JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Модель культуры органов роговицы человека Десцемета только с ускоренным заживлением, стимулируемым инженерным фактором роста фибробластов 1

Published: July 22, 2022
doi:
10.3791/63482
, , ,
1Trefoil Therapeutics, Inc.

Summary

Descemet’s Stripping Only – это экспериментальная процедура, в которой пациенты с центральными роговичными кишками, полученными в результате дистрофии эндотелиальной роговицы Фукса, лишены мембраны Descemet для периферических клеток для регенерации эндотелиального слоя. Представлена новая методология моделирования ДСО в дистрофических роговицах человека ex vivo с ускоренным заживлением, стимулируемым eFGF1 (NM141).

Abstract

Эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса (FECD) возникает в результате дисфункциональных эндотелиальных клеток роговицы (CEC) и в настоящее время лечится трансплантацией всей роговицы или мембраны Descemet. Недавние разработки в глазной хирургии создали Descemet’s Stripping Only (DSO), хирургическую технику, в которой центральный круг плотной мембраны Descemet удаляется, чтобы обеспечить миграцию CEC на гладкую строму, восстанавливая функцию и зрение роговицы. Хотя этот потенциальный вариант лечения представляет большой интерес в области офтальмологических исследований, успешные модели ex vivo DSO не были установлены, а клинические данные ограничены. В этой работе представлена новая модель заживления ран, имитирующая DSO в донорских роговицах человека. Используя этот подход для оценки эффективности искусственного человека FGF1 (NM141), мы обнаружили, что лечение ускоряет заживление путем стимуляции миграции и распространения CEC. Этот вывод был подтвержден в 11 парах роговиц человека с признаками дистрофии, о которых сообщали глазные банки, чтобы убедиться, что эти результаты могут быть воспроизведены у пациентов с дистрофией Фукса, как целевая популяция процедуры DSO.

Introduction

Эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса (FECD) – это заболевание, характеризующееся потерей насосной функции в эндотелиальных клетках роговицы (CEC) и чрезмерным накоплением коллагена и других белков внеклеточного матрикса на поверхности мембраны Descemet, образуя роговицуguttae 1. Единственным известным методом лечения FECD является эндотелиальная кератопластика в различных формах, все из которых сопряжены с риском отторжения и потери эндотелиальных клеток2. В то время как достижения в офтальмологической хирургии позволили этим процедурам стать менее инвазивными с течением времени, любая форма трансплантации сопряжена с риском отторжения и возможностью пожизненного использования стероидов, лечения с его собственными сопутствующими побочными эффектами. Более того, глобальная нехватка донорской ткани такова, что на каждые 70нуждающихся пациентов приходится только одна донорская роговица. Учитывая эти проблемы, исследователи и клиницисты изучают хирургические методы, которые полностью избегают необходимости в донорской ткани. Одним из таких экспериментальных методов является Descemet’s Stripping Only (DSO) или Descemetorhexis без эндотелиальной кератопластики (DWEK), в которой пациенты с FECD с гуттами, локализованными в центре роговицы, имеют центральный 4-миллиметровый круг мембраны Descemet, удаленный без размещения трансплантата. Удаление guttae побуждает здоровые периферические клетки мигрировать внутрь и реформировать эндотелиальный монослой, в конечном итоге обращая вспять стромальный отек и улучшая зрение. Концепция была первоначально описана в серии тематических исследований, в которых пациенты перенесли операцию, которая была осложнена отслоением мембраны Descemet, но репопуляция CEC все еще происходила 4,5,6,7. Хотя у этого метода есть много преимуществ, процесс заживления является длительным и непоследовательным, так как некоторым пациентам требуется спасательная трансплантация, если в течение нескольких месяцев после операции8 не наблюдается заживления. По этим причинам препарат, который стимулирует более быструю миграцию и распространение CEC, может быть полезен в процессе выздоровления пациентов с FECD, перенесших DSO.

Несколько недавних исследований оценивали ингибиторы ROCK в качестве дополнительного лечения для пациентов, перенесших DSO, и обнаружили, что пациенты, получавшие лечение, выздоравливали быстрее и имели более высокую плотность центральных эндотелиальных клеток (ECD), чем в группе DSO только 9,10,11. Однако из-за небольших размеров выборки и различий между режимами дозирования требуется больше данных, чтобы лучше понять эффективность ингибиторов ROCK в этих условиях.

Было также показано, что факторы роста фибробластов стимулируют регенерацию эндотелия роговицы как in vitro с бычьими CEC, так и in vivo в кошачьих роговицах12,13. eFGF1 (NM141) представляет собой инженерную версию FGF-1, содержащую несколько аминокислотных замен для стабилизации молекулы, в отличие от нативного FGF-1, который имеет гораздо более короткий период полураспада14,15. Ранее мы продемонстрировали способность eFGF1 (NM141) стимулировать пролиферацию CEC ex vivo в четвертованной роговице человека16. Это исследование было направлено на улучшение этой работы путем создания первой успешной модели ex vivo DSO как в нормальных, так и в дистрофических роговицах, чтобы определить, ускоряют ли дополнительные методы лечения, такие как eFGF1 (NM141), заживление в этом приложении.

