Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

1. Preparação da coleção Identifique um local para vistoriar nematoides de Caenorhabditis .NOTA: Na maioria das regiões temperadas, C. elegans e C. briggsae podem ser isolados facilmente de habitats associados ao homem, como campos agrícolas ou jardins rurais e urbanos1. Em regiões subtropicais e tropicais, C. briggsae, C. elegans e C. tropicalis podem ser encontrados nos habitats associados ao homem listados acima, às vezes próximos um do outro. No entanto, C. elegans parece preferir habitats mais frios e secos do que as outras espécies em habitats tropicais7,8. Cada uma das espécies também pode ser isolada de habitats selvagens que não estão associados aos humanos, mas esses habitats são amostrados com menos frequência. Crie um projeto Fulcrum para organizar os dados de coleta e isolamento com os aplicativos móveis de coleta de dados. Crie uma conta com a Fulcrum on-line usando um acordo educacional sem custo16. Adicione o aplicativo Nematode Field Sampling a uma conta Fulcrum clicando no botão ADD APP17. Adicione o aplicativo Nematode Isolation a uma conta clicando no botão ADD APP18.NOTA: Recomenda-se que cada viagem a um local seja organizada como seu projeto de coleta utilizando a convenção de nomeação ‘YearMonthLocation’, por exemplo, 2020FeveraryAustralia. Adicione os usuários à conta Fulcrum para conceder-lhes acesso ao projeto de coleta. Certifique-se de que cada usuário baixe o aplicativo móvel Fulcrum para participar do projeto. Imprima um conjunto de etiquetas de código QR para rastrear as coleções (rótulos C) e os isolamentos de nematoides (etiquetas S) com o aplicativo móvel. Conecte as etiquetas C aos sacos plásticos zip-lock, enrole os sacos rotulados em grupos de 25 e enrole-os com um elástico para embalar. Mantenha o conjunto de etiquetas S para uso em laboratório.NOTA: Ao longo deste protocolo, as coleções (substratos do campo) estão contidas em sacos ou em placas e são rotuladas com etiquetas C. Os nematoides isolados são rotulados com rótulos S. Os rótulos C são usados para identificar coleções únicas, e os rótulos S são usados para identificar isolados únicos de nematoides. Esses dois tipos de rótulos são usados para fazer a conexão entre uma determinada coleção (rótulo C) e os nematoides isolados dessa coleção (Rótulos S) no banco de dados Fulcrum. Imprima o dobro do número de etiquetas S como rótulos C para um projeto de coleção porque, em média, dois nematoides são isolados por coleção. Mais rótulos S podem ser impressos mais tarde, se necessário. 2.500 rótulos C exclusivos (Arquivo Suplementar 1) e 5.000 rótulos S exclusivos (Arquivo Suplementar 2) são fornecidos no suplemento. Prepare placas NGMA de 10 cm para coletas e placas NGMA de 3,5 cm para isolar nematoides. Faça uma placa de 10 cm e pelo menos duas placas de 3,5 cm por coleção21. Estas placas são semeadas com escherichia coli cepa OP50 seguindo protocolos estabelecidos. Armazene as placas antes de usar a 4 °C por no máximo 1 mês. 2. Coleção de campo NOTA: Os nematoides de caenorhabditis são mais frequentemente isolados de material vegetal podre, incluindo frutas, nozes, sementes, vagens, flores, caules, lixo vegetal e composto1,5,6,8. Os melhores substratos são podres e quase irreconhecíveis como frutas ou flores; evitar substratos muito secos ou molhados (Figura 1). Substratos são mais eficientemente coletados do campo trabalhando em pares. O indivíduo com o termômetro infravermelho não contato selecionará um substrato para coleta e coletará a amostra enquanto seu parceiro usa o aplicativo Nematode Field Sampling em Fulcrum para registrar os dados da coleta. O par de coletores repetirá esse processo até que o número desejado de amostras seja coletado. A lista de materiais necessários para o trabalho de campo está encontrada em (Tabela Suplementar 1). Abra o aplicativo móvel Fulcrum, selecione Amostragem de Campo Nematode no menu suspenso. Pressione + para iniciar um novo disco no projeto (Figura 2A). Tire uma foto do substrato. Clique na caixa no centro superior para selecionar o projeto de coleta correto feito na etapa 1.2 (Figura 2B). Toque no campo de etiqueta C na parte inferior do registro de coleta e escolha Digitalizar quando o prompt aparecer. Escaneie o código de barras na bolsa de coleta