JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

نموذج لزراعة أعضاء القرنية البشرية لتجريد Descemet فقط مع الشفاء المتسارع الذي يحفزه عامل نمو الخلايا الليفية المصمم هندسيا 1

Published: July 22, 2022
doi:
10.3791/63482
, , ,
1Trefoil Therapeutics, Inc.

Summary

تجريد Descemet’s Stripping Only هو إجراء تجريبي حيث يقوم المرضى الذين يعانون من الأمعاء القرنية المركزية الناتجة عن حثل القرنية البطانية Fuchs بتجريد غشاء Descemet للخلايا الطرفية لتجديد الطبقة البطانية. نقدم منهجية جديدة تحاكي DSO في القرنيات البشرية الضمور خارج الجسم الحي مع الشفاء المتسارع الذي يحفزه eFGF1 (NM141).

Abstract

ينتج حثل القرنية البطانية فوكس (FECD) عن خلايا القرنية البطانية المختلة وظيفيا (CECs) ويتم علاجه حاليا عن طريق زرع القرنية بأكملها أو غشاء ديسيميت. وقد أدت التطورات الأخيرة في جراحة العين إلى إنشاء تقنية Descemet’s Stripping Only (DSO) ، وهي تقنية جراحية تتم فيها إزالة دائرة مركزية من غشاء Descemet الكثيف الأمعاء للسماح بهجرة CECs إلى السدى الملساء ، واستعادة الوظيفة والرؤية إلى القرنية. في حين أن خيار العلاج المحتمل هذا يحظى باهتمام كبير في مجال أبحاث طب العيون ، إلا أنه لم يتم إنشاء نماذج ناجحة خارج الجسم الحي من واحة دبي للسيليكون والبيانات السريرية محدودة. يقدم هذا العمل نموذجا جديدا لالتئام الجروح يحاكي واحة دبي للسيليكون في القرنيات المانحة البشرية. باستخدام هذا النهج لتقييم فعالية FGF1 (NM141) المصمم هندسيا من قبل الإنسان، وجدنا أن العلاج يسرع الشفاء عن طريق تحفيز الهجرة وانتشار CECs. تم تأكيد هذه النتيجة في 11 زوجا من القرنيات البشرية مع علامات ضمور أبلغت عنها بنوك العيون من أجل التحقق من أن هذه النتائج يمكن تكرارها في المرضى الذين يعانون من ضمور فوكس ، كمجموعة مستهدفة من إجراء DSO.

Introduction

حثل القرنية البطاني فوكس (FECD) هو مرض يتميز بفقدان وظيفة المضخة في الخلايا البطانية القرنية (CECs) والتراكم المفرط للكولاجين وبروتينات المصفوفة خارج الخلية الأخرى على سطح غشاء Descemet ، مما يشكل القناة الهضميةالقرنية 1. العلاج الوحيد المعروف ل FECD هو رأب القرنية البطاني بأشكال مختلفة ، وكلها تأتي مع خطر الرفض وفقدان الخلايا البطانية2. في حين أن التقدم في جراحة العيون قد مكن هذه الإجراءات من أن تصبح أقل توغلا بمرور الوقت ، فإن أي شكل من أشكال الزرع يأتي مع خطر الرفض وإمكانية استخدام الستيرويد مدى الحياة ، وهو علاج له أحداث سلبية مصاحبة له. علاوة على ذلك ، فإن النقص العالمي في أنسجة المتبرعين هو أن القرنية المانحة واحدة فقط متاحة لكل 70 مريضا بحاجة إلى3. وبالنظر إلى هذه التحديات، يستكشف الباحثون والأطباء الطرق الجراحية التي تتجنب الحاجة إلى الأنسجة المانحة تماما. واحدة من هذه التقنيات التجريبية هي تجريد Descemet’s Stripping Only (DSO) أو Descemetorhexis بدون رأب القرنية البطاني (DWEK) ، حيث يكون لدى مرضى FECD الذين يعانون من guttae الموضعي في وسط القرنية دائرة مركزية 4 مم من غشاء Descemet مجردة دون وضع الكسب غير المشروع. تشجع إزالة guttae الخلايا الطرفية السليمة على الهجرة إلى الداخل وإصلاح الطبقة الأحادية البطانية ، مما يؤدي في النهاية إلى عكس الوذمة اللحمية وتحسين الرؤية. تم وصف المفهوم في الأصل في سلسلة من دراسات الحالة التي خضع فيها المرضى لعملية جراحية كانت معقدة بسبب انفصال غشاء Descemet ، ولكن إعادة توطين CEC لا تزال تحدث4،5،6،7. على الرغم من وجود العديد من المزايا لهذه الطريقة ، إلا أن عملية الشفاء طويلة وغير متسقة ، حيث يحتاج بعض المرضى إلى زرع الإنقاذ إذا لم يتم رؤية أي شفاء في الأشهر التالية للجراحة8. لهذه الأسباب، قد يكون الدواء الذي يحفز الهجرة والانتشار الأسرع ل CECs مفيدا في عملية تعافي مرضى FECD الذين خضعوا ل DSO.