Protocol

В этой работе использовались существующие образцы без идентификации субъектов, и она не подлежит утверждению IRB в соответствии с 45 CFR 46.101(b)(4). Донорские роговицы человека были получены из различных глазных банков по всей территории США (см. Таблицу материалов). Роговицы были индивидуально оценены дистрофическими глазными банками на основе таких результатов, как гутты, плеоморфизм, полимегатизм и / или низкий ECD при зеркальной оценке. На рисунке 1 представлено окрашивание Трипана Синим в роговице во время создания раны, сразу после зачистки и через 2 недели в культуре. Рисунок 1: Диаграмма, представляющая роговицу во время создания раны, сразу после зачистки и через 14 дней в культуре, как визуализируется Trypan Blue. Уменьшение окрашенной площади между этими временными точками измеряли, чтобы определить уровень заживления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 1. Создание раны Используя стерильные щипцы, удалите роговицу из среды и промойте в 1x PBS для удаления остаточных сред и клеточного мусора. После полоскания поместите эндотелиальную сторону роговицы вверх на крышку чашки Петри. Пипетка 30 мкл трипана синего в хорошо обработанное блюдо. Окуните новый 4-миллиметровый биопсийный перфоратор в Trypan Blue и отклейте все излишки. Обеими руками расположите перфоратор над центром роговицы и опустите его прямо на эндотелиальную поверхность, оказывая минимальное давление. Не меняя положения или давления на роговицу, переложите удар на одну руку и тянитесь к щипцам вновь освобожденной рукой. Используйте щипцы, чтобы удерживать роговицу на месте, осторожно скручивая биопсийный удар примерно на 90 ° назад и вперед несколько раз. Поднимите удар прямо из роговицы и отложите в сторону. Смойте еще раз в 1x PBS, чтобы удалить излишки Trypan Blue. 2. Зачистка Десцемета Переложите роговицу на крышку чашки Петри в рассекающий прицел.ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте роговицу сухой дольше 5 минут. Если для завершения процесса требуется больше времени, снова промыть в 1x PBS для регидратации эндотелия. Удерживая роговицу на месте изогнутыми щипцами, забивайте мембрану Децемета, слегка волоча кончик острой иглы весом 30 г вдоль кольца Trypan Blue, оставленного ударом биопсии. Используйте минимальное давление, чтобы избежать разрушения подлежащей стромы. С помощью крючка Sinskey используйте мягкие зачерпывающие движения, чтобы поднять и отклеить мембрану Descemet вокруг края раны, работая к центру поражения.ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана Descemet должна иметь очень малое сопротивление. Если возникают трудности, то, скорее всего, подтягивается строма. Если это произошло, начните сначала, поднимая из новой точки по краю раны. После того, как большая часть мембраны Descemet была отделена от стромы, используйте щипцы Горовой, чтобы удалить мембрану и отложить в сторону. Осмотрите зачищенный участок на предмет остатков мембраны и удалите горовыми щипцами. 3. Трипан Синее окрашивание ПРИМЕЧАНИЕ: После зачистки Descemet окрасьте роговицу trypan Blue, чтобы визуализировать область раны. Верните роговицу на крышке чашки Петри в шкаф биобезопасности и промойте в 1x PBS, содержащем 0,01% (мас./об.) CaCl2 и MgCl2 , чтобы удалить клеточный мусор и облегчить плотное прилипание оставшихся CEC к неповрежденной мембране Descemet. Поместите роговицу в хорошо обработанную посуду и пипетку 30 мкл трипана синего на эндотелиальный слой на 30 с. Используйте щипцы, чтобы мягко раскачивать роговицу, чтобы убедиться, что вся эндотелиальная поверхность покрыта. Смойте избыток Trypan Blue в 1x PBS с 0,01% (мас./об.) CaCl2 и MgCl2 и визуализируйте окрашенную роговицу под рассекающим микроскопом для временной точки Дня 0. Убедитесь, что роговица сбалансирована таким образом, что свет равномерно передается по всей длине, а позиционирование воспроизводится в разных временных точках.ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы могут быть использованы для удержания роговицы на месте во время визуализации, если это необходимо. 4. Культурный период Культивировать роговицы в шестилуночной пластине, содержащей низкосывороточные среды, состоящие из OptiMEM; 1x инсулин, трансферрин и селен; 1x антибиотик/антимикотический; 0,02 мг/млCaCl2; 0,2 мг/мл аскорбиновой кислоты; и 0,8% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки. Культивируйте левую роговицу только в 8 мл низкосывороточных сред, а правую роговицу в 8 мл сред с низким содержанием сыворотки с добавлением 100 нг/мл eFGF1 (NM141). Инкубировать при 37 °C с 6% CO2 в течение 14 дней с ежедневными изменениями среды. Повторите процедуру окрашивания Trypan Blue на 3, 6, 9, 12 и 14 день и нарисуйте каждую роговицу сразу после окрашивания. Убедитесь, что настройки камеры согласованы во всех временных точках. На 12-й день добавьте 10 мкМ EdU как к контрольной среде, так и к среде, дополненной eFGF1 (NM141), и инкубируйте в течение 48 ч для маркировки пролиферирующих клеток. Обновление медиа с EdU добавлено снова на 13-й день. На 14-й день, через 48 ч после добавления EdU, пятна Трипана и изображения роговицы, как обычно, за исключением 1x PBS с CaCl2 и MgCl2, используйте простой 1x PBS для полосканий, чтобы предотвратить взаимодействие кальция с красным пятном Alizarin. 5. Ализарин Красное окрашивание На 14 день приготовить 5% Ализарин Красный в 0,9% физиологическом растворе.