usando a câmera do dispositivo móvel e toque em Feito no canto superior direito da tela. Toque no campo Substrato e selecione um tipo de substrato no menu suspenso. Adicione notas sobre o substrato tocando no campo Substrate Notes e digitando manualmente notas. Escolha uma paisagem no menu suspenso. Escolha a paisagem que melhor representa o local de amostragem. Escolha uma vista para o céu. Ao escolher a vista do céu, descreva a visibilidade do céu no local de amostragem (por exemplo, uma vista de céu completo sem vistas obstruídas de árvores ou outras estruturas = completa). Meça a temperatura da superfície do substrato usando o termômetro sem contato e registe o valor no campo de temperatura do substrato.NOTA: Segure o termômetro sem contato a não mais de 14 polegadas do substrato durante o registro da temperatura. Meça a temperatura ambiente e a umidade com o dispositivo portátil e regise esses dados nos campos apropriados.NOTA: Verifique se a temperatura ambiente e o dispositivo de umidade não estão em espera. A unidade de medição mudará quando o botão for liberado. Mantenha o dispositivo no bolso externo para evitar leituras irregulares. Salve o registro em Fulcrum tocando em Salvar no canto superior esquerdo da tela. Colete cerca de uma colher de sopa do substrato sem varas ou outras peças duras invertendo o saco de coleta para usá-lo como uma “luva” para pegar o substrato, em seguida, selar o saco. Coloque uma toalha de papel no saco se a amostra estiver particularmente úmida.NOTA: Em climas quentes, coloque as bolsas em refrigeradores macios com embalagens mais frias para manter as coleções frias. Depois de todas as amostras terem sido coletadas durante o dia, limpe o equipamento de coleta, tire as baterias das sondas, recarregue baterias, congele os pacotes congeladores. Sincronize os dados de coleta fulcrum tocando no botão Sincronizar no canto superior esquerdo do aplicativo Nematode Field Sampling .NOTA: Os uploads podem levar vários minutos sem uma conexão celular forte, por isso talvez seja melhor esperar pelo acesso WiFi. Os dados permanecerão em dispositivos móveis e serão sincronizados com a nuvem. Envie as amostras para uma instituição de origem colocando-as em uma caixa de transporte durante a noite. Minimize o tempo em que as amostras são expostas a temperaturas inferiores a 11 °C ou superiores a 25 °C por pacotes de transporte nos dias em que a carga é transportada.NOTA: A maioria das instalações de transporte não envia carga durante a noite nos fins de semana em locais remotos. 3. Emplacando coleções de campo no laboratório NOTA: Esta seção detalha como organizar a transferência de amostras de sacos de coleta rotulados para placas rotuladas. As amostras podem chegar de um carregamento noturno ou diretamente do campo. Receba o envio de coletas e inspecione sacos quebrados ou outras evidências de danos. Se os sacos forem quebrados, descarte o material e limpe os sacos de coleta ininterruptas com 70% de etanol; evitar o rótulo C no saco com o etanol, pois ele vai descolorir o rótulo e dificultar a leitura. Para cada saco de zip-lock, observe o rótulo C na bolsa e conecte um rótulo C correspondente à tampa de uma placa de 10 cm vista com bactérias OP50.NOTA: As placas de 10 cm rotuladas são referidas como “placas C” para o resto do protocolo. A maneira mais fácil de organizar as amostras é colocar os sacos de coleta em um banco de laboratório com a placa C correspondente em cima (Figura 3). Para cada coleção, transfira cerca de uma colher de sopa de amostra do saco de coleta para o prato C usando uma colher de plástico limpa. Adicione a amostra ao redor do gramado bacteriano em uma forma crescente ou anel, não cubra completamente o gramado bacteriano (Figura 4).NOTA: Mantenha a colher de sopa limpa colocando-a em um béquer de 95% de etanol quando não estiver em uso. Use uma toalha de papel para secar a colher de sopa antes de transferir amostras adicionais. Registo o tempo em que as coletas foram transferidas de sacos de coleta para placas C e mantenha as placas C em temperatura ambiente (RT) por pelo menos 24 horas antes de tentar isolar nematoides na seção 4. 