JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

מודל תרבית איברי הקרנית האנושית של הפשטת Descemet רק עם ריפוי מואץ מגורה על ידי גורם גדילה פיברובלסט מהונדס 1

Published: July 22, 2022
doi:
10.3791/63482
, , ,
1Trefoil Therapeutics, Inc.

Summary

Stripping Only של Descemet הוא הליך ניסיוני שבו מטופלים עם גוטה מרכזית של הקרנית כתוצאה מדיסטרופיה של האנדותל של פוקס פשטו את הממברנה של Descemet עבור תאים היקפיים כדי לחדש את שכבת האנדותל. אנו מציגים מתודולוגיה חדשנית המדמה DSO בקרניות אנושיות דיסטרופיות ex vivo עם ריפוי מואץ המעורר על ידי eFGF1 (NM141).

Abstract

ניוון קרנית אנדותליאלית פוקס (FECD) נובע מתאי אנדותל בקרנית לא מתפקדים (CECs) ומטופל כיום על ידי השתלת הקרנית כולה או קרום Descemet. התפתחויות אחרונות בניתוחי עיניים ביססו את ה-Stripping Only (DSO) של Descemet, טכניקה כירורגית שבה מסירים מעגל מרכזי של קרום Descemet צפוף-גוטה כדי לאפשר נדידה של CECs אל הסטרומה החלקה, תוך החזרת התפקוד והראייה לקרנית. בעוד שאופציית טיפול פוטנציאלית זו מעוררת עניין רב בתחום המחקר האופתלמי, לא נקבעו מודלים מוצלחים של ex vivo של DSO והנתונים הקליניים מוגבלים. עבודה זו מציגה מודל חדשני לריפוי פצעים המדמה DSO בקרניות של תורמים אנושיים. תוך שימוש בגישה זו כדי להעריך את היעילות של FGF1 המהונדס על ידי האדם (NM141), מצאנו שהטיפול האיץ את הריפוי באמצעות גירוי של הגירה והתפשטות של CECs. ממצא זה אושש ב-11 זוגות של קרניות אנושיות עם סימני ניוון שדווחו על ידי בנקי העיניים על מנת לוודא שניתן לשכפל את התוצאות הללו בחולים עם ניוון פוקס, כאוכלוסיית היעד של הליך ה-DSO.

Introduction

ניוון הקרנית האנדותל של פוקס (FECD) היא מחלה המאופיינת באובדן תפקוד המשאבה בתאי האנדותל הקרנית (CECs) ובהצטברות מוגזמת של קולגן וחלבוני מטריצה חוץ-תאיים אחרים על פני הממברנה של Descemet, היוצרים את גוטה הקרנית1. הטיפול הידוע היחיד ב- FECD הוא קרטופלסטיה אנדותליאלית בצורות שונות, שכולן מגיעות עם סיכון לדחייה ואובדן תאי אנדותל2. בעוד שההתקדמות בניתוחי עיניים אפשרה להליכים אלה להפוך לפחות פולשניים עם הזמן, כל צורה של השתלה מגיעה עם סיכון לדחייה ואפשרות לשימוש בסטרואידים לכל החיים, טיפול עם תופעות לוואי מקבילות משלו. יתר על כן, המחסור העולמי ברקמות תורמים הוא כזה שרק קרנית תורמת אחת זמינה לכל 70 חולים הזקוקיםל-3. לאור האתגרים הללו, חוקרים וקלינאים בוחנים שיטות כירורגיות שמונעות לחלוטין את הצורך ברקמות תורמות. אחת מטכניקות הניסוי הללו היא Stripping Only (DSO) של Descemet או Descemetorhexis ללא קרטופלסטיה אנדותלית (DWEK), שבה חולי FECD עם guttae הממוקמים במרכז הקרנית כוללים מעגל מרכזי של 4 מ”מ של קרום Descemet מופשט ללא מיקום השתל. הסרת המעיים מעודדת תאים היקפיים בריאים לנדוד פנימה ולתקן את חד-שכבת האנדותל, ובסופו של דבר להפוך את הבצקת הסטרומלית ולשפר את הראייה. הרעיון תואר במקור בסדרה של מקרי בוחן שבהם חולים עברו ניתוח שהיה מסובך על ידי ניתוק הממברנה של Descemet, אך ריפוד CEC עדיין התרחש 4,5,6,7. למרות שיש יתרונות רבים לשיטה זו, תהליך הריפוי הוא ארוך ולא עקבי, שכן חלק מהחולים זקוקים להשתלת הצלה אם לא נראה ריפוי בחודשים שלאחר הניתוח8. מסיבות אלה, תרופה המעודדת הגירה ותפוצתם המהירה יותר של CECs עשויה להועיל בתהליך ההחלמה של חולי FECD שעברו DSO.

מספר מחקרים שנערכו לאחרונה העריכו מעכבי ROCK כטיפול משלים לחולים שעברו DSO, ומצאו כי חולים שטופלו החלימו מהר יותר והיו בעלי צפיפות גבוהה יותר של תאי אנדותל מרכזיים (ECD) מאשר אלה בקבוצת DSO בלבד 9,10,11. עם זאת, בשל גודלי מדגם קטנים והבדלים בין משטרי המינון, נדרשים נתונים נוספים כדי להבין טוב יותר את היעילות של מעכבי ROCK בסביבה זו.

גורמי גדילה פיברובלסטים הוכחו גם כמעודדים התחדשות של אנדותל הקרנית הן במבחנה עם CECs בקר, והן in vivo בקרניותחתוליות 12,13. eFGF1 (NM141) היא גרסה מהונדסת של FGF-1 המכילה מספר תחליפי חומצות אמינו לייצוב המולקולה, בניגוד ל-FGF-1 המקורי, בעל זמן מחצית חיים קצר בהרבהשל 14,15. הוכחנו בעבר את היכולת של eFGF1 (NM141) לעורר התפשטות של CECs ex vivo בקרניות אנושיות רבעוניות16. מחקר זה ביקש לשפר את העבודה הזו על ידי ביסוס המודל המוצלח הראשון של ex vivo של DSO בקרניות נורמליות ודיסטרופיות כאחד כדי לקבוע אם טיפולים משלימים כגון eFGF1 (NM141) מאיצים את הריפוי ביישום זה.