قامت العديد من الدراسات الحديثة بتقييم مثبطات ROCK كعلاج تكميلي للمرضى الذين يخضعون ل DSO ، ووجدت أن المرضى الذين عولجوا تعافوا بشكل أسرع وكان لديهم كثافة خلايا بطانية مركزية أعلى (ECD) من تلك الموجودة في مجموعة DSO فقط 9,10,11. ومع ذلك ، نظرا لصغر أحجام العينات والاختلافات بين أنظمة الجرعات ، هناك حاجة إلى مزيد من البيانات لفهم فعالية مثبطات ROCK بشكل أفضل في هذا الإعداد.

كما ثبت أن عوامل نمو الخلايا الليفية تحفز تجديد بطانة القرنية سواء في المختبر مع CECs البقرية ، وفي الجسم الحي في القرنيات القطط12,13. eFGF1 (NM141) هو نسخة هندسية من FGF-1 تحتوي على العديد من بدائل الأحماض الأمينية لتحقيق الاستقرار في الجزيء ، على عكس FGF-1 الأصلي ، الذي له عمر نصف أقصر بكثير14,15. لقد أظهرنا سابقا قدرة eFGF1 (NM141) على تحفيز انتشار CECs خارج الجسم الحي في القرنيات البشريةالربعية 16. سعت هذه الدراسة إلى تحسين هذا العمل من خلال إنشاء أول نموذج ناجح خارج الجسم الحي ل DSO في كل من القرنيات العادية والضمور لتحديد ما إذا كانت العلاجات المساعدة مثل eFGF1 (NM141) تسرع الشفاء في هذا التطبيق.