4. Isolando nematoides de coleções Abra o aplicativo Fulcrum no dispositivo móvel e escolha o Isolamento nematode no menu do aplicativo (Figura 5A). Faça um novo registro de isolamento tocando no ícone + no lado inferior direito (Figura 5B). Na nova tela de registro de isolamento, confirme o projeto de coleta correto verificando o nome do projeto exibido na caixa no centro superior. Se o projeto errado for exibido, toque no nome do projeto para mudar para o projeto correto (Figura 5C). Toque no botão Selecionar sob o campo de rótulo C para encontrar o rótulo C associado à amostra da qual os nematoides estão sendo isolados (Figura 5D). Toque no ícone Pesquisar e toque no ícone Digitalizar para digitalizar o código QR de etiqueta C na placa C com a câmera do dispositivo. Uma vez que o código QR é digitalizado, um registro de etiqueta C aparecerá no campo de etiqueta C . Toque no ícone Câmera no campo Fotos para abrir a câmera do dispositivo e use-a para tirar uma foto da amostra na placa C com o código QR visível (Figura 5E). Toque em Feito para retornar à tela Isolamento.NOTA: Essas fotos de registro de isolamento podem ser usadas para explorar atributos específicos do substrato posteriormente. Use um microscópio de dissecação para procurar nematoides na placa C. Toque no campo Worms on Sample para registrar a presença de nematoides na amostra (Figura 5F). Toque em Yes se os nematoides estiverem presentes na placa C e toque em Não se não houver nematoides presentes. Toque em Faixas se apenas faixas nematoides estiverem presentes. Se não houver nematoides, parabobofete a placa C e descarte-a em uma lixeira de risco biológico.NOTA: Inverta a placa C sobre a lixeira de risco biológico e bata suavemente na parte de trás da placa para desalojar todos os substratos amostrados. Esta etapa torna mais fácil encontrar e isolar nematoides que podem estar sob o substrato na placa C. Se os nematoides estiverem presentes, isole até cinco nematoides da placa C. Para isolar um nematoide, transfira um nematoide da placa C para uma placa S usando uma picareta de fio de platina. Isole adultos saudáveis e gravid, se possível. No entanto, isole outros estágios se os adultos não forem encontrados.NOTA: Após o isolamento, até cinco placas S terão um único nematoide sobre eles. Mantenha estes S-plate(s) com nematoides isolados da mesma placa C organizada em uma pilha limpa longe de outras placas S até que sejam introduzidos em Fulcrum. Toque no campo placas com etiqueta S para entrar na placa S usada para este isolamento. Toque no + no lado inferior direito. Toque no rótulo S e clique em Digitalizar para abrir a câmera do dispositivo. Use a câmera do dispositivo para digitalizar o código QR de etiqueta S na placa S.NOTA: Certifique-se de que o código de etiqueta S corresponde ao código na placa. Se corresponder, toque em Done. Se isso não acontecer, toque em Cancelar e rescane até que ele corresponda, em seguida, clique em Feito. Às vezes, os códigos QR de placas próximas são acidentalmente escaneados. Depois de inserir cada placa S, salve a entrada com o botão Salvar no canto superior direito. A entrada será perdida se não for salva. Toque no + no inferior direito para adicionar mais placas com etiqueta S, se necessário, até que todos os nematoides isolados da placa C sejam inseridos. Depois de adicionar todas as placas com etiqueta S para o registro de isolamento, toque no botão < no canto superior esquerdo para voltar à tela de registro de isolamento.NOTA: Para cancelar um registro de isolamento porque erros não podem ser resolvidos, clique em Cancelar no canto superior esquerdo. Esta etapa abrirá um diálogo perguntando se o registro pode ser descartado sem economizar. Se desejar, clique em Sim, Descarte. Toque no botão Salvar no canto superior direito uma vez que o registro de isolamento tenha todas as informações adicionadas corretamente. Em seguida, parafilme as placas S com nematoides isolados e reserve-as em uma área designada para segurar placas S com nematoides. Parafilme a placa C e descarte-a na caixa de risco biológico. Toque no ícone Sincronizar para carregar todos os dados para Fulcrum. Classifique todas as placas S em ordem alfanumérica e coloque as placas S em caixas de papelão. Certifique-se de que as placas S estão de lado para baixo e parafilmadas. Empilhe até quatro placas S em uma posição na caixa e rotule a caixa de papelão com o nome do projeto, data, hora e um número de caixa único. Guarde as caixas rotuladas na RT. Estes isolados serão verificados para proliferação às 48h e novamente às 168h, se necessário. 