Protocol

עבודה זו השתמשה בדגימות קיימות ללא זיהוי של נבדקים והיא פטורה מאישור IRB תחת 45 CFR 46.101(b)(4). קרניות של תורמים אנושיים התקבלו מבנקים שונים של עיניים ברחבי ארה”ב (ראו טבלת חומרים). קרניות נשפטו באופן אינדיבידואלי כדיסטרופיות על ידי בנקי העיניים בהתבסס על ממצאים כגון guttae, פליאומורפיזם, פולימגתיזם ו / או ECD נמוך לאחר הערכה ספקולרית. איור 1 מציג את הכתם הכחול של טריפאן בקרנית במהלך יצירת הפצע, מיד לאחר ההפשטה, ולאחר שבועיים בתרבית. איור 1: דיאגרמה המייצגת את הקרנית במהלך יצירת הפצע, מיד לאחר ההפשטה, ולאחר 14 יום בתרבות כפי שהודגם על ידי טריפאן בלו. הירידה בשטח המוכתם בין נקודות זמן אלה נמדדה כדי לקבוע את רמת הריפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 1. יצירת פצעים באמצעות מלקחיים סטריליים, מוציאים את הקרנית מהתקשורת ושוטפים 1x PBS כדי להסיר שאריות של מדיה ופסולת תאים. לאחר השטיפה, מניחים את צד האנדותל של הקרנית על מכסה של צלחת פטרי. פיפט 30 μL של טריפאן כחול לתוך צלחת היטב. טובלים אגרוף ביופסיה חדש בקוטר 4 מ”מ בכחול טריפאן ומנצלים כל עודף. באמצעות שתי הידיים, מקם את האגרוף מעל מרכז הקרנית והורד אותו היישר אל משטח האנדותל, תוך הפעלת לחץ מינימלי. מבלי לשנות את המיקום או הלחץ על הקרנית, העבירו את האגרוף ליד אחת והושיטו יד למלקחיים עם היד שזה עתה השתחררה. השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את הקרנית במקומה תוך כדי סיבוב עדין של אגרוף הביופסיה כ-90° קדימה ואחורה מספר פעמים. הרימו את האגרוף היישר מהקרנית והניחו בצד. יש לשטוף פעם נוספת ב-1x PBS כדי להסיר עודף טריפאן כחול. 2. ההפשטה של דסמט מעבירים קרנית על מכסה צלחת פטרי להיקף ניתוח.הערה: אין להשאיר את הקרנית יבשה יותר מ-5 דקות. אם יש צורך בזמן נוסף להשלמת התהליך, יש לשטוף שוב ב-1x PBS כדי לייבש מחדש את האנדותל. כשהם מחזיקים את הקרנית במקומה עם מלקחיים מעוקלים, מבקיעים את קרום דסמט על ידי גרירה קלה של קצה מחט חדה של 30 גרם לאורך הטבעת של טריפאן בלו שהותיר אגרוף הביופסיה. השתמש בלחץ מינימלי כדי למנוע הפרעה לסטרומה הבסיסית. בעזרת וו סינסקי, השתמשו בתנועות סקופ עדינות כדי להרים ולקלף בחזרה את הקרום של Descemet סביב קצה הפצע, תוך עבודה לכיוון מרכז הנגע.הערה: הממברנה של Descemet צריכה לבוא עם מעט מאוד התנגדות. אם חווים קושי, סביר להניח שאדם מושך את הסטרומה למעלה. אם זה קורה, התחילו שוב, תוך הרמה מנקודה חדשה לאורך קצה הפצע. לאחר שרוב הממברנה של Descemet הופרדה מהסטרומה, השתמש במלקחיים של Gorovoy כדי להסיר את הממברנה ולהניח בצד. בדוק את האזור המופשט עבור כל פיסות הממברנה הנותרות והסר עם מלקחיים Gorovoy. 3. טריפאן צביעה כחולה הערה: לאחר ההפשטה של Descemet, הכתימו את הקרנית בכחול טריפאן כדי לדמיין את אזור הפצע. מחזירים את הקרנית על מכסה צלחת פטרי לארון הבטיחות הביולוגית ושוטפים ב-1x PBS המכיל 0.01% (w/v) CaCl2 ו-MgCl2 כדי להסיר פסולת תאים ולהקל על היצמדות הדוקה של ה-CECs הנותרים לממברנה של Descemet שלם. מניחים את הקרנית בצלחת טובה ומכניסים פיפטה 30 μL של טריפאן בלו על שכבת האנדותל למשך 30 שניות. השתמש במלקחיים כדי לטלטל בעדינות את הקרנית כדי להבטיח שכל משטח האנדותל מכוסה. יש לשטוף את עודפי ה-Trypan Blue ב-1x PBS עם 0.01% (w/v) CaCl2 ו-MgCl2 ולדמות את הקרנית המוכתמת מתחת למיקרוסקופ ניתוח עבור נקודת הזמן של יום 0. ודאו שהקרנית מאוזנת כך שהאור מועבר באופן שווה לכל אורכו והמיקום ניתן לשכפול על פני נקודות זמן.הערה: ניתן להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את הקרנית במקום בזמן ההדמיה במידת הצורך. 4. תקופת התרבות קרניות תרבית בצלחת בעלת שישה בארות המכילה מדיה דלת סרום המורכבת מ- OptiMEM; 1x אינסולין, טרנספרין וסלניום; 1x אנטיביוטיקה/אנטימיקוטית; 0.02 מ”ג/מ”ל CaCl2; 0.2 מ”ג/מ”ל חומצה אסקורבית; ו-0.8% חום מושתק בסרום בקר עוברי. תרבית את הקרנית השמאלית ב-8 מ”ל של מדיה דלת סרום בלבד, ואת הקרנית הימנית ב-8 מ”ל של מדיה דלת סרום בתוספת 100 ננוגרם/מ”ל eFGF1 (NM141). דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 6% CO2 למשך 14 יום עם שינויי מדיה יומיים. חזור על הליך ההכתמה הכחולה של Trypan בימים 3, 6, 9, 12 ו- 14, ודמיין כל קרנית מיד לאחר ההכתמה. הקפד לשמור על עקביות בהגדרות המצלמה בכל נקודות הזמן. ביום ה-12, הוסיפו 10 μM EdU הן למדיה של שליטה והן למדיה עם תוספת eFGF1 (NM141) ולדגירה למשך 48 שעות כדי לתייג תאים מתרבים. חידוש מדיה עם EdU נוסף שוב ביום 13. ביום 14, 48 שעות לאחר הוספת EdU, כתם טריפאן וקרניות תמונה כרגיל, למעט במקום 1x PBS עם CaCl2 ו- MgCl2, השתמש ב- PBS רגיל 1x לשטיפות כדי למנוע מהסידן לקיים אינטראקציה עם הכתם האדום של אליזרין. 5. צביעה אדומה של אליזרין ביום ה-14, הכינו 5% אליעזרין אדום בתמיסת מלח של 0.9%.