ПРИМЕЧАНИЕ: Ализарин Красный не растворяется полностью в физиологическом растворе. При соединении вихревого раствора и породы в течение не менее 1 ч. Вихрь еще раз и фильтр перед использованием для удаления нерастворенных частиц. После того, как окрашивание трипана и визуализация были завершены, переложите роговицу в обтекаемую посуду и добавьте 200 мкл alizarin Red на эндотелиальную поверхность каждой роговицы. Окрашивание в течение 2 мин, затем промыть каждую роговицу в чашке Петри 1x PBS, чтобы удалить избыток Alizarin Red, прежде чем поместить в шестилуночную пластину, предварительно заполненную 8 мл 1x PBS для двух 5-минутных стировок. После второй промывки визуализируйте очищенный участок каждой роговицы под рассекающим микроскопом.ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от визуализации Трипана, роговицу можно оставить в 1x PBS для изображения окрашивания ализарином, чтобы предотвратить их высыхание во время процесса. 6. Фиксация и пермеабилизация После того, как изображения Ализарина были получены, переложите роговицу на 12-луночную пластину и промыть в 4 мл 1x PBS, содержащего 0,05% Tween-20 (PBS-T) в течение 30 минут, чтобы удалить любые частицы из ткани до фиксации. Зафиксируйте роговицу в 4 мл 4% PFA в течение 30 мин при комнатной температуре. Пермеабилизируйте клетки в течение 5 мин в 4 мл 1x PBS, содержащего 1% Triton X-100, затем промывайте три раза в 4 мл простого 1x PBS в течение 30 мин каждый. 7. Иммуногистохимия Блокируют роговицу в течение 1 ч при 37°С в 4 мл 1x PBS, содержащей 2% бычьего сывороточного альбумина и 2% козьей сыворотки. Инкубировать в 1 мл блокирующего раствора, содержащего 2,5 мкг/мл первичного антитела мышиного анти-ZO-1 в течение 1 ч при 37°С, затем промыть три раза в 4 мл по 1x PBS в течение 30 мин каждый.ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина может быть наклонена во время окрашивания антителами, чтобы свести к минимуму объем необходимых реагентов. Просто убедитесь, что вся роговица полностью погружена в раствор антител. Выполните реакцию EdU Click-iT, используя коктейль, содержащий 0,88 мг/мл аскорбиновой кислоты, 0,26 мг/мл CuSO4 и 2,5 мкМ Alexa Fluor 488 азида. Подготовка реакционных компонентов Добавьте 500 мкл 1x PBS к 88 мг аскорбиновой кислоты и вихрь до растворения. Добавьте 840 мкл деионизированной воды к 44 мг CuSO4 и вихрь до растворения. Приготовьте коктейль, добавив следующие реагенты в 6 мл 1x PBS в таком порядке, инвертируя трубку для смешивания после каждого добавления: 30 мкл раствора аскорбиновой кислоты, 30 мкл раствора CuSO4 , а затем 15 мкл Alexa Fluor 488ПРИМЕЧАНИЕ: После приготовления этот раствор является светочувствительным. В течение остальной части протокола роговицы должны быть защищены от света, когда это возможно. Добавьте 1 мл реакционного коктейля EdU к каждой роговице и реагируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавьте 4 мл 10 мкг/мл Hoechst 33342 к каждой роговице и реагируйте в течение 2 мин при комнатной температуре, затем промыть три раза по 1x PBS-T в течение 30 мин каждый. Инкубировать в 1 мл блокирующего раствора, содержащего 2 мкг/мл Alexa Fluor 555, меченного козьим антимышиным IgG в течение 1 ч при 37°C, затем промыть три раза по 1x PBS-T в течение 30 мин каждый. Храните роговицу при 4 °C в 4 мл 1x PBS с 1% анти/анти, 0,1% ципрофлоксацином и 0,1% амфотерицином B для предотвращения роста микробов. При выполнении конфокальной визуализации монтируйте целые роговицы в 200 мкл монтажной среды на стеклянные слайды с крышкой, заклеенной для сплющивания. 8. Анализ изображений Трипана Выполняйте весь анализ изображений с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом NIH ImageJ. Откройте изображение с помощью функции «Файл > Открыть » и нажмите кнопку «Изображение» > «Настроить > порог цвета». Используйте ползунки «Оттенок», чтобы охватить только синий диапазон, и отрегулируйте верхний ползунок «Яркость» влево, чтобы включить больше окрашенной области.ПРИМЕЧАНИЕ: Если это действие приводит к включению частей изображения, которые не окрашены Трипаном, ползунок «Яркость» может быть возвращен на исходный уровень. Медленно отрегулируйте верхний ползунок «Насыщенность», пока пороговое значение точно не очертит окрашенную область.ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно открыть копию исходного изображения для ссылки во время этого процесса. Нажмите кнопку «Выделение » в меню цветового порога, затем с помощью инструмента «Выделение кисти» отмените выделение областей за пределами раны, которые были подняты. Нажмите кнопку «Анализировать > меру», чтобы сообщить о окрашенной области в пикселях. Отмените выделение всех с помощью функции «Редактировать > выделение» > «Выделить нет» и используйте инструмент выделения овала, чтобы как можно ближе подогнать лимбус, а затем нажмите « Анализировать > меру», чтобы сообщить о площади роговицы в пикселях.ПРИМЕЧАНИЕ: Яркость может быть временно увеличена, чтобы помочь в визуализации лимбуса, если эта часть изображения слишком темная. Запишите значения площади и разделите окрашенную область на площадь всей роговицы, затем умножьте на 100, чтобы рассчитать процент окрашивания. Повторите этот процесс еще два раза для каждого изображения, затем возьмите среднее из трех измерений. 9. Статистический анализ После того, как все изображения будут проанализированы, разделите средний процент, окрашенный на 14-й день, на процент, окрашенный на день 0, чтобы определить остаточную незаживающую область. Вычтите эту сумму из 100%, чтобы рассчитать процент очищенной области, зажившей за 14 дней. Используйте парный t-тест для сравнения процентных заживленных значений между контрольной и лечебной группами.