5. Exportando placas S da Fulcrum NOTA: Esta seção detalha como exportar rótulos S usados no processo de isolamento do banco de dados do projeto Fulcrum. Esses rótulos S serão usados para rastrear linhas isofemale proliferando enquanto estão sendo identificados por sequência de identidade nas seções 6-9. Faça login no site da Fulcrum e selecione o aplicativo Isolamento nematode . Clique em Exportador do lado esquerdo da tela. Clique para selecionar o projeto desejado e verifique a caixa isolamento do Nematode . Clique em ‘Seguir ‘ para baixar um arquivo .zip que contém o arquivo ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’. Abra o arquivo ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ e classifique-o pela coluna ‘S-label’ em ordem ascendente (a menor etiqueta S estará no topo). Selecione todas as etiquetas S e copie-as da planilha. Navegue até o modelo de genotipagem selvagem (wild_isolate_genotyping_template) usando um navegador da Web19. Faça uma cópia desta planilha do Google clicando com o botão direito do mouse na guia Genotipping Template e, em seguida, selecionando a opção Copiar para Nova Planilha . Selecione Abrir planilha para visualizar a nova planilha do Google. Nomeie esta nova folha com o nome do projeto fulcrum seguido de ‘wild_isolate_genotyping’, por exemplo, ‘2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping’.NOTA: Esta folha é referida como a “folha de genotipagem” durante todo o resto do protocolo. Cole os rótulos S copiados da coluna ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ ‘s_label’ na coluna de folha de genotipagem intitulada ‘s_label’. Verifique a coluna ‘s_label_repeat_error’ para ‘1’s. Um valor de ‘1’ nesta coluna significa que o rótulo S é duplicado em algum lugar na folha de genotipagem. Se as duplicações forem descobertas, investigue e corrija-as antes de seguir em frente. Preencha a coluna ‘isolation_box_number’ da folha de genotipagem para todos os rótulos S. 6. Verifique se há proliferação nas placas de S Verifique se há animais proliferando em placas S 48 h após o isolamento (use a data e a hora do último isolamento na caixa a partir da etapa 4.11 para orientar o tempo).NOTA: Os nematoides proliferados são caracterizados pela prole na placa S. Se uma placa S estiver proliferando, digite ‘1’ na coluna proliferation_48 na folha de genotipagem, em seguida, mova a placa S para uma caixa rotulada ‘proliferação de 48 horas, caixa 1’. Coloque no máximo 88 placas S em uma caixa de proliferação, em seguida, comece a encher uma nova caixa rotulada de ‘proliferação de 48 horas, caixa 2′. Certifique-se de que os rótulos S estão organizados em ordem alfanumérica nas caixas de proliferação de 48 horas.NOTA: Não descarte as placas S que não proliferam; essas placas serão verificadas novamente às 168 h após o isolamento. Se desejar, consolide essas placas S em ordem numérica em caixas rotuladas ’48 h não proliferando, caixa X’, mas lembre-se de registrar quando a verificação de 168 h deve ocorrer na nova caixa. Depois de identificar todos os rótulos S proliferantes em 48 h, passe para a seção 7 para placas S com proliferação a 48 h. Verifique as placas S que não estavam se proliferando às 48h após o isolamento novamente às 168h após o isolamento. Se uma placa S estiver agora proliferando, digite ‘1’ na coluna proliferation_168 na folha de genotipagem e, em seguida, mova a placa S para uma caixa rotulada ‘proliferação de 168 h, caixa 1’. Coloque um máximo de 88 placas S em uma caixa de proliferação, em seguida, comece a encher uma nova caixa rotulada de “proliferação de 168 h, caixa 2”. Certifique-se de organizar rótulos S em ordem alfanumérica nas caixas de proliferação de 168 h. Descarte as placas S que não têm proliferação após 168 h. Passe para a seção 7 para placas S com proliferação às 168 h. 7. Lysis das linhas isofemale NOTA: Esta etapa usará a ferramenta de filtro de dados nas folhas do Google para ajudar a imprimir planilhas de lise para as placas S nas caixas de proliferação. O objetivo das planilhas de lise é fornecer ao pessoal as posições corretas para etiquetas S em tubos de tira de lise no banco. Abra a folha de genotipagem para o projeto desejado