הערה: אליעזרין אדום לא יתמוסס לחלוטין בתמיסת מלח. עם השילוב, תמיסת מערבולת וסלע במשך שעה אחת לפחות. מערבולת פעם נוספת וסינון לפני השימוש כדי להסיר חלקיקים לא פתורים. לאחר השלמת הכתם וההדמיה של טריפאן, העבירו את הקרנית למנה טובה והוסיפו 200 μL Alizarin Red למשטח האנדותל של כל קרנית. כתם למשך 2 דקות, לאחר מכן יש לשטוף כל קרנית בצלחת פטרי של 1x PBS כדי להסיר עודף אליזארין אדום לפני שמניחים בצלחת של שש בארות מלאה מראש ב-8 מ”ל של 1x PBS למשך שתי שטיפות של 5 דקות. לאחר הכביסה השנייה, דמיינו את האזור המופשט של כל קרנית תחת מיקרוסקופ ניתוח.הערה: שלא כמו בהדמיית טריפאן, ניתן להשאיר קרניות ב-1x PBS כדי לדמות את צביעת אליזרין כדי למנוע מהן להתייבש במהלך התהליך. 6. קיבוע וחדירה לאחר שתמונות אליזרין צולמו, העבירו קרניות לצלחת של 12 בארות ושטפו ב-4 מ”ל של 1x PBS המכיל 0.05% Tween-20 (PBS-T) למשך 30 דקות כדי להסיר חלקיקים כלשהם מהרקמה לפני הקיבוע. קבעו את הקרנית ב-4 מ”ל של 4% PFA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חלחל לתאים במשך 5 דקות ב-4 מ”ל של 1x PBS המכיל 1% טריטון X-100, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים ב-4 מ”ל של PBS רגיל 1x למשך 30 דקות כל אחד. 7. אימונוהיסטוכימיה יש לחסום את הקרנית למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-4 מ”ל של 1x PBS המכילים 2% אלבומין בסרום בקר ו-2% סרום עיזים. דגירה ב-1 מ”ל של תמיסת חסימה המכילה 2.5 מיקרוגרם/מ”ל נוגדן ראשוני לעכבר נגד ZO-1 למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים ב-4 מ”ל של 1x PBS למשך 30 דקות כל אחת.הערה: ניתן להטות את הצלחת במהלך צביעת הנוגדנים כדי למזער את נפח הריאגנטים הדרושים. רק לוודא שהקרנית כולה שקועה לחלוטין בתמיסת נוגדנים. בצעו את תגובת EdU Click-iT באמצעות קוקטייל המכיל חומצה אסקורבית 0.88 מ”ג/מ”ל, 0.26 מ”ג/מ”ל CuSO4 ו-2.5 μM אלקסה פלואור 488 אזיד. הכן רכיבי תגובה מוסיפים 500 μL של 1x PBS ל-88 מ”ג של חומצה אסקורבית ומערבולת עד שהם מומסים. מוסיפים 840 μL של מים שעברו דה-יוניזציה ל-44 מ”ג של CuSO4 ומערבולת עד להמסה. הכינו קוקטייל על ידי הוספת הריאגנטים הבאים ל-6 מ”ל של 1x PBS בסדר זה, היפוך צינור לערבוב לאחר כל תוספת: 30 μL של תמיסת חומצה אסקורבית, 30 μL של תמיסת CuSO4 , ולאחר מכן 15 μL של Alexa Fluor 488הערה: לאחר ההכנה, פתרון זה רגיש לאור. עבור שאר הפרוטוקול, יש להגן על הקרניות מפני אור במידת האפשר. הוסיפו 1 מ”ל של קוקטייל תגובת EdU לכל קרנית והגיבו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. מוסיפים 4 מ”ל של 10 מיקרוגרם/מ”ל Hoechst 33342 לכל קרנית ומגיבים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שוטפים שלוש פעמים ב-1x PBS-T למשך 30 דקות כל אחד. דגירה ב-1 מ”ל של תמיסת חסימה המכילה 2 מיקרוגרם/מ”ל Alexa Fluor 555 עם התווית IgG נגד עכבר עזים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים ב-1x PBS-T למשך 30 דקות כל אחת. אחסן קרניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-4 מ”ל של 1x PBS עם 1% אנטי/אנטי, 0.1% ציפרופלוקסצין ו-0.1% אמפוטריצין B כדי למנוע צמיחה מיקרוביאלית. בעת ביצוע הדמיה קונפוקלית, הרכיבו קרניות שלמות ב-200 μL של מדיום הרכבה על מגלשות זכוכית עם כיסויים מודבקים כלפי מטה כדי לשטח. 8. ניתוח תמונות טריפאן בצע את כל ניתוח התמונות באמצעות תוכנת הקוד הפתוח ImageJ של NIH. פתח תמונה באמצעות קובץ > פתח ולחץ על תמונה > התאמת סף הצבע >. השתמש במחווני “גוון” כדי להקיף רק את הטווח הכחול ולהתאים את המחוון “בהירות” העליון כל הדרך שמאלה כדי לכלול יותר מהאזור המוכתם.הערה: אם פעולה זו גורמת לכלול חלקים מהתמונה שאינם מוכתמים ב-Trypan, ניתן להחזיר את המחוון “בהירות” לרמתו המקורית. כוונו באיטיות את המחוון “רוויה” העליון עד שהסף יתווה במדויק את האזור המוכתם.הערה: כדאי שיהיה עותק של התמונה המקורית פתוח להתייחסות במהלך תהליך זה. לחץ/י על הכפתור ״בחר ״ בתפריט ‘סף הצבע’, ולאחר מכן השתמש/י בכלי מברשת הבחירה כדי לבטל את הבחירה באזורים מחוץ לפצע שנאסף. לחץ על נתח > מדידה כדי לדווח על האזור המוכתם בפיקסלים. בטלו את הבחירה בכל המשתמשים בבחירת עריכה > > בחרו ללא, והשתמשו בכלי הבחירה הסגלגל כדי להתאים את הלימבוס באופן הדוק ככל האפשר, ולאחר מכן לחצו על ‘נתחו > מדידה’ כדי לדווח על שטח הקרנית בפיקסלים.הערה: ניתן להעלות את הבהירות באופן זמני כדי לסייע בהדמיה של הלימבוס אם חלק זה של התמונה כהה מדי. רשום את ערכי השטח וחלק את השטח המוכתם בשטח הקרנית כולה, ולאחר מכן הכפל ב-100 כדי לחשב את אחוז המוכתם. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות עבור כל תמונה, ולאחר מכן קח את הממוצע של שלוש המדידות. 9. ניתוח סטטיסטי לאחר שכל התמונות נותחו, חלקו את האחוז הממוצע המוכתם ביום 14 באחוזים המוכתמים ביום 0 כדי לקבוע את שאריות האזור הלא מנוצל. הפחת סכום זה מ-100% כדי לחשב את אחוז השטח המופשט שנרפא במשך 14 יום. השתמש במבחן t זוגי כדי להשוות בין ערכים שנרפאו באחוזים בין קבוצות ביקורת וטיפול.