Representative Results

Этот эксперимент был первоначально проведен в 10 парах нормальных исследовательских роговиц, так как они наиболее легко доступны. Как только метод оказался успешным, исследование было воспроизведено в 11 парах дистрофических роговиц, помеченных как таковые глазными банками на основе зеркальной оценки, для изучения эффектов eFGF1 (NM141) в роговицах, представляющих популяцию пациентов FECD. Для большей клинической значимости цифры, включенные в настоящую работу, представляют собой данные, собранные из дистрофических роговиц, если не указано иное. После моделирования хирургического исхода DSO окрашивание Trypan Blue проводили и повторяли в течение 14-дневного периода культивирования, а снижение положительного окрашивания количественно оценивали для оценки заживления ран (рисунок 2). Окрашивание Alizarin Red также было выполнено на 14-й день для очерчивания границ клеток. Темно-красные области без видимого четкого рисунка (далее называемые отрицательным окрашиванием) появлялись последовательно в незаживающем участке поражения и в других областях роговицы, где считалось, что клетки повреждены или отсутствуют. Области, которые были положительными для Trypan Blue на 14-й день, хорошо соответствовали отрицательному окрашиванию Alizarin Red (рисунок 2). Все дистрофические роговицы, обработанные eFGF1 (NM141), показали большее заживление на 14-й день по сравнению с необработанным матом. В среднем, обработанные роговицы продемонстрировали 91% заживления по сравнению с 38% в контрольных роговицах, и эта разница была статистически значимой (p < 0,001) (рисунок 3A). Это сопоставимо с результатами, полученными из 20 нормальных роговиц, где контрольная группа показала в среднем 32% заживления, а обработанные роговицы достигли 81%, что опять же было статистически значимым (p < 0,001) (дополнительный рисунок 1). Процент заживления сравнивали между нормальной и дистрофической роговицей с использованием двух выборочных т-тестов, предполагающих равную дисперсию, и никаких существенных различий не наблюдалось ни в контрольной, ни в лечебной группах (данные не показаны). Донорская информация, предоставленная глазными банками (таблица 1) как для нормальных, так и для дистрофических роговиц, была проанализирована, чтобы определить, коррелируют ли с заживлением характеристики, включая возраст, дни, хранящиеся в оптисоле, интервал от смерти до сбора, плотность клеток и пол. Коэффициент корреляции Пирсона (r) был использован для исследования всех факторов, кроме пола, который оценивался с использованием непарного t-теста для сравнения заживления между мужчинами и женщинами. Абсолютное значение r было ниже 0,25 во всех случаях, что указывает на то, что любые корреляции между заживлением и возрастом, днями, хранящимися в Optisol, интервалом от смерти до сбора или плотностью клеток считались незначительными. Разница в исцелении между мужчинами и женщинами не была статистически значимой (p = 0,53). Подобно нормальному набору данных, 10 из 22 дистрофических роговиц представлены заметным окрашиванием трипана за пределами полосатой области, связанной с окрашенной областью внутри поражения, по крайней мере, в одну точку времени (обычно день 3) – наблюдение, которое мы назвали периферическим окрашиванием (рисунок 4A). Из этих 10 только две были контрольными роговицами, чьи обработанные аналоги не проявляли такого же эффекта. Остальные восемь были подобранными парами и имели одинаковую степень тяжести между роговицами одного и того же человека. Хотя паттерны окрашивания были сопоставимы между нормальной и дистрофической роговицей, частота периферического окрашивания была выше в наборе дистрофических данных с 45% положительных роговиц по сравнению с 25% в нормальной группе. На рисунке 4А показана пара, которая считалась положительной для периферического окрашивания, так как окрашенная область за пределами поражения встречалась с краем раны на снимках 6-го дня и постепенно отступала. На соответствующих изображениях Alizarin Red клетки в областях с периферическим окрашиванием Trypan казались увеличенными и аномальной формы, очень похожими на клетки, которые мигрировали в очищенную область, и отрицательное окрашивание коррелировало с областями, где Trypan Blue присутствовал на 14-й день. Несмотря на большую часть пораженной роговицы на протяжении всего периода культивирования, частичная или полная очистка окрашенной периферии происходила во всех 10 роговицах. Кроме того, окончательный процент заживления на 14-й день был в пределах нормального диапазона, соответствующего группе лечения, для всех, кроме одной роговицы. Выброс (0811L, изображенный на рисунке 4A) вернул отрицательное процентное значение заживления из-за остатков периферического окрашивания, которые все еще соединялись с областью поражения на 14-м дне (Рисунок 3A и Рисунок 4A). Второй рисунок окрашивания, называемый дальним периферическим окрашиванием, был запечатлен на изображениях Alizarin Red с рисунка 4B, но также был очевиден на изображениях Trypan Blue на протяжении всего периода культуры во многих роговицах (рисунок 4B). Это наблюдение характеризуется кольцом темного окрашивания вокруг лимбуса, что указывает на скомпрометированный эндотелий. Несмотря на этот термин, эта картина была настолько распространена как в нормальных, так и в дистрофических роговицах, что они не считались положительными для периферического окрашивания. На этих изображениях контрольная роговица показала более яркое и обширное окрашивание на 14-й день, несмотря на то, что обе роговицы обладали одинаковой тяжестью и характером окрашивания в начале периода культуры. Также в обработанной роговице было отмечено, по-видимому, большее количество клеток, которые казались более компактными и гексагональными по сравнению с контролем, хотя эти наблюдения не были количественно измерены. Из-за кривизны на периферии в количественный анализ было включено только окрашивание трипана внутри и непосредственно вокруг обнаженной области. Когда процентные значения окрашивания были усреднены по всем дистрофическим роговицам, появление периферического окрашивания привело к первоначальному увеличению по сравнению с дневным 0, в отличие от устойчивого снижения, наблюдаемого в нормальных роговицах, где периферическое окрашивание было менее