e selecione todas as células digitando Cmd+A. Clique em Data > Crie um filtro para adicionar um botão de filtro a cada cabeçalho de coluna. Use os botões Filter para exibir apenas as placas S que serão genótipas. Por exemplo, se todas as placas S com proliferação a 48 h devem ser lísedas: Clique no botão Filtro na coluna ‘proliferation_48’ e selecione ‘1’. Uma vez filtrada a folha do Google genotipagem, revise a lista de rótulos S exibidos para garantir que sejam as etiquetas S a serem impressas na planilha. Na coluna ‘strip_tube_number’ da folha do Google genotipagem, digite um número único a cada 11 linhas. Digite os números do tubo de tira para um projeto em ordem sucessiva a partir de 1 e nunca duplicado. No ‘strip_tube_position’, digite 2 a 12 para cada número do tubo de tira.NOTA: Use tubos de tira de 12 tubos para lise. A primeira posição (strip_tube_position 1) será controlada, mas os controles não são adicionados às planilhas de lise (apenas os strip_tube_positions são adicionados, 2-12). No momento da lise, a tensão de controle positiva ‘N2’ será adicionada à posição 1 de cada tubo de tira numerada uniforme como um controle positivo. Nenhum verme é adicionado à posição 1 de cada tubo de tira numerado ímpar como um controle negativo. Filtre a folha do Google genotipagem ainda mais para incluir apenas os rótulos S em uma caixa de proliferação que devem ser lysed, em seguida, selecione as colunas ‘s_label’ através de ‘lysis_notes’. Imprima uma planilha de lise para que cada caixa de proliferação seja líseda. Clique no menu suspenso no campo Imprimir e selecione Células Selecionadas. Clique no Next no canto superior direito e use o diálogo para imprimir a planilha de lise para a caixa de proliferação. Repita as etapas 7.3-7.5 para imprimir uma planilha de lise para cada caixa de proliferação.NOTA: Cada caixa de proliferação contém até 88 placas S, o que corresponde a oito tubos de tira de 12 poços. Prepare tubos de tira de 12 poços para todas as amostras que serão líspidas. Rotule um tubo de tira com um ‘strip_tube_number’ único atribuído na planilha de lise. Este rótulo deve ser escrito na tampa e no tubo de tira para evitar confusão se estiverem separados. Os tubos de tira EVEN têm um controle positivo (vermes N2) na posição 1. Os tubos de tira ODD têm um controle negativo (sem vermes) na posição 1. Compondo tampão de lise suficiente (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% gelatina com proteinase K adicionado a uma concentração final de 0,4 mg/mL) para todas as amostras e adicionar 5% extra de erro para pipeta. Escala conforme necessário.NOTA: O tampão de lise é melhor preparado combinando todos os ingredientes, exceto proteinase K e congelamento em alíquotas de 10-50 mL a -20 °C. Descongele as alíquotas e mantenha-se a 4 °C antes de usar; imediatamente antes do uso, adicione proteinase K e misture bem. Mantenha o tampão de lise no gelo enquanto estiver trabalhando. Organize as placas S para um tubo de tira específico, a fim de usar a planilha de lise impressa como guia. Despreite um tubo de tira e adicione 8 μL de tampão de lise a cada tampa com um pipettor repetido. Adicione o tampão de lise a uma tira de tampas de cada vez, pois o tampão de lise evaporará se for deixado no RT e descoberto. Escolha 3-5 animais das placas de origem (placa S ou placa N2 para controles positivos) nas posições de tampa apropriadas indicadas na planilha de lise. Registo notas para qualquer placa S com menos de 5 vermes escolhidos para a lise na seção lysis_notes da planilha de lise. Depois de carregar nematoides em cada posição do tubo de tira, coloque a tampa de volta no tubo de tira. Combine a tampa marcada (posição 1) com o tubo marcado (posição 1). Uma vez tampado, centrifugar o tubo de tira brevemente até que os nematoides estejam na parte inferior do tubo. Coloque a tira no congelador -80 °C até ficar completamente congelado (pelo menos 10 min). Repetir passos de 7,9 a 7,11 até que todas as tiras tenham nematoides adicionados para lise. Organize as tiras do tubo em ordem numérica. Remova os conjuntos de tubos de tira e execute o programa de lise em um termociclador: 1h a 60 °C, 15 min a 95 °C, mantenha a 12 °C. Quando o programa de lise estiver pronto, gire as amostras a 300 x g para 15 s no RT e armazene os lysates a -80 °C