Protocol

استخدم هذا العمل عينات موجودة دون تحديد الموضوعات وهو معفى من موافقة IRB بموجب 45 CFR 46.101 (b) (4). تم الحصول على القرنيات المانحة البشرية من مختلف بنوك العين في جميع أنحاء الولايات المتحدة (انظر جدول المواد). تم الحكم على القرنية بشكل فردي بأنها ضمور من قبل بنوك العين بناء على نتائج مثل guttae و polyomorphism و polymegathism و / أو انخفاض ECD عند التقييم المضارب. يعرض الشكل 1 تلطيخ Trypan Blue في القرنية أثناء إنشاء الجرح ، مباشرة بعد التجريد ، وبعد أسبوعين في الثقافة. الشكل 1: رسم بياني يمثل القرنية أثناء إنشاء الجرح ، مباشرة بعد التجريد ، وبعد 14 يوما في الثقافة كما تصوره Trypan Blue. تم قياس الانخفاض في المنطقة الملطخة بين هذه النقاط الزمنية لتحديد مستوى الشفاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 1. خلق الجرح باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة القرنية من الوسائط وشطفها في 1x PBS لإزالة الوسائط المتبقية وحطام الخلايا. بعد الشطف ، ضع الجانب البطاني للقرنية لأعلى على غطاء طبق بتري. ماصة 30 ميكرولتر من تريبان بلو في طبق جيد. اغمس لكمة خزعة جديدة مقاس 4 مم باللون الأزرق المثقبي واضغط على أي فائض. باستخدام كلتا اليدين، ضع اللكمة فوق مركز القرنية واخفضها مباشرة إلى السطح البطاني، مع تطبيق الحد الأدنى من الضغط. دون تغيير الموضع أو الضغط على القرنية ، قم بتحويل اللكمة إلى يد واحدة والوصول إلى الملقط باليد المحررة حديثا. استخدم الملقط لتثبيت القرنية في مكانها أثناء لف الخزعة بلطف حوالي 90 درجة ذهابا وإيابا عدة مرات. ارفع اللكمة مباشرة من القرنية واتركها جانبا. شطف مرة أخرى في 1x PBS لإزالة الزائدة تريبان الأزرق. 2. تجريد ديسيميت انقل القرنية على غطاء طبق بتري إلى نطاق تشريح.ملاحظة: لا تترك القرنية جافة لفترة أطول من 5 دقائق. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لإكمال العملية ، فقم بشطفها مرة أخرى في 1x PBS لإعادة ترطيب البطانة. عند تثبيت القرنية في مكانها باستخدام ملقط منحني ، قم بتسجيل غشاء Descemet عن طريق سحب طرف إبرة حادة 30 G برفق على طول حلقة Trypan Blue التي خلفتها لكمة الخزعة. استخدم الحد الأدنى من الضغط لتجنب تعطيل السدى الأساسي. باستخدام خطاف Sinskey ، استخدم حركات مغرفة لطيفة لرفع وتقشير غشاء Descemet حول حافة الجرح ، والعمل نحو مركز الآفة.ملاحظة: يجب أن يأتي غشاء Descemet بمقاومة قليلة جدا. إذا واجهت صعوبة ، فمن المحتمل أن يسحب المرء السدى. إذا حدث هذا ، فابدأ من جديد ، وارفع من نقطة جديدة على طول حافة الجرح. بمجرد فصل غالبية غشاء Descemet عن السدى ، استخدم ملقط Gorovoy لإزالة الغشاء ووضعه جانبا. افحص المنطقة المجردة بحثا عن أي قطع متبقية من الغشاء وقم بإزالتها باستخدام ملقط Gorovoy. 3. تلطيخ التربان الأزرق ملاحظة: بعد تجريد ديسيميت ، قم بتلطيخ القرنية بالأزرق التربان لتصور منطقة الجرح. أعد القرنية على غطاء طبق بتري إلى خزانة السلامة البيولوجية وشطفها في 1x PBS تحتوي على 0.01٪ (ث / v) CaCl 2 و MgCl2 لإزالة حطام الخلايا وتسهيل الالتصاق الصارم ب CECs المتبقية بغشاء Descemet السليم. ضع القرنية في طبق جيد وماصة 30 ميكرولتر من Trypan Blue على الطبقة البطانية لمدة 30 ثانية. استخدم الملقط لهز القرنية بلطف لضمان تغطية السطح البطاني بأكمله. شطف الزائدة تريبان الأزرق في 1x PBS مع 0.01٪ (ث / v) CaCl 2 و MgCl2 وصورة القرنية الملطخة تحت المجهر تشريح لليوم 0 نقطة زمنية. تأكد من توازن القرنية بحيث ينتقل الضوء بالتساوي في جميع الأنحاء ويكون تحديد المواقع قابلا للتكرار عبر النقاط الزمنية.