Representative Results

ניסוי זה בוצע בתחילה ב-10 זוגות של קרניות מחקר רגילות, מכיוון שהן זמינות ביותר. לאחר שהשיטה הוכחה כמוצלחת, המחקר שוכפל ב-11 זוגות של קרניות דיסטרופיות – שסומנו ככאלה על ידי בנקי עיניים בהתבסס על הערכה ספקולרית – כדי לחקור את ההשפעות של eFGF1 (NM141) בקרניות המייצגות את אוכלוסיית חולי FECD. לקבלת רלוונטיות קלינית רבה יותר, הנתונים הכלולים בעבודה הנוכחית מייצגים נתונים שנאספו מקריניות דיסטרופיות, אלא אם כן צוין אחרת. לאחר הדמיית התוצאה הניתוחית של DSO, הכתמת טריפאן בכחול בוצעה וחזרה על עצמה לאורך כל תקופת התרבית בתרבית של 14 יום, וההפחתה בכתמים חיוביים כימתה כדי להעריך את ריפוי הפצע (איור 2). ביום ה-14 בוצעו גם כתמים אדומים של אליזרין כדי לתחם את גבולות התאים. אזורים אדומים כהים ללא דפוס ברור הנראה לעין (המכונים להלן צביעה שלילית) הופיעו באופן עקבי בתוך החלק הלא מחומם של הנגע ובאזורים אחרים בקרנית שבהם התאים היו ככל הנראה פגומים או חסרים. אזורים שהוכתמו כחיוביים לכחול טריפאן ביום 14 תאמו היטב את הכתם השלילי של עליזארין אדום (איור 2). כל הקרניות הדיסטרופיות שטופלו ב-eFGF1 (NM141) הראו ריפוי גדול יותר ביום ה-14 בהשוואה לבן הזוג שלא טופל. בממוצע, הקרניות שטופלו הדגימו ריפוי של 91% לעומת 38% בקרניות בקרה, וההבדל הזה היה מובהק סטטיסטית (עמ’ < 0.001) (איור 3A). זאת בהשוואה לתוצאות שהתקבלו מ-20 קרניות רגילות, שבהן הבקרות הראו כי ממוצע של 32% החלמה וטופלו בקרניות הגיעו ל-81%, מה ששוב היה מובהק סטטיסטית (עמ’ < 0.001) (איור משלים 1). אחוזי הריפוי הושוו בין קרניות נורמליות לדיסטרופיות באמצעות שתי בדיקות t מדגמיות בהנחה של שונות שווה, ולא נצפה הבדל משמעותי בקבוצת הביקורת או בקבוצות הטיפול (נתונים שלא הוצגו). מידע על תורמים שסופק על ידי בנקי עיניים (טבלה 1) עבור קרניות רגילות ודיסטרופיות נותח כדי לקבוע אם מאפיינים הכוללים גיל, ימים המאוחסנים באופטיזול, מרווח מוות לאיסוף, צפיפות תאים ומין מתואמים עם ריפוי. מקדם המתאם של פירסון (r) שימש לחקירת כל הגורמים למעט מין, אשר הוערך באמצעות מבחן t לא מזווג כדי להשוות ריפוי בין זכרים לנקבות. הערך המוחלט של r היה מתחת ל-0.25 בכל המקרים, מה שמצביע על כך שכל המתאמים בין ריפוי לגיל, ימים שאוחסנו באופטיזול, מוות למרווח איסוף או צפיפות תאים נחשבו זניחים. ההבדל בריפוי בין זכרים לנקבות לא היה מובהק סטטיסטית (p = 0.53). בדומה למערך הנתונים הרגיל, 10 מתוך 22 הקרניות הדיסטרופיות שהוצגו עם צביעת טריפאן בולטת מחוץ לאזור המופשט המחובר לאזור המוכתם בתוך הנגע בנקודת זמן אחת לפחות (בדרך כלל יום 3) – תצפית שכינינו צביעה היקפית (איור 4A). מתוך אותם 10, רק שתיים היו קרניות בקרה שעמיתיהן שטופלו לא הפגינו את אותה השפעה. שמונת הנותרים היו כולם זוגות תואמים והוצגו בחומרה דומה בין הקרניות מאותו אדם. למרות שדפוסי הכתם היו דומים בין קרניות רגילות לדיסטרופיות, תדירות הכתמים ההיקפיים הייתה גבוהה יותר במערך הנתונים הדיסטרופיים עם 45% מהקרניות החיוביות, לעומת 25% בקבוצה הרגילה. איור 4A מראה זוג שנחשב חיובי לצביעה היקפית, שכן האזור המוכתם מחוץ לנגע פגש את קצה הפצע בתמונות יום 6 ונסוג בהדרגה. בתמונות המקבילות של אליזרין אדום, תאים באזורים עם צביעת טריפאן היקפית נראו מוגדלים וצורתם לא תקינה, בדומה לתאים שנדדו לאזור המופשט, וכתמים שליליים מתואמים עם האזורים שבהם היה טריפאן כחול נוכח ביום 14. למרות החלק הגדול של הקרנית שנפגע לאורך תקופת התרבית, ניקוי חלקי או מלא של הפריפריה המוכתמת התרחש בכל 10 הקרניות. בנוסף, האחוזים האחרונים שנרפאו ביום 14 היו בטווח התקין, בהתאמה לקבוצת הטיפול, עבור כל הקרנית מלבד אחת. החריגה (0811L, בתמונה באיור 4A) החזירה ערך נרפא שלילי באחוזים עקב שרידים של כתמים היקפיים שעדיין התחברו לאזור הנגע ביום 14 (איור 3A ואיור 4A). תבנית צביעה שנייה, המכונה צביעה היקפית רחוקה, תועדה בתמונות של אליזרין אדום מאיור 4B, אך ניכרה גם בתמונות כחולות טריפאן לאורך כל תקופת התרבות בקרניות רבות (איור 4B). תצפית זו מאופיינת בטבעת של כתמים כהים סביב הלימבוס, המעידה על אנדותל פגום. למרות המונח, דפוס זה היה נפוץ כל כך בקרניות רגילות ודיסטרופיות, עד שהן לא נספרו כחיוביות לצביעה היקפית. בתמונות אלה, קרנית הבקרה הראתה כתמים עזים ונרחבים יותר ביום ה-14, למרות ששתי הקרניות היו בעלות חומרה ודפוס דומה של כתמים בתחילת תקופת התרבית. בקרנית שטופלה צוין גם מספר גדול יותר לכאורה של תאים, שנראו קומפקטיים ומשושים יותר בהשוואה לבקרה, אם כי תצפיות אלה לא נמדדו באופן כמותי. בשל העקמומיות בפריפריה, רק צביעת טריפאן בתוך ומיד סביב האזור המופשט נכללה בניתוח כמותי. כאשר ממוצע הערכים המוכתמים באחוזים בכל הקרניות הדיסטרופיות, הופעת הכתמים ההיקפיים הביאה לעלייה ראשונית מזו של יום 0, בניגוד לירידה המתמדת שנראתה בקרניות רגילות שבהן הכתמים ההיקפיים