por até 1 semana. Organize as tiras de tubo em ordem numérica usando suportes de placas de 96 poços e inclua uma etiqueta com um número de caixa de proliferação, faixa de número do tubo de tira, data e as iniciais do pesquisador. Atualize as colunas ‘lysis_date’ e ‘lysis_notes’ com informações da planilha de lise. 8. PCR de sequências SSU e ITS2 NOTA: Esta seção fornecerá instruções sobre como executar dois PCRs separados para cada placa S. O primeiro conjunto de primer amplifica um fragmento de 500 bp do gene de subunidade 18S rDNA (SSU); oECA1271 = primer avançado TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = primer reverso CCTCTGACTTTCGTTTGATTAA 12. Este PCR é usado para verificar a qualidade do DNA do modelo. O PCR amplifica a região do SSU para quase todas as espécies de nematoides. Se o SSU PCR não se amplificar, este resultado sugere que a qualidade da lise é ruim e a lise deve ser repetida para esta placa S. O segundo conjunto de primer amplifica um fragmento de 2.000 bp da região espaçadora transcrita interna entre os genes 5.8S e 28S rDNA (ITS2); oECA1687 = primer avançado CTGCGTTACTTACCCACGAATTGCARAC, oECA202 = primer reverso GCGGTATTTGCTACTACCAYAMGATCTGC3. O produto ITS2 PCR é sequenciado em Sanger e a sequência é usada para identificar nematoides no gênero Caenorhabditis ao nível da espécie por similaridade sequencial. Use a ferramenta de filtragem na folha de genotipagem para visualizar apenas as etiquetas S a serem usadas para PCR. Atualize as colunas pcr_plate_number e pcr_well na folha de genotipagem. Para evitar a degradação do material de lise, os PCRs SSU e ITS2 são executados ao mesmo tempo. Use os mesmos pcr_plate_number para os PCRs ITS2 e SSU, embora sejam reações separadas em placas separadas. Eles serão distinguidos com rótulos ‘SSU’ ou ‘ITS2’. Atribua uma pcr_plate_number a oito ou menos tubos de tira (um tubo de tira por fileira da placa PCR de 96 poços, disposto em ordem ascendente, por exemplo, menor número de tubo de tira em cima). Em seguida, atribua um pcr_plate_well a cada etiqueta S nos tubos de tira.NOTA: Os tubos de tira são dispostos em ordem ascendente, com o menor número de tubo de tira atribuído à linha A e o número mais alto na linha H. A posição 1 de todos os tubos de tira é atribuída à coluna 1. Portanto, o tubo de tira número 1, posição 1 será atribuído à placa PCR número 1, bem A01. Rotule placas PCR de 96 poços para acomodar as amostras que serão usadas para PCR. Rotule cada placa PCR com as seguintes informações: nome do projeto, tipo PCR, número da placa PCR e data de PCR (por exemplo, 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Além disso, rotule a placa com os números do tubo de tira que serão carregados em cada linha. Retire o material de lise do congelador -80 °C e descongele os tubos de tira contendo o material de lise no gelo. Enquanto o material de lise está descongelando, prepare as misturas mestre ITS2 e SSU em tubos separados no gelo. As receitas SSU e ITS2 PCR são encontradas na Tabela Suplementar 2.NOTA: Prepare 100 reações do mix mestre pcr para cada placa de 96 poços para permitir erro de pipetação. Use um cônico de 15 mL ou 50 mL para segurar a mistura mestre se grandes volumes forem usados. Vórtice o mestre mistura suavemente até que Taq seja distribuído por toda a mistura. Uma vez misturado, alíquota de 38 μL da mistura mestre aos poços apropriados das placas PCR no gelo. Use cochos v-bottom de uso único e uma pipeta multicanal de 12 poços para transferir a mistura mestre para as placas PCR. Gire os tubos de tira de lise descongelados para remover o material de lise das tampas. Remova cuidadosamente as tampas de todos os tubos de tira que serão carregados na primeira placa PCR. Use uma pipeta multicanal de baixo volume (12-bem ou 8-well) para adicionar 2 μL de lise ao poço apropriado na placa PCR. Pipete suavemente o lise para cima e para baixo uma vez antes de remover o 2 μL.NOTA: Verifique as dicas para garantir que elas contenham a lise antes da transferência. Lembre-se de alterar dicas entre linhas ou colunas. Cubra a placa PCR com papel alumínio adesivo PCR e use um rolo para criar uma vedação apertada. Depois que a folha for aplicada, gire brevemente as placas PCR em uma centrífuga. Mantenha a placa no gelo até que esteja pronta para funcionar no