ملاحظة: يمكن استخدام الملقط لتثبيت القرنية في مكانها أثناء التصوير إذا لزم الأمر. 4. فترة الثقافة القرنية المستنبتة في صفيحة من ستة آبار تحتوي على وسائط مصل منخفضة تتكون من OptiMEM. 1x الأنسولين ، ترانسفيرين ، والسيلينيوم ؛ 1x مضاد حيوي / مضاد للفطريات. 0.02 ملغم / مل كلوريد الصوديوم2 ؛ 0.2 ملغ / مل حمض الأسكوربيك ؛ و 0.8 ٪ الحرارة مصل البقر الجنين المعطل. قم بزراعة القرنية اليسرى في 8 مل من وسائط المصل المنخفض وحدها ، والقرنية اليمنى في 8 مل من وسائط المصل المنخفض المكملة ب 100 نانوغرام / مل eFGF1 (NM141). احتضان في 37 درجة مئوية مع 6٪ CO2 لمدة 14 يوما مع تغييرات الوسائط اليومية. كرر إجراء تلطيخ تريبان بلو في الأيام 3 و 6 و 9 و 12 و 14 ، وصور كل قرنية مباشرة بعد التلطيخ. تأكد من الحفاظ على اتساق إعدادات الكاميرا عبر جميع النقاط الزمنية. في اليوم 12 ، أضف 10 ميكرومتر EdU إلى كل من وسائط التحكم و eFGF1 (NM141) المكملة واحتضان لمدة 48 ساعة لتسمية الخلايا المنتشرة. جدد الوسائط مع إضافة EdU مرة أخرى في اليوم 13. في اليوم 14 ، بعد 48 ساعة من إضافة EdU وبقع Trypan وقرنيات الصورة كالمعتاد ، باستثناء 1x PBS مع CaCl 2 و MgCl2 ، استخدم 1x PBS العادي للشطف لمنع الكالسيوم من التفاعل مع بقعة Alizarin Red. 5. تلطيخ اليزارين الأحمر في اليوم 14 ، قم بإعداد 5٪ Alizarin Red في محلول ملحي بنسبة 0.9٪.ملاحظة: لن يذوب Alizarin Red تماما في محلول ملحي. عند الجمع بين حل الدوامة والصخور لمدة 1 ساعة على الأقل. دوامة مرة أخرى وتصفية قبل الاستخدام لإزالة الجسيمات غير الذائبة. بمجرد الانتهاء من تلطيخ التربان والتصوير ، انقل القرنيات إلى طبق جيد وأضف 200 ميكرولتر من Alizarin Red إلى السطح البطاني لكل قرنية. قم باللصق لمدة دقيقتين ، ثم اشطف كل قرنية في طبق بتري من 1x PBS لإزالة Alizarin Red الزائد قبل وضعه في طبق من ستة آبار مملوء مسبقا ب 8 مل من 1x PBS لمدة غسلتين لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الثاني ، قم بتصوير المنطقة المجردة من كل قرنية تحت مجهر تشريح.ملاحظة: على عكس تصوير تريبان ، يمكن ترك القرنيات في 1x PBS لتصوير تلطيخ Alizarin لمنعها من الجفاف أثناء العملية. 6. التثبيت والنفاذية بمجرد التقاط صور Alizarin ، انقل القرنيات إلى صفيحة من 12 بئرا واغسلها في 4 مل من 1x PBS تحتوي على 0.05٪ Tween-20 (PBS-T) لمدة 30 دقيقة لإزالة أي جزيئات من الأنسجة قبل التثبيت. ثبت القرنيات في 4 مل من PFA 4٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلل الخلايا لمدة 5 دقائق في 4 مل من 1x PBS تحتوي على 1٪ Triton X-100 ، ثم تغسل ثلاث مرات في 4 مل من 1x PBS العادي لمدة 30 دقيقة لكل منهما. 7. الكيمياء النسيجية المناعية قم بحظر القرنيات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في 4 مل من 1x PBS تحتوي على 2٪ من ألبومين مصل البقر و 2٪ مصل الماعز. احتضان في 1 مل من محلول الحجب الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل من فأر الأجسام المضادة الأولية المضادة ZO-1 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسل ثلاث مرات في 4 مل من 1x PBS لمدة 30 دقيقة لكل منهما.