היו פחות נפוצים (איור 3B). אימונוהיסטוכימיה שהומחשה על ידי הדמיה קונפוקלית חושפת ביטוי מאורגן למחצה של ZO-1, סמן פונקציונלי של צמתים הדוקים של CEC, בתוך ומסביב לקצה הנגע (איור 5), דפוס שהוכח באופן דומה על ידי הכתם האדום של אליזרין (איור 2 ואיור 4). פליאומורפיזם ופולימגתיזם נראים על ידי ZO-1 ברוב הקרניות הדיסטרופיות; עם זאת, ניתן לייחס תצפית זו למצבם החולה והיא צוינה על ידי בנק העיניים בבדיקה ספקולרית של הקרניות לפני התרבות. ביטוי ZO-1 לא מאורגן נצפה באזור הנגע של קרניות מטופלות שבהן התאים נדדו פנימה, גם עולה בקנה אחד עם הדפוסים האדומים של אליזרין. ניתן לראות תאים המשלבים EdU סביב גבול הנגע ובתוך האזור הנגע בבקרה ובקרניות מטופלות (איור 5). התבנית של CECs נודדים משקפת גם את התוצאות של Tripan Blue, שבהן בקרניות בקרה רוב התאים נמצאו בתוך שני שדות של קצה הנגע, בעוד שניתן לראות CECs בקרניות מטופלות בכל האזור המופשט (איור 2). תיוג EdU בוצע כמדד איכותני במחקר זה כדי לאשר שהתפשטות תרמה לריפוי. עם זאת, לא ניתן היה לבצע כימות של תאים המשלבים EdU באופן שיטתי בשל נפיחות בקרנית שמנעה לכידת תמונות עקביות הניתנות לשכפול בתוך הנגע ובסביבתו. כפונדקאית, ניתוח כמותי שבוצע במחקר שנערך לפני הקמת מודל DSO נכלל כדי להדגים את ההשפעות של eFGF-1 (NM141) על שגשוג (איור 6). קרניות רגילות של תורמים אנושיים נחתכו לרבעים באמצעות אזמל והועתקו בתרבית בנוכחות EdU, עם או בלי eFGF1 (NM141) במשך 48 שעות כפי שתואר קודם לכן (Eveleth, 2020)16. הדמיה וניתוח מאוחר יותר של תאים מסומנים Hoechst 33342 ו-EdU בוצעו בנפרד באזור האמצע הלא מופרע של הרבעים ובאזור הקצה, בתוך שלושה שדות שמהם נחתכה הקרנית. באזור האמצע, אחוז התאים המשלבים EdU היה נמוך ומשתנה מאוד לאורך 10 הקרניות שנותחו. בממוצע, לרבעונים שטופלו ב-eFGF1 (NM141) היו רמות גבוהות יותר של שילוב EdU באזור האמצע (4.1% ± 7.9%) בהשוואה לבקרות (1.8% ± 2.9%), אם כי הבדל זה לא היה מובהק סטטיסטית (p = 0.239). בקצה הפצע, רבעונים מטופלים מגורה עם eFGF1 (NM141) הראו שיעורים גבוהים משמעותית של שילוב EdU כאשר הם ממוצעים (18.1% ± 11.5%) בהשוואה לרבעוני בקרה (10% ± 9.6%, p = 0.012). טבלה 1: מידע על תורמים עבור 22 קרניות דיסטרופיות ו-20 קרניות רגילות ששימשו במחקר זה, כמו גם 10 קרניות רגילות ששימשו בעבר לכמות EdU. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. איור 2: צביעה חיונית של צביעה של קרניות לאחר ההפשטה של Descemet. קרניות אנושיות דיסטרופיות הופשטו מה-4 מ”מ המרכזיים של הקרום של Descemet והודגמו עם או בלי eFGF1 (NM141) (100 ננוגרם/מ”ל) למשך 14 יום. נגעים הודגמו על ידי צביעת טריפאן כחולה בימים 0, 3, 6, 9, 12 ו -14. גבולות CEC צולמו על ידי צביעת אליזרין רד ביום ה-14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: קרניות אנושיות דיסטרופיות מראות ריפוי גדול יותר באופן משמעותי מ-DSO כאשר הן מתורבתות עם eFGF1 (NM141). (A) אחוזי הריפוי נקבעו על ידי מדידת האזור המוכתם ביום 14 באמצעות ImageJ והשוואתו לאחוז המוכתם ביום 0. (B) האחוזים המוכתמים הממוצעים בגרף לאורך זמן מראים ירידה עקבית בקרניות רגילות, בעודם מגיעים לשיאם ביום 3 בקרניות דיסטרופיות בשל השכיחות הגבוהה יותר של כתמים היקפיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: צביעה חיונית של קרניות דיסטרופיות עם כתמים היקפיים. (A) ניתן לראות צביעת טריפאן של קרום Descemet שלם מתקדמת לעבר המרכז, ואז מתבהרת עם הזמן הן בקרנית הבקרה והן בקרניות המטופלות. (B) דפוסי אליזרין סביב הלימבוס מייצגים תצפית אופיינית של נזק היקפי והתבססות מחדש לא מאורגנת של האנדותל שנראה בקרניות רבות של תורמים – במקרה זה דיסטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: גירוי של הגירה והתפשטות של CECs על-ידי eFGF1 (NM141) בקרניות דיסטרופיות מופשטות. מיקרוגרפים קונפוקליים של הקרניות המופשטות של Descemet מוכתמים עבור ZO-1 (אדום), EdU (ירוק) ו- Hoechst 33342 (כחול). הקו המקווקו מייצג את קצה הנגע עם האזור המופשט בצד שמאל של התמונה והממברנה השלמה של Descemet בצד ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: כמות של תאים מתרבים מהקרנית הרגילה מגודלת באמצעות אזמל ומדורגת במדיה המכילה EdU עם או בלי eFGF-1 (NM141) במשך 48 שעות. רבעים צולמו במשולש באזור האמצע הלא מופרע ולאורך קצה החתך, וספירתם הממוצעת נקבעה כדי לקבוע את אחוז התאים המשלבים EdU באזורי האמצע והקצה. האיור שונה מתוך כתב העת לפרמקולוגיה וטיפולים עיניים, שנעשה בו שימוש באישור16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור משלים 1: קרניות אנושיות רגילות מראות ריפוי גדול יותר באופן משמעותי מ-DSO כאשר הן מתורבתות עם eFGF1 (NM141). ImageJ שימש למדידת האזורים המוכתמים ולקבוע % ריפוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

