操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

この実験は、最も容易に入手できる10組の正常な研究用角膜で最初に実施された。この方法が成功することが示されると、この研究は、スペキュラー評価に基づいてアイバンクによってそのように標識された11対のジストロフィー性角膜において複製され、FECD患者集団を代表する角膜におけるeFGF1(NM141)の影響を研究した。より大きな臨床的関連性のために、本研究に含まれる数値は、特に断りのない限り、ジストロフィー性角膜から収集されたデータを表す。 DSOの外科的転帰をシミュレートした後、トリパンブルー染色を行い、14日間の培養期間を通して繰り返し、陽性染色の減少を定量化し、創傷治癒を評価した(図2)。アリザリンレッド染色も14日目に行い、細胞の境界を描写した。明確なパターンが見えない濃い赤色の領域(以下、陰性染色と呼ぶ)は、病変の治癒していない部分および細胞が損傷または欠損していると推定される角膜の他の領域に一貫して現れた。14日目にトリパンブルーに対して陽性に染色された領域は、アリザリンレッドによる陰性染色と良好に一致した(図2)。eFGF1(NM141)で処置した全てのジストロフィー性角膜は、未処置の交配者と比較して14日目に大きな治癒を示した。平均して、処置された角膜は、対照角膜では38%に対して91%の治癒を示し、この差は統計的に有意であった(p<0.001)(図3A)。これは、対照が平均32%の治癒を示し、治療された角膜が81%に達した20の正常な角膜から得られた結果に匹敵し、これもまた統計的に有意であった(p<0.001)(補足図1)。治癒率は、等分散を仮定した2つのサンプルt検定を用いて正常角膜とジストロフィー角膜の間で比較されたが、対照群または治療群のいずれにおいても有意差は見られなかった(データは示さず)。 正常角膜とジストロフィー角膜の両方についてアイバンクによって提供されたドナー情報(表1)を分析し、年齢、オプチゾールに保存された日数、死から採取間隔、細胞密度、および性別を含む特性が治癒と相関するかどうかを決定した。ピアソンの相関係数(r)は、性別を除くすべての因子を調査するために使用され、男性と女性の間で治癒を比較するために不対のt検定を使用して評価された。rの絶対値はすべての症例で0.25未満であり、治癒と年齢、オプチゾールに保存された日数、死から収集間隔、または細胞密度の間の相関は無視できると考えられたことを示している。男性と女性の治癒の差は統計的に有意ではなかった(p = 0.53)。 正常データセットと同様に、22個のジストロフィー性角膜のうち10個が、少なくとも1つの時点(通常は3日目)において病変内の染色領域に接続された剥離領域の外側に顕著なトリパン染色を提示した観察を末梢染色と呼んだ(図4A)。それらの10のうち、2つだけが対照角膜であり、その治療された対応物は同じ効果を示さなかった。残りの8つはすべて一致したペアであり、同じ個体からの角膜間で同様の重症度を示した。染色パターンは正常角膜とジストロフィー角膜で同等であったが、末梢染色の頻度は、正常群の25%と比較して、角膜陽性の45%を有するジストロフィーデータセットにおいて高かった。図4Aは、末梢染色に対して陽性と考えられた一対を示し、病変の外側の染色領域がDay6画像において創傷縁部を満たし、徐々に後退した。対応するアリザリンレッド画像では、末梢トリパン染色を受けた領域の細胞は、剥離された領域に遊走した細胞とよく似て拡大し、異常な形状に見え、陰性染色は14日目にトリパンブルーが存在した領域と相関していた。培養期間を通して影響を受けた角膜の大部分にもかかわらず、染色された周囲の部分的または完全な除去は、10の角膜すべてで起こった。さらに、14日目に治癒した最終パーセントは、1つの角膜を除くすべての角膜について、治療群ごとに正常範囲内であった。外れ値(0811L、図4Aに写真)は、14日目に病変領域にまだ接続していた末梢染色の残骸のために、負の治癒パーセント値を返した(図3Aおよび図4A)。遠周染色と呼ばれる第2の染色パターンは、図4Bのアリザリンレッド画像でキャプチャされたが、多くの角膜における培養期間を通してトリパンブルー画像でも明らかであった(図4B)。この観察は、辺縁部の周りの暗い染色のリングによって特徴付けられ、妥協した内皮を示す。この用語にもかかわらず、このパターンは正常角膜およびジストロフィー角膜の両方で非常に一般的であったため、末梢染色に対して陽性としてカウントされなかった。これらの画像では、対照角膜は、培養期間の初期に同様の重症度および染色パターンを有していたにもかかわらず、14日目により鮮やかで広範な染色を示した。また、処理された角膜には、一見多くの細胞があり、対照と比較してよりコンパクトで六角形に見えたが、これらの観察は定量的に測定されなかった。末梢の曲率のために、剥離された領域内およびそのすぐ周囲のトリパン染色のみが定量分析に含まれていた。パーセント染色値をすべてのジストロフィー角膜で平均化した場合、末梢染色の出現は、末梢染色があまり一般的ではなかった正常な角膜で見られる着実な減少とは対照的に、0日目のそれよりも初期の増加をもたらした(図3B)。 共焦点イメージングによって可視化された免疫組織化学は、病変縁部およびその周辺におけるCECタイトジャンクションの機能マーカーであるZO-1の半組織化発現を明らかにし(図5)、アリザリンレッド染色によって同様に証明されたパターンである(図2 および 図4)。