распространенным (рисунок 3B). Иммуногистохимия, визуализированная конфокальной визуализацией, показывает полуорганизованную экспрессию ZO-1, функционального маркера плотных соединений CEC, внутри и вокруг края поражения (рисунок 5), картина, аналогичная показанию окрашивания Alizarin Red (рисунок 2 и рисунок 4). Плеоморфизм и полимегатизм видны по ZO-1 в большинстве дистрофических роговиц; однако это наблюдение может быть связано с их больным состоянием и было отмечено глазным банком при зеркальном исследовании роговицы перед культивированием. Дезорганизованная экспрессия ZO-1 наблюдается в области поражения обработанной роговицы, где клетки мигрировали внутрь, что также согласуется с красными паттернами Ализарина. EdU-включающие клетки можно увидеть вокруг границы поражения и внутри пораженной области в контрольной и обработанной роговице (рисунок 5). Структура мигрировавших CEC также отражает результаты Trypan Blue, где в контрольных роговицах большинство клеток было обнаружено в двух полях от края поражения, в то время как CEC в обработанных роговицах можно увидеть по всей полосатой области (рисунок 2). Маркировка EdU была выполнена в качестве качественной меры в этом исследовании, чтобы подтвердить, что пролиферация способствовала исцелению. Тем не менее, количественная оценка клеток, включающих EdU, не могла быть выполнена систематически из-за отека роговицы, препятствующего захвату последовательных, воспроизводимых изображений внутри и вокруг поражения. В качестве суррогата был включен количественный анализ, проведенный в исследовании, проведенном до создания модели DSO, чтобы продемонстрировать влияние eFGF-1 (NM141) на пролиферацию (рисунок 6). Нормальные донорские роговицы человека разрезали на четвертинки с использованием скальпеля и культивировали в присутствии EdU, с eFGF1 (NM141) или без него в течение 48 ч, как описано ранее (Eveleth, 2020)16. Визуализацию и последующий анализ клеток Hoechst 33342 и EdU-меченых проводили отдельно в нетронутой средней зоне четвертей и в краевой зоне, в пределах трех полей, откуда была вырезана роговица. В средней зоне процент клеток, включающих EdU, был низким и сильно варьировался в 10 проанализированных роговицах. В среднем, кварталы, обработанные eFGF1 (NM141), имели более высокие уровни включения EdU в средней зоне (4,1% ± 7,9%) по сравнению с контрольной группой (1,8% ± 2,9%), хотя эта разница не была статистически значимой (p = 0,239). На краю раны обработанные четверти, стимулированные eFGF1 (NM141), показали значительно более высокие показатели включения EdU при усреднении (18,1% ± 11,5%) по сравнению с контрольными кварталами (10% ± 9,6%, p = 0,012). Таблица 1: Информация о донорах для 22 дистрофических и 20 нормальных роговиц, используемых в этом исследовании, а также 10 нормальных роговиц, используемых ранее для количественного определения EdU. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу. Рисунок 2: Окрашивание роговицы жизненно важным красителем после зачистки Десцемета. Дистрофические роговицы человека были лишены центральных 4 мм мембраны Descemet и инкубированы с eFGF1 (NM141) (NM141) (100 нг/мл) или без него в течение 14 дней. Поражения были визуализированы окрашиванием Trypan Blue в дни 0, 3, 6, 9, 12 и 14. Границы ЦИК были визуализированы окрашиванием Ализарина в красный цвет на 14-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Дистрофические роговицы человека показывают значительно большее заживление от DSO при культивировании с помощью eFGF1 (NM141). (A) Процент заживления был определен путем измерения окрашенной области на 14-й день с использованием ImageJ и сравнения этого с процентом, окрашенным на 0-й день. (B) Средний процент окрашенных с течением времени показывает последовательное снижение нормальных роговиц в то время как пик на 3-й день в дистрофических роговицах из-за более высокой распространенности периферического окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Окрашивание дистрофическим красителем дистрофических роговиц с периферическим окрашиванием. (A) Трипановое окрашивание неповрежденной мембраны Descemet можно увидеть продвигающимся к центру, а затем очищающимся с течением времени как в контрольной, так и в обработанной роговице. (B) Ализариновые паттерны вокруг лимбуса представляют собой типичное наблюдение периферического повреждения и дезорганизованного восстановления эндотелия, наблюдаемого во многих донорских роговицах – в данном случае дистрофических. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Стимулирование миграции и распространения СЦЭ с помощью eFGF1 (NM141) в лишенных дистрофических роговицах. Конфокальные микроснимки лишенных роговиц Десцемета, окрашенных для ZO-1 (красный), EdU (зеленый) и Hoechst 33342 (синий). Пунктирная линия представляет собой край поражения с обнаженной областью в левой части изображения и неповрежденной мембраной Децемета справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Количественное определение пролиферирующих клеток из нормальных роговиц, четвертованных с помощью скальпеля и инкубированных в средах, содержащих EdU с eFGF-1 (NM141) или без него в течение 48 ч. Четверти были сфотографированы в трех экземплярах в нетронутой средней зоне и вдоль края среза, и счетчики были усреднены для определения процента ячеек, включающих EdU в средней и краевой зонах. Рисунок, модифицированный из Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, используется с разрешения16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1: Нормальные роговицы человека показывают значительно большее заживление от DSO при культивировании с eFGF1 (NM141). ImageJ использовался для измерения окрашенных участков и определения % заживления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Многие офтальмологи обеспокоены тем, что рекомендуют DSO своим пациентам по двум основным причинам: 1) длительный процесс заживления и 2) отсутствие данных (DSO является новой концепцией в области офтальмологической хирургии). Исследование, которое мы представили, будет иметь большую пользу для смягчения обеих этих проблем. Основываясь на данных этого и других исследований, FDA одобрило клиническое испытание фазы 2, в котором eFGF1 (NM141) будет вводиться в различных графиках дозирования пациентам, проходящим DSO17.