לרופאי עיניים רבים יש חששות לגבי המלצה על DSO למטופלים שלהם משתי סיבות עיקריות: 1) תהליך הריפוי הממושך, ו-2) חוסר נתונים (DSO הוא מושג חדש בתחום ניתוחי עיניים). המחקר שהצגנו יהיה בעל תועלת רבה להקלה על שני החששות הללו. בהתבסס על נתונים ממחקר זה ואחרים, ה-FDA אישר ניסוי קליני שלב 2 שבו eFGF1 (NM141) יינתן בלוחות זמנים משתנים של מינון לחולים שעוברים DSO17.

השיטה שתוארה לעיל עוצבה לאחר מחקר שבוצע על ידי Soh et al., שבו ריפוי אנדותל הקרנית הוערך עם וללא מעכב ROCK Y-27632 בפצעים שרוטים ומקולפים18. בעוד ש-Y-27632 האיץ את התחדשות האנדותל כאשר הממברנה של Descemet עדיין שלמה, לא נמצא ריפוי משמעותי בפצעים מופשטים אפילו בטיפול. באמצעות טכניקת הפשטה דומה ולאחר מכן טיפול עם או בלי eFGF1 (NM141), התצפיות שמצאנו לא היו תואמות את אלה של סוה ועמיתיו. היעדרם של כתמים כחולים של טריפאן בקרניות מטופלות רבות ביום 14, ונוכחותם של צמתים הדוקים חיוביים של ZO-1 בתוך שכבת האנדותל המחודשת טוענים כי מחסום שלם, חלק מהתפקוד הטבעי של CEC, הוחזר בקרניות רגילות ודיסטרופיות כאחד. אף על פי שלא ניתן לכמתו במחקר זה, נוכחותם של תאים חיוביים ל-EdU באזור המופשט ובסביבתו מצביעה גם על התפשטות כמנגנון ריפוי, כזה שהקמנו בעבר שניתן לעורר על ידי eFGF1 (NM141) בקרניות פצועות16. ניתוח סטטיסטי הראה כי טיפול ב-eFGF1 (NM141) הביא לריפוי גדול יותר באופן משמעותי מ-DSO, בממוצע יותר מפי שניים מהקרניות הביקורתיות בנקודת הזמן של 14 יום. אף על פי ששיעורי הריפוי משתנים במידה מתונה בין פרטים – מאפיין אופייני של קרניות תורמות – השכפול של התוצאות על פני גודל מדגם גדול מעיד גם הוא על שיטה ניתנת למדידה גבוהה. למיטב ידיעתנו, אין דוגמאות אחרות למודל ההפשטה של אקס-ויוו דאסמט בספרות.

מרכיבים מרכזיים בפרוטוקול עצמו שישמשו כבעלי ערך לחוקרים אחרים שחוקרים DSO הם השימוש ב-Trypan Blue לזיהוי סטרומה חשופה, וטכניקת עיבוד התמונה המשמשת למדידת האזור המוכתם. טריפאן בלו משמש בדרך כלל בניתוחי עיניים, במיוחד כאשר עובדים עם הממברנה של Descemet כדי לזהות תאים שאינם בני קיימא ולסייע בנראות הרקמה. נקודות הזמן של הכתם הכלולות בפרוטוקול זה אפשרו צביעה חוזרת יעילה מבלי לחשוף יתר על המידה קרניות ל-Trypan Blue, שכן הוא הוכח כרעיל ל-CECs בריכוזים גבוהים19. צמצום השטח המוכתם במשך 14 יום בכל הקרניות, שאושר על ידי אליזרין אדום ואימונוהיסטוכימיה כתוצאה של CECs נודדים, מדגים שיטה פשוטה וניתנת לשחזור למדידת ריפוי. באמצעות תפריט סף הצבעים של ImageJ, אנליסטים מרובים אספו נתונים עם סטיות תקן באופן עקבי מתחת ל-1% (הנתונים לא מוצגים). למרות שתוכניות חלופיות עשויות לתפקד באופן דומה, ImageJ היא תוכנת קוד פתוח המסוגלת לייצר מדידות שטח מדויקות כדי לעקוב אחר ריפוי.

עם זאת, יש היבט אחד של פרוטוקול ההפשטה שמצאנו שהוא גם הכרחי ליצירת פצעים, וגם מפריע לתהליך הריפוי הכולל. שימוש במחט חדה של 30 גרם לציון הממברנה של Descemet לאורך הסימן שהותיר אגרוף הביופסיה מאפשר יצירת פצע חלק ועגול אשר מצוין על ידי קלינאים כתמיכה בריפוי מהיר יותר10. יחד עם זאת, צעד זה מזיק לקרנית, שכן הוא יכול ליצור קרעים בסיבים הסטרומליים הגורמים למוות של תאים סטרומליים, מעכבים נדידה של תאי אנדותל על פני קצה הפצע, וגורמים להיווצרות גושים המביאים לבצקת20 מתמשכת יותר לאחר הניתוח. קלינאים המבצעים DSO משתמשים בדרך כלל בוו סינסקי הפוך כדי ליזום את הפצע, אך ללא כל לחץ תוך עיני ששומר על הקרנית מתוחה, כלי זה פחות יעיל במודל ex vivo . כלי חלופי המסוגל לקרוע את הממברנה של Descemet מבלי לפגוע בסטרומה הבסיסית ישפר את הפרוטוקול, למשל את מכשיר ההשקיה והשאיפה המומלץ על ידי Macsai ו- Shiloach10. יהיה צורך בניסויים נוספים כדי לקבוע אם טכניקה זו תואמת את מודל ה- ex vivo .