termociclador. Execute os PCRs com o programa termociclador apropriado. Consulte a Tabela Suplementar 2 para obter os detalhes dos programas PCR SSU e ITS2. Repita as etapas 8.4- 8.8 até que todos os PCRs sejam executados. Enquanto as reações do PCR estão em execução, despeje um gel de 100 mL 1,5% de agarose. Cada gel conterá amostras ou uma única placa PCR. Adicione 1,5 g de agarose a um frasco de 500 mL, depois adicione 100 mL de tampão TAE 1x (Tabela Suplementar 3) e redemoinho para misturar. Micro-ondas para dissolver e esfriar o gel. Uma vez que a solução seja resfriada, adicione 5 μL de solução de brometo de ethidium de 10 mg/mL e misture para combinar. Despeje a solução em uma bandeja de fundição com quatro pentes de 25 poços para que o gel possa acomodar 96 amostras mais uma escada para cada linha no gel.NOTA: Brometo de ethidium é um mutagênico potente. Ao manusear brometo de ethidium, use um jaleco, luvas resistentes a químicos e óculos de segurança química. Pouco antes do PCR terminar, adicione corante de carregamento de 6x a um cocho descartável e use uma pipeta multicanal para adicionar 2 μL de corante de carregamento de 6x a cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços. Esta placa será usada para carregar as amostras no gel. Faça o suficiente dessas placas para acomodar todas as amostras. Quando os PCRs estiverem prontos, remova as placas pcr e centrifuá-las brevemente a 300 x g por 15 s na RT. Armazene as placas PCR no gelo até que os produtos PCR possam ficar sem gel. Para executar os produtos em um gel, use uma pipeta multicanal de 12 poços para adicionar 5 μL de cada amostra ao poço apropriado de uma placa de 96 poços contendo 2 μL de corante de carregamento de 6x. Em seguida, carregue 6 μL desta mistura em cada poço de um gel recém-lançado. Carregue 6 μL de 1 KB mais escada no primeiro poço de cada linha do gel.NOTA: Para encher os poços do gel, pode ser necessário intercalar a linha A e a Linha B da placa PCR na primeira linha do gel. Para evitar confusão, registo o gel_number e gel_position na folha de genotipagem para cada amostra pcr. Coloque uma nova tampa de papel alumínio sobre o PCR restante na placa e armazene-as a 4 °C. Estes produtos de reação serão usados para sequenciamento na etapa 9. Execute os produtos PCR no gel a 120 V por 20 minutos. Imagem do gel e registro que as etiquetas S produzem produtos ITS2 e/ou SSU PCR nas colunas ‘pcr_product_its2’ e ‘prc_product_ssu’ da folha de genotipagem. Marque a presença de uma banda com um ‘1’; marcar um ‘0’ para nenhuma banda. 9. Identificação de nematoides com sequenciamento Sanger e sequência BLAST NOTA: Esta seção fornece instruções para sequenciar os amplicons ITS2 dos rótulos S, alinhando essas sequências ao banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando o algoritmo BLAST e analisando os resultados blast para identificar os nematoides nas placas S. Para cada amostra que seja ITS2 positivo, use o produto PCR ITS2 restante para sequenciamento Sanger usando o primer dianteiro oECA306 (CACTTTCAAGACCCGAC). Organize para que os arquivos de saída de sequenciamento sejam facilmente vinculados a uma etiqueta S, gravando as colunas ‘sequencing_plate’ e ‘sequencing_well’ de cada rótulo S na folha de genotipagem. Obtenha os arquivos de saída .seq para cada etiqueta S da plataforma de sequenciamento. Organize os arquivos .seq para um projeto em um único diretório com arquivos .seq para cada lote de seqência localizado em subdiretórios. Abra a ferramenta de interface de linha de comando e navegue até o diretório superior contendo os arquivos .seq inserindo o comando: cd . Se ele ainda não existir, crie um FASTA mesclado para todos os arquivos .seq inserindo o seguinte comando: para dir em */; faça cd $dir; para arquivo em *.seq; ecoe “>” $file; gato $file; feito >>.. /all_seqs.fa; cd ..; feito.NOTA: Este código criará um arquivo FASTA mesclado chamado ‘all_seqs.fa’ de todos os arquivos .seq no diretório do projeto. Este arquivo pode ser usado na ferramenta BLAST de nucleotídeo on-line NCBI para alinhar rapidamente a sequência ITS2 de cada rótulo S ao banco de dados de sequência do NCBI. Em um navegador da Web, navegue até o site da NBCI BLAST20 e clique no botão Escolher Arquivo . Selecione o arquivo all_seqs.fa que acabou de ser criado e clique