Способ, описанный выше, был смоделирован после исследования, выполненного Soh et al., где заживление эндотелия роговицы оценивали с ингибитором ROCK Y-27632 и без него как в поцарапанных, так и в шелушащихся ранах18. В то время как Y-27632 ускорял регенерацию эндотелия с неповрежденной мембраной Descemet, существенного заживления не было обнаружено в обнаженных ранах даже при лечении. Используя аналогичную технику зачистки с последующим лечением eFGF1 (NM141) или без него, наблюдения, которые мы обнаружили, не соответствовали наблюдениям Соха и его коллег. Отсутствие окрашивания Trypan Blue во многих обработанных роговицах на 14-й день и наличие положительных плотных соединений ZO-1 в реформированном эндотелиальном слое утверждают, что неповрежденный барьер, часть естественной функции ЦИК, был восстановлен как в нормальных, так и в дистрофических роговицах. Хотя в этом исследовании нет количественной оценки, присутствие EdU-положительных клеток в и вокруг обнаженной области также предполагает пролиферацию как механизм заживления, который, как мы ранее установили, может стимулироваться eFGF1 (NM141) в поврежденных роговицах16. Статистический анализ показал, что лечение eFGF1 (NM141) привело к значительно большему заживлению от DSO, в среднем более чем в два раза выше, чем контрольная роговица в 14-дневную точку. Хотя скорость заживления умеренно варьируется между людьми – типичная характеристика донорских роговиц – воспроизводимость результатов на больших размерах выборки также свидетельствует о весьма измеримом методе. Насколько нам известно, в литературе нет других примеров модели зачистки ex vivo Descemet.

Ключевыми компонентами самого протокола, которые будут полезны для других исследователей, изучающих DSO, являются использование Trypan Blue для обнаружения голой стромы и метод обработки изображений, используемый для измерения окрашенной области. Trypan Blue обычно используется в офтальмологической хирургии, особенно при работе с мембраной Descemet для обнаружения нежизнеспособных клеток и помощи в видимости ткани. Временные точки окрашивания, включенные в этот протокол, позволяли эффективное повторное окрашивание без чрезмерного воздействия роговицы на Trypan Blue, поскольку он оказался токсичным для CEC при высоких концентрациях19. Уменьшение окрашенной площади в течение 14 дней во всех роговицах, подтвержденное Alizarin Red и иммуногистохимией как результат мигрировавших CEC, демонстрирует простой и воспроизводимый метод измерения заживления. Используя меню цветового порога ImageJ, несколько аналитиков собрали данные со стандартными отклонениями стабильно ниже 1% (данные не показаны). Хотя альтернативные программы могут работать аналогично, ImageJ – это программное обеспечение с открытым исходным кодом, способное производить точные измерения площади для отслеживания заживления.

Есть, однако, один аспект протокола зачистки, который, по нашему мнению, необходим для создания раны, но препятствует общему процессу заживления. Использование острой иглы весом 30 г для оценки мембраны Descemet вдоль отметки, оставленной ударом биопсии, позволяет создать гладкую, круглую рану, которая, как отмечают клиницисты, поддерживает более быстрое заживление10. В то же время этот шаг повреждает роговицу, так как он может создавать разрывы в стромальных волокнах, вызывая гибель стромальных клеток, препятствуя миграции эндотелиальных клеток через край раны и вызывая образование узелков, которые приводят к более стойкому послеоперационному отеку20. Клиницисты, выполняющие DSO, обычно используют обратный крючок Sinskey для инициирования раны, но без какого-либо внутриглазного давления, поддерживающего роговицу подтянутой, этот инструмент менее эффективен в модели ex vivo . Альтернативный инструмент, способный разорвать мембрану Descemet, не повреждая подлежащую строму, улучшит протокол, например, оросительный и аспирационный наконечник, рекомендованный Macsai и Shiloach10. Потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы определить, совместим ли этот метод с моделью ex vivo .