אתגר שנראה טמון במודל ה-ex vivo הוא התופעה השכיחה של מוות CEC באזור ההיקפי לפצע, במיוחד בקרניות דיסטרופיות. כמות זו מטשטשת מדי פעם את כמות אזור הפצע, שכן הדיוק של כלי סף הצבע הופך מוגבל יותר ככל שהאזור המוכתם משתרע מעבר למרכז הקרנית, שם העקמומיות שלו גורמת להתפלגות אור לא אחידה. עם זאת, מדידות משתנים אלה התרחשו בעיקר בנקודות זמן מוקדמות יותר לפני שהכתמים ההיקפיים נסוגו בהדרגה כאשר CECs פגומים התפנו ותאים שכנים נמתחו, נדדו או התרבו כדי להחליף אותם. בנקודת הזמן האחרונה של 14 הימים האחרונים, האזור המוכתם התמקם בחזרה למרכז הקרנית, וכל התמונות היו ניתנות למדידה. תצפית דומה נעשתה בתדירות דומה על ידי Soh et al., כאשר חמישה מתוך 14 קרניות רגילות הציגו את מה שהם כינו ‘כשל תרבית מוקדם’ (PCF) בתחילת תקופת התרבות18. בעוד שהנזק התהפך עם הזמן בקרניות שלנו ובכל זאת היה קבוע במקרה שלהם, ניתן לייחס זאת לעובדה שהשיטה שלהם דרשה פציעה של שטח גדול יותר של הקרנית. התצפית על צביעת טריפאן היקפית נפוצה יותר בקרניות דיסטרופיות עשויה להצביע על כך שקרניות דיסטרופיות רגישות יותר למוות של תאי אנדותל מאשר קרניות בריאות. בעוד שהסיבה המדויקת למוות תאי זה טרם הובהרה, אנו מאמינים כי אין זה סביר שנושא זה יהיה רלוונטי לקרניות אנושיות in vivo. פגיעה באנדותל ההיקפי לא דווחה בשום מקרה בוחן קליני של DSO למיטב ידיעתנו, מה שמרמז על כך שתופעה זו ייחודית לקרניות תורמות מתורבתות ex vivo 6,8,10,11,21. מלבד שני מקרים שבהם רק קרניות בקרה מוכתמות, כל התצפיות על צביעה היקפית היו מזווגות, ולכן אין זה סביר שהסיבה הייתה חשיפה ל- eFGF1 (NM141). עם זאת, ייתכן שבמקרים אלה הטיפול סיפק אפקט מגן מפני הנזק שאחרת היה גורם לצביעה היקפית בשתי הקרניות. יש צורך בחקירה נוספת על השערה זו.

מגבלה נוספת לשיטה זו היא מיקור קרניות תורמות המייצגות את פנוטיפ FECD שעבורו מיועד DSO. קרניות תורמות מכל סוג שהוא הן נדירות, ומכאן הצורך בניתוח שימנע שימוש ברקמת התורם. לענייננו, הקרניות היחידות הזמינות הן אלה שנדחו מההשתלה מסיבות שונות. בנקי עיניים מסווגים עוד יותר את הקרניות הללו כנורמליות או דיסטרופיות על סמך קריטריונים הכוללים נוכחות של guttae, ECD נמוך או לא מדיד, ומורפולוגיה לא סדירה של CEC. אישור אבחנה דיסטרופית לפני קבלת רקמות מבנק עיניים הוא גם כמעט בלתי אפשרי, שכן ההיסטוריה הרפואית של רוב התורמים אינה כוללת היסטוריה של עיניים בעבר והמידע היחיד שסופק הוא ערך ה- ECD, הערות הטכנאי, ובמקרים מסוימים תמונה ספקולרית מייצגת. הקרניות הדיסטרופיות שהתקבלו עבור מחקר זה לא הראו גוטות מרכזיות מתמזגות במיקרוסקופיה קונפוקלית שבוצעה לאחר השלמת תקופת התרבית, מה שמרמז על כך שהן עשויות לייצג שלבים “מוקדמים” של FECD. איננו צופים שתהיה לכך השפעה משמעותית על השלכות המחקר, שכן מטרת ה-DSO היא להסיר אזורים מפגשיים של המעיים, ולאפשר לתאים היקפיים בריאים לנדוד פנימה.

שיטה זו מספקת טכניקה ישימה ביותר הניתנת לשחזור להערכת סוכנים שעשויים להשפיע על התפשטות והגירה של CEC. למודל יש מספר תכונות שהופכות אותו לרלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר מודלים במבחנה הכוללים CECs בתרבית, גם כאשר הם נזרעים על השתלת רקמת הקרנית האנושית 22,23,24. ראשית, המנכ”לים שיש לעורר נמצאים בחד-שכבתי בדיוק כפי שהם קיימים בעין המטופלת, והם נודדים על פני סטרומה הקרנית כפי שהיו נודדים לאחר DSO קליני. הסטרומה המדוברת היא מאותו חולה כמו ה-CECs, ובכך שולטת בהבדלים סטרומליים פוטנציאליים הקשורים ל-FECD. אין צורך להסביר, לנתק ולהרחיב תרבויות של CECs עם האתגרים והפוטנציאל הקשורים למעבר אנדותל למזנכימלי (EnMT) במהלך תהליך התרבות. הפרוטוקול המתואר עצמו דומה מאוד להליך ה- DSO הקליני. אמנם היא עוקפת את שלבי התרבית וההתפשטות, אך לשיטה זו יש מגבלה שמשך המחקר מוגבל על ידי נפיחות בקרנית, שכן שכבת האפיתל אינה נשמרת. זה מונע מאיתנו לחקור את המורפולוגיה של CECs שנדדו כדי לכסות את האזור המופשט, מה שמשאיר את זה לא ברור אם הם בסופו של דבר יתארגנו מחדש למערך משושה במודל זה. Garcin et al. פיתחו פתרון פוטנציאלי אחד עם מכונת האחסון הפעילה שלהם (ASM), מכשיר שהוכח כמי ששומר על קרניות בתרבית עד 3 חודשים עם פחות בצקת משמעותית מהקרניות שנשמרות בתרבית האיברים המסורתית25. מכשיר כזה עשוי להיות מועיל בשכפול והרחבה של עבודה זו.