no botão Algumas sequências semelhantes (BLASTn). Clique no botão BLAST na parte inferior da página para iniciar a pesquisa BLAST. Atualize a folha de genotipagem com os resultados blast para cada rótulo S. Use a ferramenta de filtro para facilitar a atualização da folha do Google genotipagem. Clique em Data > Crie um filtro para adicionar um botão de filtro a cada cabeçalho de coluna. Filtre a coluna sequencing_plate para selecionar as placas de sequenciamento que devem ser atualizadas com os resultados blast. Use o menu suspenso na página de resultados do NCBI BLAST para verificar os resultados de cada sequência ITS2 de placa S (Figura 6). Verifique se não há hits blast. Um ID de sequência no prefixo suspenso com * não tem hits de explosão. Para esses rótulos S, digite “nenhuma data de ” na coluna manual_blast_notes da folha de genotipagem. Verifique se há uma possível nova espécie de Caenorhabditis . Clique no link no topo para visualizar o alinhamento (Figura 6). Se o topo atingido for (1) uma espécie de Caenorhabditis , (2) o alinhamento contém mais de cinco incompatibilidades no centro da sequência, e (3) a cobertura de consulta é superior a 50%, este resultado sugere que o isolado pode ser uma nova espécie de Caenorhabditis (Figura 7). Para essas placas S entrarem, a espécie do BLAST superior bateu na coluna ‘species_id’, digita um 1 na ‘coluna possible_new_caeno_sp’, e ‘possível novo Caeno sp.’ na coluna ‘manual_blast_notes’ juntamente com por cento de identidade, (por exemplo, ‘possível novo Caeno sp. 89% identidade’). Para sequências de placas S que BLAST para uma espécie de Caenorhabditis , entre no gênero completo e nome da espécie do topo BLAST atingido na coluna ‘species_id’. Por exemplo, “Caenorhabditis elegans”. Para sequências de placas S que BLAST para uma espécie não-Caenorhabditis , insira apenas o gênero do topo blast atingido seguido por ‘sp.’ na coluna ‘species_id’. Esta notação significa que o isolado é uma espécie desconhecida dentro do gênero nomeado. Por exemplo, ‘Oscheius sp.’.NOTA: A sequência ITS2 não pode ser usada para identificar isoladas de forma confiável ao nível da espécie fora do gênero Caenorhabditis3,13. Digite 1 na ‘coluna make_strain_name’ da folha de genotipagem se ‘species_id’ = ‘Caenorhabditis elegans’, ‘Caenorhabditis briggsae’, ou ‘Caenorhabditis tropicalis’, OR ‘possible_new_caeno_sp’ = 1. Nomeie as cepas com nomes únicos seguindo convenções de nomenclatura de Caenorhabditis , ou seja, uma designação de laboratório única composta por 2-3 letras maiúsculas seguidas de um número para cada cepa única23. Digite os nomes de tensão na coluna ‘strain_name’. Após o nome das cepas, elas podem ser criopreservadas usando protocolos estabelecidos 24. 10. Processando os dados de coleta com o pacote easyFulcrum em R NOTA: Esta etapa descreve como vincular os dados de coleta (rótulos C) e os dados de isolamento do nematode (S-labels) usando o pacote easyFulcrum R. O software contém funções que se juntarão ainda mais aos dados fulcrum com os dados genotipantes da folha de genotipagem para que as identidades das espécies de rótulo S e os nomes de cepas sejam organizados em um único quadro de dados. Crie um novo diretório com o nome do projeto de coleção. Organize a estrutura da pasta dentro do diretório para corresponder aos requisitos descritos no pacote R easyFulcrum15. Navegue até o site da Fulcrum e faça login. Exporte os dados brutos do projeto do banco de dados Fulcrum usando a ferramenta de exportação de dados do site Fulcrum à esquerda e selecionando as seguintes caixas de seleção: projeto, incluir fotos, incluir dados GPS, amostragem de campo e isolamento.NOTA: Os dados fulcro para o projeto serão exportados como cinco arquivos de valor separados por ímula (.csv). Os dados completos do projeto serão unidos em um único quadro de dados usando o pacote easyFulcrum em R. Mova os cinco arquivos .csv exportados do Fulcrum para o diretório de projetos criado na etapa 10.1 como instruído na vinheta easyFulcrum21. Abra uma sessão Rstudio e instale o pacote easyfulcrum em R, inserindo os seguintes comandos no console R ‘install.packages(“devtools”)” e ‘devtools::install_github(“AndersenLab/easyfulcrum”)”. Abra um novo script R e siga as instruções da vinheta easyfulcrum para processar os dados de coleta21.