Проблемой, которая, по-видимому, присуща модели ex vivo, является частое возникновение смерти ЦИК в области периферической части раны, особенно в дистрофической роговице. Это иногда затемняет количественное определение области раны, поскольку точность инструмента цветового порога становится более ограниченной, поскольку окрашенная область выходит за пределы центра роговицы, где ее кривизна приводит к неравномерному распределению света. Однако эти переменные измерения в основном происходили в более ранние моменты времени, прежде чем периферическое окрашивание постепенно отступало, поскольку поврежденные CEC очищались, а соседние клетки растягивались, мигрировали или размножались, чтобы заменить их. К последнему 14-дневному временному моменту окрашенная область локализовалась обратно к центру роговицы, и все изображения были измеримы. Аналогичное наблюдение было сделано с сопоставимой частотой Soh et al., где пять из 14 нормальных роговиц представляли то, что они назвали «преждевременным сбоем культуры» (PCF) в начале18-го культурного периода. В то время как повреждение со временем обратилось вспять в наших роговицах и все же было постоянным в их случае, это может быть связано с тем, что их метод требовал ранения большей площади роговицы. Наблюдение более распространенного периферического окрашивания трипана в дистрофических роговицах может указывать на то, что дистрофические роговицы более восприимчивы к гибели эндотелиальных клеток, чем здоровые роговицы. Хотя точная причина этой гибели клеток еще не выяснена, мы считаем, что маловероятно, что этот вопрос будет иметь отношение к роговице человека in vivo. Насколько нам известно, о повреждении периферического эндотелия не сообщалось ни в одном клиническом тематическом исследовании DSO, предполагая, что это явление является уникальным для донорской роговицы, культивируемой ex vivo 6,8,10,11,21. За исключением двух случаев, когда окрашивались только контрольные роговицы, все наблюдения периферического окрашивания были парными, поэтому маловероятно, что причиной было воздействие eFGF1 (NM141). Однако возможно, что в этих случаях лечение могло обеспечить защитный эффект против повреждения, которое в противном случае вызвало бы периферическое окрашивание обеих роговиц. Необходимы дальнейшие исследования этой гипотезы.

Другим ограничением этого метода является поиск донорской роговицы, представляющей фенотип FECD, для которого предназначен DSO. Донорские роговицы любого рода скудны, поэтому необходимо хирургическое вмешательство, которое позволяет избежать использования донорской ткани. Для наших целей единственными доступными роговицами являются те, которые отторгнуты от трансплантации по разным причинам. Глазные банки дополнительно классифицируют эти роговицы как нормальные или дистрофические на основе критериев, включая наличие гутт, низкий или неизмеримый ECD и нерегулярную морфологию CEC. Подтверждение дистрофического диагноза до принятия ткани из глазного банка также практически невозможно, поскольку история болезни большинства доноров не включает в себя прошлую глазную историю, и единственная предоставленная информация – это значение ECD, заметки техника и в некоторых случаях репрезентативное зеркальное изображение. Дистрофические роговицы, полученные для этого исследования, не показали сливающихся центральных гуттов при конфокальной микроскопии, выполненной после завершения периода культивирования, предполагая, что они могут представлять собой «ранние» стадии FECD. Мы не ожидаем, что это окажет значительное влияние на последствия исследования, поскольку целью DSO является удаление сливающихся областей гутт, позволяя здоровым периферическим клеткам мигрировать внутрь.

Этот метод обеспечивает высокоприменимый и воспроизводимый метод оценки агентов, которые могут повлиять на распространение и миграцию ЦИК. Модель имеет несколько особенностей, которые делают ее более физиологически значимой, чем модели in vitro, которые включают культивируемые CEC, даже если они посеяны на трансплантат ткани роговицы человека 22,23,24. Во-первых, CEC, подлежащие стимуляции, находятся в монослое точно так же, как они существуют в глазу пациента, и мигрируют через строму роговицы, как и после клинического DSO. Строма, о которой идет речь, принадлежит тому же пациенту, что и CEC, таким образом, контролируя потенциальные стромальные различия, связанные с FECD. Нет необходимости эксплантировать, диссоциировать и расширять культуры CEC с соответствующими проблемами и потенциалом для эндотелиального перехода в мезенхимальный переход (EnMT) в процессе культивирования. Описанный протокол сам по себе очень похож на клиническую процедуру DSO. Хотя он обходит этапы культивирования и расширения, этот метод имеет ограничение, что продолжительность исследования ограничена набуханием роговицы, так как эпителиальный слой не поддерживается. Это мешает нам исследовать морфологию CEC, которые мигрировали, чтобы покрыть очищенную область, оставляя неясным, будут ли они в конечном итоге перестраиваться в гексагональный массив в этой модели. Garcin et al. разработали одно потенциальное решение с их активной машиной хранения (ASM), устройством, которое, как показано, сохраняет роговицу в культуре до 3 месяцев со значительно меньшим отеком, чем роговица, поддерживаемая в традиционной культуре органов25. Такое устройство может быть полезно для воспроизведения и расширения этой работы.

Эта модель имеет потенциальную полезность для тестирования других методов заживления ран (например, ингибиторов ROCK), оценки модификаций хирургической техники и сравнения заживления в разных популяциях доноров или стадиях заболевания. Мы надеемся, что это исследование в сочетании с данными клинических испытаний по мере их появления побуждает клиницистов рассматривать DSO в качестве ценного варианта лечения для своих пациентов с FECD.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансирование этой работы было поддержано Trefoil Therapeutics и NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Авторы хотели бы поблагодарить Тони Вонга за советы и услуги по гистопатологии, Центр визуализации Nikon в Калифорнийском университете в Сан-Диего за использование их конфокального микроскопа и докторов Натали Афшари и Мариан Максай за их советы по хирургической технике. Кроме того, авторы выражают благодарность донорам глаз и глазных банков за предоставление роговицы.