ملاحظة: يمكن إمالة اللوحة أثناء تلطيخ الأجسام المضادة لتقليل حجم الكواشف اللازمة. فقط تأكد من أن القرنية بأكملها مغمورة بالكامل في محلول الأجسام المضادة. قم بإجراء تفاعل EdU Click-iT باستخدام كوكتيل يحتوي على 0.88 مجم / مل من حمض الأسكوربيك و 0.26 مجم / مل CuSO4 و 2.5 ميكرومتر Alexa Fluor 488 azide. تحضير مكونات التفاعل أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى 88 ملغ من حمض الأسكوربيك والدوامة حتى تذوب. أضف 840 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى 44 ملغ من CuSO4 ودوامة حتى تذوب. تحضير كوكتيل عن طريق إضافة الكواشف التالية إلى 6 مل من 1x PBS بهذا الترتيب ، أنبوب مقلوب للخلط بعد كل إضافة: 30 ميكرولتر من محلول حمض الأسكوربيك ، 30 ميكرولتر من محلول CuSO4 ، ثم 15 ميكرولتر من Alexa Fluor 488ملاحظة: بمجرد إعداده ، يكون هذا الحل حساسا للضوء. بالنسبة لما تبقى من البروتوكول ، يجب حماية القرنيات من الضوء كلما أمكن ذلك. أضف 1 مل من كوكتيل تفاعل EdU إلى كل قرنية وتفاعل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أضف 4 مل من 10 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 إلى كل قرنية وتفاعل لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل ثلاث مرات في 1x PBS-T لمدة 30 دقيقة لكل منهما. احتضان في 1 مل من محلول الحجب الذي يحتوي على 2 ميكروغرام / مل Alexa Fluor 555 المسمى الماعز المضاد للماوس IgG لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسل ثلاث مرات في 1x PBS-T لمدة 30 دقيقة لكل منهما. تخزين القرنيات في 4 درجة مئوية في 4 مل من 1x PBS مع 1 ٪ مضاد / مضاد ، 0.1 ٪ سيبروفلوكساسين ، و 0.1 ٪ أمفوتريسين B لمنع نمو الميكروبات. عند إجراء التصوير متحد البؤرة، قم بتركيب القرنيات الكاملة في 200 ميكرولتر من وسط التركيب على شرائح زجاجية مع شريط غطاء مثبت لأسفل حتى يتم تسويته. 8. تحليل صورة تريبان قم بإجراء جميع عمليات تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ مفتوح المصدر التابع للمعاهد الوطنية للصحة. افتح صورة باستخدام ملف > فتح وانقر فوق صورة > ضبط عتبة لون >. استخدم أشرطة التمرير “Hue” لتشمل النطاق الأزرق فقط واضبط شريط تمرير “السطوع” العلوي على طول الطريق إلى اليسار لتضمين المزيد من المنطقة الملطخة.ملاحظة: إذا تسبب هذا الإجراء في تضمين أجزاء من الصورة غير ملطخة ب Trypan، فيمكن إرجاع شريط تمرير “السطوع” إلى مستواه الأصلي. اضبط شريط تمرير “التشبع” العلوي ببطء حتى تحدد العتبة بدقة المنطقة الملطخة.ملاحظة: من المفيد فتح نسخة من الصورة الأصلية للرجوع إليها أثناء هذه العملية. انقر زر التحديد ضمن قائمة عتبة اللون، ثم استخدم أداة فرشاة التحديد لإلغاء تحديد المساحات خارج الجرح التي تم التقاطها. انقر فوق تحليل > قياس للإبلاغ عن المساحة الملطخة بالبكسل. قم بإلغاء تحديد الكل باستخدام تحرير > التحديد > حدد لا شيء واستخدم أداة التحديد البيضاوي لتناسب الطرف قدر الإمكان، ثم انقر على تحليل > قياس للإبلاغ عن مساحة القرنية بالبكسل.ملاحظة: يمكن رفع السطوع مؤقتا للمساعدة في تصور الطرف إذا كان هذا الجزء من الصورة مظلما جدا. سجل قيم المساحة واقسم المساحة الملطخة على مساحة القرنية بأكملها ، ثم اضرب في 100 لحساب النسبة المئوية الملطخة. كرر هذه العملية مرتين أخريين لكل صورة، ثم خذ متوسط القياسات الثلاثة. 9. التحليل الإحصائي بمجرد تحليل جميع الصور ، اقسم متوسط النسبة المئوية الملطخة في اليوم 14 على النسبة المئوية الملطخة في اليوم 0 لتحديد المنطقة المتبقية غير الملتئمة. اطرح هذا المبلغ من 100٪ لحساب النسبة المئوية للمنطقة المجردة التي تم شفاؤها على مدار 14 يوما. استخدم اختبار t المقترن لمقارنة قيم النسبة المئوية للشفاء بين مجموعات التحكم والعلاج.

