı oluklar ve 12 delikli çok kanallı pipet kullanın. Lizis malzemesini kapaklardan çıkarmak için çözülmüş lizis şeridi tüplerini aşağı doğru döndürün. İlk PCR plakasına yüklenecek tüm şerit tüplerin kapaklarını dikkatlice çıkarın. PCR plakasındaki uygun kuyucuğa 2 μL lizat eklemek için düşük hacimli çok kanallı pipet (12 delikli veya 8 delikli) kullanın. 2 μL’yi çıkarmadan önce lizatı bir kez yukarı ve aşağı yavaşça pipetleyin.NOT: Aktarımdan önce lizis içerdiklerinden emin olmak için ipuçlarını kontrol edin. İpuçlarını satırlar veya sütunlar arasında değiştirmeyi unutmayın. PCR plakasını PCR yapışkan folyo ile örtün ve sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için bir rulo kullanın. Folyo uygulandıktan sonra, PCR plakalarını bir santrifüjde kısaca döndürün. Termosiklette çalışmaya hazır olana kadar plakayı buz üzerinde tutun. PCR’leri uygun termosikler programı ile çalıştırın. SSU ve ITS2 PCR programlarının ayrıntıları için Ek Tablo 2’ye bakın. Tüm PCR’ler çalıştırılana kadar 8.4- 8.8 arasındaki adımları yineleyin. PCR reaksiyonları devam ederken, 100 mL% 1.5 agaroz jeli dökün. Her jel numuneleri veya tek bir PCR plakasını tutacaktır. 500 mL’lik bir şişeye 1,5 g agaroz ekleyin, ardından 100 mL 1x TAE tamponu ekleyin (Ek Tablo 3) ve karıştırmak için girdap yapın. Jeli çözmek ve soğutmak için mikrodalga. Çözelti soğutulduktan sonra, 5 μL 10 mg / mL ethidyum bromür çözeltisi ekleyin ve birleştirmek için karıştırın. Çözeltiyi dört adet 25 delikli taraklı bir döküm tepsisine dökün, böylece jel 96 numune ve jeldeki her sıra için bir merdiven barındırabilir.NOT: Ethidium bromür güçlü bir mutajendir. Ethidium bromür kullanırken, bir laboratuvar önlüğü, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal güvenlik gözlükleri kullanın. PCR bitmeden hemen önce, tek kullanımlık bir oluğa 6x yükleme boyası ekleyin ve yeni 96 delikli PCR plakasının her bir kuyucuğuna 2 μL 6x yükleme boyası eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Bu plaka, numuneleri jele yüklemek için kullanılacaktır. Tüm örnekleri barındırmak için bu plakalardan yeterince yapın. PCR’ler tamamlandığında, PCR plakalarını çıkarın ve RT’de 15 s için 300 x g’de kısaca santrifüj yapın. PCR plakalarını PCR ürünleri bir jel üzerinde tükenene kadar buz üzerinde saklayın. Ürünleri bir jel üzerinde çalıştırmak için, 2 μL 6x yükleme boyası içeren 96 delikli bir plakanın uygun kuyucuğuna her numunenin 5 μL’sini eklemek için 12 delikli çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra bu karışımın 6 μL’sini yakın zamanda dökülmüş bir jelin her bir kuyucuğuna yükleyin. Jelin her sırasının ilk kuyucuğuna 6 μL 1 KB artı merdiven yükleyin.NOT: Jelin kuyucuklarını doldurmak için, jelin ilk sırasındaki PCR plakasından A ve B Sırasının serpiştirilmesi gerekebilir. Karışıklığı önlemek için, gel_number ve gel_position her PCR örneği için genotipleme sayfasına kaydedin. Plakalarda kalan PCR’ye yeni bir folyo kapağı yerleştirin ve bunları 4 ° C’de saklayın. Bu reaksiyon ürünleri, adım 9’da sıralama için kullanılacaktır. PCR ürünlerini jel üzerinde 120 V’ta 20 dakika boyunca çalıştırın. Jeli görüntüleyin ve genotipleme sayfasının ‘pcr_product_its2’ ve ‘prc_product_ssu’ sütunlarına hangi S-etiketlerinin ITS2 ve / veya SSU PCR ürünleri verdiğini kaydedin. Bir grubun varlığını ‘1’ ile işaretleyin; bant yok için ‘0’ işaretini işaretleyin. 