Materials

0.2µm sterile 1000 mL filter units VWR 10040-440
0.2µm sterile 250 mL filter units VWR 10040-464
0.2µm sterile 500 mL filter units VWR 10040-436
10mL syringe Luer-Lok Tip Becton Dickinson 302995
12 well tissue culture treated plate Corning 3513
15 mL conical Tubes VWR 89039-668
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
2mL aspirating pipette VWR 414004-265
310 direct heat CO2 incubator Forma Scientific 13-998-082 Set to 37°C, 6% CO2
50 mL conical tubes VWR 89039-660
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) Thermo Scientific C10337
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes VWR 89130-896, -898,  -900, -902
6 well tissue culture treated plate Corning 3516
70% ethanol BDH BDH1164-4LP
Alexa Fluor 488 azide Thermo Scientific A10266
Alizarin Red S Sigma A5533-25G
Analytical balance Sartorious R200D
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) Thermo Scientific 15240-062
Anti-magnetic stainless steel forceps Excelta 7-SA
Bottle top dispenser Ward's Science 470134-946
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP9700-100
Calcium chloride (CaCl) Amresco 1B1110-500G
Chex-all II sterilzation pouches Propperman  24008
Cirpofloxacin hydrochloride Alfa Aesar J61970
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) Sigma 469130-50g
Dissecting microscope Nikon SMZ1270
Dry vacuum pump Welch 2019B-01
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific A31606-01
Frosted micro slides VWR 48311-703
Galaxy miniStar microcentrifuge VWR C1413, VWR
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Scientific A32727
Goat serum Sigma G9023
Haemo-Sol detergent Haemo-Sol International LLC 026-050
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Thermo Scientific H3570
Hot plate/stirrer Corning PC-320
Human corneas Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank NA
Hydrochloric acid (HCl) BDH BDH7204
ImageJ National Institute of Health Version 1.52a
Infinity 3s microscopy camera Lumenera 1URCAP2
Infinity analyze software Lumenera Version 6.5.5
Insulin transferrin selenium (ITS) Corning 41400-045
Iris scissors, 11 cm World Precision Instruments 501264-G
L- Ascorbic acid Sigma A4544-25G
Manual single channel pipet Rainin  17014-392, -391, -382
Needle PrecisionGlide 30G Becton Dickinson 305106
N-Met141 TTHX1114 Biopharmaceutical Development Program NA
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) Thermo Scientific 51985-034
Orion Star A211 pH meter Thermo Scientific STARA211
Petri dishes VWR 89107-632
Potassium chloride (KCl) BDH BDH9258-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) VWR 0781-500G
Powerpette plus pipet controller VWR 75856-456
Precision water bath 188 Precision Scientific Incorporated WB05 Set to 37°C
Purifier Class II model biosafety cabinet Labconco 36213043726
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363212
Scalpel size 22 stainless steel  Sklar 446479
Sodium chloride (NaCl) VWR 2041-2.5K
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 0404-1KG
Standard shaker VWR 89032-092
Standard solid refrigerator VWR 10820-402 Set to 4°C
Sterilmatic autoclave Market Forge STM-EL
Syringe filters VWR 28145-477
Test tube rocker Thermo Scientific M48725Q
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm Sklar 96-1146
Trypan Blue Thermo Scientific 15250-061
Tween-20 Sigma P7949-100mL
Vibrance antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories Inc. H-1800
VistaVision cover glasses, no. 1 VWR 16004-098
Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) Thermo Scientific 33-9100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. Fuchs’ corneal dystrophy. Expert Review of Ophthalmology. 5 (2), 147-159 (2010).
  2. Ku, B., et al. Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).
  3. Gain, P., et al. Global survey of corneal transplantation and eye banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  4. Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. Corneal edema resolution after "descemetorhexis&#34. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).
  5. Pan, J. C., Eong, K. G. A. Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent ‘descemetorhexis’ during cataract surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).
  6. Shah, R. D., et al. Spontaneous corneal clearing after Descemet’s stripping without endothelial replacement. Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).
  7. Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).
  8. Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 37 (12), 1497 (2018).
  9. Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).
  10. Macsai, M. S., Shiloach, M. Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only. Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).
  11. Moloney, G., et al. Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil. Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).
  12. Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).
  13. Landshman, N., et al. Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor. Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).
  14. Lee, J., Blaber, M. Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond. Journal of Proteins & Proteomics. 1, 37-42 (2010).
  15. Xia, X., et al. Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for "second generation" therapeutic application. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).
  16. Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).
  17. TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&draw=2&rank=2 (2020)
  18. Soh, Y. Q., et al. Predicative factors for corneal endothelial cell migration). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).
  19. van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells. Archives of Ophthalmology. 122, (2004).
  20. Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty. Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).
  21. Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty. Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).
  22. Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma. Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).
  23. Rolev, K., OʼDonovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model. Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).
  24. Spinozzi, D., et al. In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers. Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).
  25. Garcin, T., et al. Three-month storage of human corneas in an active storage machine. Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).

Tags

Corneal Organ CultureDescemet’s Stripping Only (DSO)Fuch’s Endothelial Corneal Dystrophy (FECD)Engineered Fibroblast Growth Factor 1Endothelial KeratoplastyCorneal Endothelial CellsDescemet’s MembraneCorneal GuttaeWound HealingCorneal Transplantation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pizzuto, S., Duffey, G., Weant, J., Eveleth, D. A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet’s Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1. J. Vis. Exp. (185), e63482, doi:10.3791/63482 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image