Representative Results

أجريت هذه التجربة في البداية في 10 أزواج من قرنيات الأبحاث العادية ، لأنها متاحة بسهولة. بمجرد أن ثبت نجاح هذه الطريقة ، تم تكرار الدراسة في 11 زوجا من القرنيات الضمور التي تم تصنيفها على هذا النحو من قبل بنوك العين بناء على التقييم المضاربي – لدراسة آثار eFGF1 (NM141) في القرنيات الممثلة لمرضى FECD. ولمزيد من الأهمية السريرية، تمثل الأرقام الواردة في هذا العمل البيانات التي تم جمعها من القرنيات الضمور ما لم يذكر خلاف ذلك. بعد محاكاة النتائج الجراحية ل DSO ، تم إجراء تلطيخ Trypan Blue وتكراره طوال فترة الثقافة التي استمرت 14 يوما ، وتم تحديد الحد من التلطيخ الإيجابي كميا لتقييم التئام الجروح (الشكل 2). كما تم إجراء تلطيخ Alizarin Red في اليوم 14 لترسيم حدود الخلايا. ظهرت المناطق الحمراء الداكنة بدون نمط واضح مرئي (يشار إليها فيما يلي باسم التلطيخ السلبي) باستمرار داخل القسم غير الملتئم من الآفة وفي مناطق أخرى من القرنية حيث يفترض أن الخلايا تالفة أو مفقودة. المناطق التي لطخت إيجابية ل Trypan Blue في اليوم 14 تتوافق بشكل جيد مع التلطيخ السلبي بواسطة Alizarin Red (الشكل 2). أظهرت جميع القرنيات الضمور المعالجة ب eFGF1 (NM141) شفاء أكبر في اليوم 14 مقارنة بالرفيق غير المعالج. في المتوسط، أظهرت القرنيات المعالجة شفاء بنسبة 91٪ مقابل 38٪ في القرنيات الضابطة، وكان هذا الفرق ذا دلالة إحصائية (p < 0.001) (الشكل 3A). وهذا مشابه للنتائج التي تم الحصول عليها من 20 قرنية طبيعية، حيث أظهرت الضوابط أن متوسط الشفاء بنسبة 32٪ والقرنيات المعالجة وصل إلى 81٪، والتي كانت ذات دلالة إحصائية مرة أخرى (p < 0.001) (الشكل التكميلي 1). تمت مقارنة النسبة المئوية التي تم شفاؤها بين القرنيات الطبيعية والضمور باستخدام اختبارين لعينة t يفترضان تباينا متساويا ، ولم يلاحظ أي فرق كبير في مجموعات التحكم أو العلاج (البيانات غير معروضة). تم تحليل معلومات المتبرعين المقدمة من بنوك العيون (الجدول 1) لكل من القرنيات الطبيعية والضمور لتحديد ما إذا كانت الخصائص بما في ذلك العمر والأيام المخزنة في Optisol والفترة الزمنية من الموت إلى الجمع وكثافة الخلايا والجنس ترتبط بالشفاء. تم استخدام معامل ارتباط بيرسون (r) للتحقيق في جميع العوامل باستثناء الجنس ، والذي تم تقييمه باستخدام اختبار t غير المقترن لمقارنة الشفاء بين الذكور والإناث. كانت القيمة المطلقة ل r أقل من 0.25 في جميع الحالات ، مما يشير إلى أن أي ارتباطات بين الشفاء والعمر ، أو الأيام المخزنة في Optisol ، أو الوفاة إلى التجميع ، أو كثافة الخلايا تعتبر ضئيلة. لم يكن الفرق في الشفاء بين الذكور والإناث ذا دلالة إحصائية (p = 0.53). على غرار مجموعة البيانات العادية ، قدمت 10 من 22 قرنية ضمور مع تلطيخ تريبان ملحوظ خارج المنطقة المجردة المتصلة بالمنطقة الملطخة داخل الآفة في نقطة زمنية واحدة على الأقل (عادة اليوم 3) – وهي ملاحظة أطلقنا عليها التلطيخ المحيطي (الشكل 4A). من بين هؤلاء ال 10 ، كان اثنان فقط من القرنيات الضابطة التي لم يظهر نظراؤها المعالجون نفس التأثير. أما الثمانية الباقون فكانوا جميعا أزواجا متطابقة وعرضت عليهم شدة مماثلة بين القرنيات من نفس الفرد. على الرغم من أن أنماط التلطيخ كانت قابلة للمقارنة بين القرنيات العادية والضمور ، إلا أن تواتر التلطيخ المحيطي كان أعلى في مجموعة البيانات الضمور مع 45٪ من القرنيات إيجابية ، مقارنة ب 25٪ في المجموعة العادية. يوضح الشكل 4A زوجا كان يعتبر إيجابيا للتلطيخ المحيطي ، حيث التقت المنطقة الملطخة خارج الآفة بحافة الجرح في صور اليوم 6 وتراجعت تدريجيا. في صور Alizarin Red المقابلة ، بدت الخلايا في المناطق ذات تلطيخ Trypan المحيطي متضخمة