9. Nematodların Sanger dizilimi ve dizi PATLAMASI ile tanımlanması NOT: Bu bölümde, ITS2 amplikonlarının S-etiketlerinden sıralanması, BLAST algoritmasının kullanılarak bu dizilerin Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) veritabanına hizalanması ve S-plakalarındaki nematodları tanımlamak için BLAST sonuçlarının ayrıştırılması için talimatlar sağlanmaktadır. ITS2 pozitif olan her numune için, ileri astar oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC) kullanarak Sanger dizilimi için kalan ITS2 PCR ürününü kullanın. Genotipleme sayfasına her S-etiketinin ‘sequencing_plate’ ve ‘sequencing_well’ sütunlarını kaydederek sıralama çıktı dosyalarının bir S-etiketine kolayca bağlanmasını sağlayın. Sıralama platformundan her S-etiketi için .seq çıktı dosyalarını edinin. Bir projenin .seq dosyalarını, alt dizinlerde bulunan her sıralama toplu işlemi için .seq dosyalarıyla tek bir dizinde düzenleyin. Komut satırı arabirim aracını açın ve şu komutu girerek .seq dosyalarını içeren üst dizine gidin: cd . Zaten mevcut değilse, aşağıdaki komutu girerek tüm .seq dosyaları için birleştirilmiş bir FASTA oluşturun: dir in */; do cd $dir; for file in *.seq; do echo “>”$file; cat $file; done >>.. /all_seqs.fa; cd ..; bitti.Not: Bu kod, proje dizinindeki tüm .seq dosyalarından ‘all_seqs.fa’ adlı birleştirilmiş bir FASTA dosyası oluşturur. Bu dosya, NCBI çevrimiçi nükleotid BLAST aracında, her bir S-etiketinin ITS2 dizisini NCBI’nin dizi veritabanına hızlı bir şekilde hizalamak için kullanılabilir. Bir web tarayıcısında, NBCI BLAST websitesine20 gidin ve Dosya Seç düğmesine tıklayın. Yeni oluşturulan all_seqs.fa dosyasını seçin, ardından Biraz Benzer Diziler (BLASTn) düğmesine tıklayın. BLAST aramasına başlamak için sayfanın altındaki BLAST düğmesine tıklayın. Genotipleme sayfasını her S-etiketi için BLAST sonuçlarıyla güncelleştirin. Genotyping google sayfasını güncellemeyi kolaylaştırmak için filtre aracını kullanın. Her sütun başlığına bir filtre düğmesi eklemek için Veri > Filtre Oluştur’a tıklayın. BLAST sonuçlarıyla güncelleştirilecek sıralama plakalarını seçmek için sequencing_plate sütununu filtreleyin. Her bir S-plate ITS2 dizisinin sonuçlarını kontrol etmek için NCBI BLAST sonuçları sayfasındaki açılır menüyü kullanın (Şekil 6). BLAST isabeti olup olmadığını kontrol edin. * önekli açılır menüdeki bir dizi kimliğinin patlama isabeti yoktur. Bu S etiketleri için, genotipleme sayfasının geçerli tarih manual_blast_notes’ girin. Olası yeni bir Caenorhabditis türü olup olmadığını kontrol edin. Hizalamayı görselleştirmek için üst vuruştaki bağlantıya tıklayın (Şekil 6). En iyi isabet (1) bir Caenorhabditis türüyse, (2) hizalama dizinin merkezinde beşten fazla uyumsuzluk içeriyorsa ve (3) sorgu kapsamı ‘den büyükse, bu sonuç izolatın yeni bir Caenorhabditis türü olabileceğini düşündürmektedir (Şekil 7). Bu S-plakaları için, ‘species_id’ sütununda en üstteki BLAST isabetinin türleri, ‘possible_new_caeno_sp sütununa’ 1 ve ‘olası yeni Caeno sp.’ ile birlikte yüzde kimliği ile birlikte ‘manual_blast_notes’ sütununa girin (örneğin, ‘olası yeni Caeno sp. kimlik’). Bir Caenorhabditis türüne PATLATAN S-plakası dizileri için, ‘species_id’ sütununa en üstteki BLAST isabetinin tam cinsini ve tür adını girin. Örneğin, ‘Caenorhabditis elegans’. Caenorhabditis olmayan bir türe PATLAMA yapan S-plakası dizileri için, yalnızca üst BLAST vuruşunun cinsini ve ardından ‘species_id’ sütununa ‘sp.’ girin. Bu gösterim, izolatın adlandırılmış cins içinde bilinmeyen bir tür olduğu anlamına gelir. Örneğin, ‘Oscheius sp.’.NOT: ITS2 dizisi, Caenorhabditis cinsinin dışındaki tür düzeyindeki izolatları güvenilir bir şekilde tanımlamak için kullanılamaz3,13. Genotipleme sayfasının ‘make_strain_name sütununa’ 1 girin, eğer ‘species_id’ = ‘Caenorhabditis elegans’, ‘Caenorhabditis briggsae’ veya ‘Caenorhabditis tropicalis’, VEYA ‘possible_new_caeno_sp’ = 1. Suşları Caenorhabditis isimlendirme kurallarına uygun benzersiz adlarla adlandırın, yani 2-3 büyük harften oluşan benzersiz bir laboratuvar tanımı ve ardından her benzersiz suş için bir sayı23. “strain_name” sütununa gerinim adlarını girin. Suşlar adlandırıldıktan sonra, belirlenmiş protokoller 24 kullanılarak kriyokorunabilirler. 10. Toplama verilerinin R’deki easyFulcrum paketi ile işlenmesi NOT: Bu adımda, easyFulcrum R paketini kullanarak toplama verilerinin (C-etiketleri) ve nematod yalıtım verilerinin (S-etiketleri) birbirine nasıl bağlanacağı açıklanmaktadır. Yazılım, genotipleme sayfasındaki genotipleme verileriyle Fulcrum verilerini daha da birleştirecek işlevler içerir, böylece S-label tür kimlikleri ve suş adları tek bir veri çerçevesinde düzenlenir. Koleksiyon projesi için adlandırılmış yeni bir dizin oluşturun. Dizindeki klasör yapısını, easyFulcrum15 R paketinde açıklanan gereksinimlerle eşleşecek şekilde düzenleyin. Fulcrum web sitesine gidin ve oturum açın. Soldaki Dayanak noktası web sitesinin veri dışa aktarma aracını kullanarak ve aşağıdaki onay kutularını seçerek ham proje verilerini Dayanak noktası veritabanından dışa aktarın: proje, fotoğraf ekleme, GPS verilerini dahil etme, alan örneklemesi ve yalıtım.NOT: Projenin Dayanak noktası verileri, virgülle ayrılmış beş değer (.csv) dosyası olarak dışa aktarılır. Tüm proje verileri, R’deki easyFulcrum paketi kullanılarak tek bir veri çerçevesinde birleştirilecektir. Fulcrum’dan dışa aktarılan beş .csv dosyasını, easyFulcrum vinyetinde21 açıklandığı gibi adım 10.1’de oluşturulan proje dizinine taşıyın. Bir Rstudio oturumu açın ve R konsoluna ‘install.packages(“devtools”)” ve “devtools::install_github(“AndersenLab/easyfulcrum”) komutlarını girerek easyfulcrum paketini R’ye yükleyin. Yeni bir R betiği açın ve koleksiyon verilerini işlemek için easyfulcrum vinyetindeki yönergeleri izleyin21.