プレオモルフィズムおよび多重症は、ほとんどのジストロフィー性角膜においてZO-1によって見える。しかし、この観察は、それらの罹患状態に起因する可能性があり、培養前の角膜の鏡面検査時に眼盤によって認められた。無秩序なZO−1発現は、細胞が内側に移動していた処置角膜の病変領域内で観察され、また、アリザリンレッドパターンと一致する。EdU取り込み細胞は、対照および処置角膜における病変部の境界および病変領域の内側に見ることができる(図5)。遊走したCECのパターンはまた、対照角膜においてほとんどの細胞が病変縁部の2つの野内に見出されたトリパンブルーの結果を反映しているが、治療された角膜中のCECは剥離領域全体に見られる(図2)。 この研究において定性的尺度としてEdU標識を実施したところ、増殖が治癒に寄与したことを確認した。しかし、EdUを取り込んだ細胞の定量は、角膜腫脹のために、病変部内および病変部周辺で一貫した複製可能な画像が撮影されるのを妨げるため、体系的に行うことができなかった。代理として、DSOモデルの確立前に実施された研究で実施された定量分析が、増殖に対するeFGF-1(NM141)の効果を実証するために含まれていた(図6)。正常なヒトドナー角膜をメスを用いて四分の一に切断し、前述のようにeFGF1(NM141)の有無にかかわらず48時間、EdUの存在下で培養した(Eveleth, 2020)16。ヘキスト33342およびEdU標識細胞のイメージングおよびその後の分析は、角膜を切断した場所から3つの視野内の四分の一の邪魔されない中間ゾーンおよびエッジゾーンで別々に実施した。中間ゾーンでは、EdUを組み込んだ細胞の割合が低く、分析された10個の角膜にわたって非常に変動した。平均して、eFGF1(NM141)で治療された四半期は、対照(1.8%±2.9%)と比較して、中間ゾーン(4.1%±7.9%)でEdUの取り込みレベルが高かったが、この差は統計的に有意ではなかった(p = 0.239)。創傷縁部において、eFGF1で刺激された処置区(NM141)は、対照区(10%±9.6%、p = 0.012)と比較して、平均化(18.1%±11.5%)した場合、有意に高いEdU取り込み率を示した。 表1:この研究で使用した22個のジストロフィーおよび20個の正常角膜、ならびに以前にEdU定量に使用した10個の正常角膜のドナー情報。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図2:デスメのストリッピング後の角膜の生命色素染色。 ジストロフィー性ヒト角膜をデスメ膜の中央4mmから剥離し、eFGF1(NM141)(100ng/mL)の有無にかかわらず14日間インキュベートした。病変は、0日目、3日目、6日目、9日目、12日目、および14日目にトリパンブルー染色によって可視化した。CECの境界線は、14日目にアリザリンレッド染色によって視覚化された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:ジストロフィー性ヒト角膜は、eFGF1(NM141)と共に培養した場合、DSOからの有意に大きな治癒を示す 。 (A)治癒率は、ImageJを用いて14日目の染色領域を測定し、それを0日目に染色されたパーセントと比較することによって決定された。(B)経時的にグラフ化された染色された平均パーセントは、末梢染色のより高い有病率のためにジストロフィー性角膜において3日目にピークを迎える一方で、正常な角膜の一貫した減少を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:末梢染色によるジストロフィー性角膜のバイタル色素染色。 (A)無傷のデスメ膜のトリパン染色は、中心に向かって進行し、その後、対照および処理された角膜の両方で経時的に消去されるのを見ることができる。(B)辺縁部の周りのアリザリンパターンは、多くのドナー角膜(この場合はジストロフィー)に見られる内皮の末梢損傷および無秩序な再確立の典型的な観察を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:剥離ジストロフィー角膜におけるeFGF1(NM141)によるCECsの遊走および増殖の刺激。 ZO-1(赤)、EdU(緑)、およびヘキスト33342(青)について染色されたデスメの剥ぎ取られた角膜の共焦点顕微鏡写真。点線は病変のエッジを表し、画像の左側に剥ぎ取られた領域があり、右側に無傷のデスメの膜があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:メスを用いて分光した正常角膜からの増殖細胞の定量を、eFGF-1(NM141)の有無にかかわらずEdUを含む培地中で48時間インキュベートした。 四分の一を、乱れのない中間ゾーンおよび切断エッジに沿って3連で画像化し、カウントを平均して、ミッドゾーンおよびエッジゾーンにEdUを組み込んだ細胞の割合を決定した。 Journal of Ocular Pharmacology and Therapeuticsから改変された図は、許可を得て使用 16. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1:正常なヒト角膜は、eFGF1(NM141)で培養した場合にDSOから有意に大きな治癒を示す。 ImageJは、染色された領域を測定し、治癒率を決定するために使用された。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。