وذات شكل غير طبيعي ، مثل الكثير من الخلايا التي هاجرت إلى المنطقة المجردة ، وارتبطت التلطيخ السلبي بالمناطق التي كان يوجد فيها Trypan Blue في اليوم 14. على الرغم من الجزء الكبير من القرنية المتأثرة طوال فترة الاستزراع ، حدث تطهير جزئي أو كامل للمحيط الملون في جميع القرنيات ال 10. بالإضافة إلى ذلك ، كانت النسبة المئوية النهائية التي تم شفاؤها في اليوم 14 ضمن المعدل الطبيعي ، لكل مجموعة علاج ، لجميع القرنيات باستثناء قرنية واحدة. وأرجع القيم الشاذ (0811L، في الصورة في الشكل 4A) قيمة سالبة في المئة شفاء بسبب بقايا التلطيخ المحيطي الذي لا يزال متصلا بمنطقة الآفة في اليوم 14 (الشكل 3A والشكل 4A). تم التقاط نمط تلطيخ ثان ، يشار إليه باسم التلطيخ المحيطي البعيد ، في صور Alizarin Red من الشكل 4B ، ولكنه كان واضحا أيضا في صور Trypan Blue طوال فترة الثقافة في العديد من القرنيات (الشكل 4B). تتميز هذه الملاحظة بحلقة من التلطيخ الداكن حول الطرف ، مما يشير إلى البطانة المعرضة للخطر. على الرغم من المصطلح ، كان هذا النمط شائعا جدا في كل من القرنيات العادية والحثلية لدرجة أنه لم يتم احتسابها على أنها إيجابية للتلطيخ المحيطي. في هذه الصور ، أظهرت القرنية الضابطة تلطيخا أكثر حيوية وأوسع نطاقا في اليوم 14 ، على الرغم من أن كلا القرنيتين تمتلكان نفس الشدة ونمط التلطيخ في وقت مبكر من فترة الثقافة. كما لوحظ في القرنية المعالجة وجود عدد أكبر على ما يبدو من الخلايا ، والتي بدت أكثر إحكاما وسداسية مقارنة بالتحكم ، على الرغم من أن هذه الملاحظات لم يتم قياسها كميا. بسبب الانحناء في المحيط ، تم تضمين تلطيخ التربان فقط داخل المنطقة المجردة والمحيطة بها مباشرة في التحليل الكمي. عندما تم حساب متوسط القيم الملطخة في المئة عبر جميع القرنيات الضمورية، أدى ظهور التلطيخ المحيطي إلى زيادة أولية عن تلك الموجودة في اليوم 0، على عكس الانخفاض المطرد الذي شوهد في القرنيات العادية حيث كان التلطيخ المحيطي أقل انتشارا (الشكل 3B). تكشف الكيمياء النسيجية المناعية التي يتصورها التصوير البؤري عن تعبير شبه منظم ل ZO-1 ، وهو علامة وظيفية للتقاطعات الضيقة CEC ، داخل وحول حافة الآفة (الشكل 5) ، وهو نمط يتضح بالمثل من خلال تلطيخ Alizarin Red (الشكل 2 والشكل 4). تعدد الأشكال و polymegathism مرئية بواسطة ZO-1 في معظم القرنيات الضمورية. ومع ذلك ، يمكن أن تعزى هذه الملاحظة إلى حالتها المريضة وقد لاحظها بنك العين عند الفحص المضارب للقرنيات قبل الزراعة. لوحظ تعبير ZO-1 غير المنظم داخل منطقة الآفة في القرنيات المعالجة حيث هاجرت الخلايا إلى الداخل ، بما يتفق أيضا مع أنماط Alizarin Red. يمكن رؤية الخلايا المدمجة مع EdU حول حدود الآفة وداخل المنطقة المصابة في السيطرة والقرنيات المعالجة (الشكل 5). يعكس نمط CECs المهاجرة أيضا نتائج Trypan Blue ، حيث تم العثور على معظم الخلايا في القرنيات الضابطة داخل حقلين من حافة الآفة ، في حين يمكن رؤية CECs في القرنيات المعالجة في جميع أنحاء المنطقة المجردة (الشكل 2). تم إجراء وضع العلامات على EdU كمقياس نوعي في هذه الدراسة لتأكيد أن الانتشار ساهم في الشفاء. ومع ذلك ، لا يمكن إجراء القياس الكمي للخلايا التي تتضمن EdU بشكل منهجي بسبب تورم القرنية الذي يمنع التقاط صور متسقة وقابلة للتكرار داخل الآفة وحولها. وكبديل، أدرج التحليل الكمي الذي أجري في دراسة أجريت قبل إنشاء نموذج واحة دبي للسيليكون لإثبات آثار eFGF-1 (NM141) على الانتشار (الشكل 6). تم تقطيع القرنيات البشرية المانحة الطبيعية إلى أرباع باستخدام مشرط وزرعت في وجود EdU ، مع أو بدون eFGF1 (NM141) لمدة 48 ساعة كما هو موضح سابقا (Eveleth، 2020)16. تم إجراء التصوير والتحليل اللاحق للخلايا التي