למודל זה יש תועלת פוטנציאלית בבדיקת טיפולים אחרים לריפוי פצעים (למשל, מעכבי ROCK), הערכת שינויים בטכניקה כירורגית והשוואת ריפוי בין אוכלוסיות תורמים שונות או שלבי מחלה שונים. אנו מקווים שמחקר זה, בשילוב עם נתוני הניסויים הקליניים כפי שהם יוצאים, יעודד קלינאים לשקול את DSO כאפשרות טיפולית רבת ערך עבור מטופלי ה-FECD הזכאים להם.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המימון לעבודה זו נתמך על ידי Trefoil Therapeutics ו- NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. המחברים רוצים להודות לטוני וונג על הייעוץ והשירותים ההיסטופתולוגיים, למרכז ההדמיה של Nikon באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו על השימוש במיקרוסקופ הקונפוקלי שלהם, ולד”ר נטלי אפשארי ומריאן מקסאי על עצותיהם לגבי טכניקה כירורגית. בנוסף, המחברים מרחיבים את תודתם לתורמים של העיניים ולגנקים לעיניים על מתן קרניות.

Materials

0.2µm sterile 1000 mL filter units VWR 10040-440
0.2µm sterile 250 mL filter units VWR 10040-464
0.2µm sterile 500 mL filter units VWR 10040-436
10mL syringe Luer-Lok Tip Becton Dickinson 302995
12 well tissue culture treated plate Corning 3513
15 mL conical Tubes VWR 89039-668
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
2mL aspirating pipette VWR 414004-265
310 direct heat CO2 incubator Forma Scientific 13-998-082 Set to 37°C, 6% CO2
50 mL conical tubes VWR 89039-660
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) Thermo Scientific C10337
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes VWR 89130-896, -898,  -900, -902
6 well tissue culture treated plate Corning 3516
70% ethanol BDH BDH1164-4LP
Alexa Fluor 488 azide Thermo Scientific A10266
Alizarin Red S Sigma A5533-25G
Analytical balance Sartorious R200D
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) Thermo Scientific 15240-062
Anti-magnetic stainless steel forceps Excelta 7-SA
Bottle top dispenser Ward's Science 470134-946
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP9700-100
Calcium chloride (CaCl) Amresco 1B1110-500G
Chex-all II sterilzation pouches Propperman  24008
Cirpofloxacin hydrochloride Alfa Aesar J61970
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) Sigma 469130-50g
Dissecting microscope Nikon SMZ1270
Dry vacuum pump Welch 2019B-01
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific A31606-01
Frosted micro slides VWR 48311-703
Galaxy miniStar microcentrifuge VWR C1413, VWR
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Scientific A32727
Goat serum Sigma G9023
Haemo-Sol detergent Haemo-Sol International LLC 026-050
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Thermo Scientific H3570
Hot plate/stirrer Corning PC-320
Human corneas Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank NA
Hydrochloric acid (HCl) BDH BDH7204
ImageJ National Institute of Health Version 1.52a
Infinity 3s microscopy camera Lumenera 1URCAP2
Infinity analyze software Lumenera Version 6.5.5
Insulin transferrin selenium (ITS) Corning 41400-045
Iris scissors, 11 cm World Precision Instruments 501264-G
L- Ascorbic acid Sigma A4544-25G
Manual single channel pipet Rainin  17014-392, -391, -382
Needle PrecisionGlide 30G Becton Dickinson 305106
N-Met141 TTHX1114 Biopharmaceutical Development Program NA
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) Thermo Scientific 51985-034
Orion Star A211 pH meter Thermo Scientific STARA211
Petri dishes VWR 89107-632
Potassium chloride (KCl) BDH BDH9258-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) VWR 0781-500G
Powerpette plus pipet controller VWR 75856-456
Precision water bath 188 Precision Scientific Incorporated WB05 Set to 37°C
Purifier Class II model biosafety cabinet Labconco 36213043726
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363212
Scalpel size 22 stainless steel  Sklar 446479
Sodium chloride (NaCl) VWR 2041-2.5K
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 0404-1KG
Standard shaker VWR 89032-092
Standard solid refrigerator VWR 10820-402 Set to 4°C
Sterilmatic autoclave Market Forge STM-EL
Syringe filters VWR 28145-477
Test tube rocker Thermo Scientific M48725Q
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm Sklar 96-1146
Trypan Blue Thermo Scientific 15250-061
Tween-20 Sigma P7949-100mL
Vibrance antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories Inc. H-1800
VistaVision cover glasses, no. 1 VWR 16004-098
Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) Thermo Scientific 33-9100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. Fuchs’ corneal dystrophy. Expert Review of Ophthalmology. 5 (2), 147-159 (2010).
  2. Ku, B., et al. Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).
  3. Gain, P., et al. Global survey of corneal transplantation and eye banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  4. Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. Corneal edema resolution after "descemetorhexis&#34. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).
  5. Pan, J. C., Eong, K. G. A. Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent ‘descemetorhexis’ during cataract surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).
  6. Shah, R. D., et al. Spontaneous corneal clearing after Descemet’s stripping without endothelial replacement. Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).
  7. Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).
  8. Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 37 (12), 1497 (2018).
  9. Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).
  10. Macsai, M. S., Shiloach, M. Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only. Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).
  11. Moloney, G., et al. Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil. Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).
  12. Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).
  13. Landshman, N., et al. Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor. Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).
  14. Lee, J., Blaber, M. Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond. Journal of Proteins & Proteomics. 1, 37-42 (2010).
  15. Xia, X., et al. Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for "second generation" therapeutic application. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).
  16. Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).
  17. TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&draw=2&rank=2 (2020)
  18. Soh, Y. Q., et al. Predicative factors for corneal endothelial cell migration). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).
  19. van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells. Archives of Ophthalmology. 122, (2004).
  20. Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty. Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).
  21. Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty. Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).
  22. Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma. Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).
  23. Rolev, K., OʼDonovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model. Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).
  24. Spinozzi, D., et al. In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers. Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).
  25. Garcin, T., et al. Three-month storage of human corneas in an active storage machine. Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).

Tags

Corneal Organ CultureDescemet’s Stripping Only (DSO)Fuch’s Endothelial Corneal Dystrophy (FECD)Engineered Fibroblast Growth Factor 1Endothelial KeratoplastyCorneal Endothelial CellsDescemet’s MembraneCorneal GuttaeWound HealingCorneal Transplantation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pizzuto, S., Duffey, G., Weant, J., Eveleth, D. A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet’s Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1. J. Vis. Exp. (185), e63482, doi:10.3791/63482 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image