تحمل علامة Hoechst 33342 و EdU بشكل منفصل في المنطقة الوسطى غير المضطربة من الأرباع وفي منطقة الحافة ، داخل ثلاثة حقول من حيث تم قطع القرنية. في المنطقة الوسطى ، كانت النسبة المئوية للخلايا التي تضم EdU منخفضة ومتغيرة للغاية عبر القرنيات ال 10 التي تم تحليلها. في المتوسط، كان لدى الأرباع التي عولجت باستخدام eFGF1 (NM141) مستويات أعلى من دمج EdU في المنطقة الوسطى (4.1٪ ± 7.9٪) مقارنة بالضوابط (1.8٪ ± 2.9٪)، على الرغم من أن هذا الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية (p = 0.239). على حافة الجرح ، أظهرت الأرباع المعالجة المحفزة باستخدام eFGF1 (NM141) معدلات أعلى بكثير من دمج EdU عند متوسطها (18.1٪ ± 11.5٪) مقارنة بأرباع التحكم (10٪ ± 9.6٪ ، p = 0.012). الجدول 1: معلومات المتبرع ل 22 قرنية ضمور و 20 قرنية طبيعية مستخدمة في هذه الدراسة ، بالإضافة إلى 10 قرنيات طبيعية استخدمت سابقا لقياس EdU. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول. الشكل 2: تلطيخ صبغة حيوية للقرنيات بعد تجريد ديسيميت. تم تجريد القرنيات البشرية الضمور من 4 مم المركزية من غشاء Descemet وتحضينها مع أو بدون eFGF1 (NM141) (100 نانوغرام / مل) لمدة 14 يوما. تم تصور الآفات بواسطة تلطيخ Trypan Blue في الأيام 0 و 3 و 6 و 9 و 12 و 14. تم تصور حدود CEC بواسطة Alizarin Red Staining في اليوم 14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تظهر القرنيات البشرية الضمور شفاء أكبر بكثير من DSO عند استزراعها باستخدام eFGF1 (NM141). (A) تم تحديد النسبة المئوية للشفاء عن طريق قياس المنطقة الملطخة في اليوم 14 باستخدام ImageJ ومقارنتها بالنسبة المئوية الملطخة في اليوم 0. (ب) يظهر متوسط النسبة المئوية الملطخة مع مرور الوقت انخفاضا ثابتا في القرنيات العادية بينما يبلغ ذروته في اليوم 3 في القرنيات الضمور بسبب ارتفاع معدل انتشار التلطيخ المحيطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تلطيخ صبغة حيوية للقرنيات الضمور مع تلطيخ محيطي. (أ) يمكن رؤية تلطيخ التريبان لغشاء ديسميت السليم وهو يتقدم نحو المركز، ثم يزول بمرور الوقت في كل من القرنيات الضابطة والمعالجة. (ب) تمثل أنماط أليزارين حول الطرف ملاحظة نموذجية للتلف المحيطي وإعادة التأسيس غير المنظم للبطانة التي شوهدت في العديد من القرنيات المانحة – في هذه الحالة الضمورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تحفيز الهجرة وانتشار CECs بواسطة eFGF1 (NM141) في القرنيات الضمور المجردة. صور مجهرية متحدة البؤرة لقرنيات Descemet المجردة الملطخة ب ZO-1 (أحمر) و EdU (أخضر) و Hoechst 33342 (أزرق). يمثل الخط المنقط حافة الآفة مع المنطقة المجردة على الجانب الأيسر من الصورة وغشاء Descemet السليم على اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: القياس الكمي للخلايا المتكاثرة من القرنيات الطبيعية التي يتم تربعها باستخدام مشرط وتحضنها في وسائط تحتوي على EdU مع أو بدون eFGF-1 (NM141) لمدة 48 ساعة. تم تصوير الأرباع في ثلاثة أضعاف في المنطقة الوسطى غير المضطربة وعلى طول الحافة المقطوعة ، وتم حساب متوسط الأعداد لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تضم EdU في المناطق الوسطى والحافة. الشكل المعدل من مجلة علم الأدوية والعلاجات العينية ، يستخدم بإذن16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل التكميلي 1: تظهر القرنيات البشرية الطبيعية شفاء أكبر بكثير من واحة دبي للسيليكون عند استزراعها باستخدام eFGF1 (NM141). تم استخدام ImageJ لقياس المناطق الملطخة وتحديد نسبة الشفاء. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

لدى العديد من أطباء العيون مخاوف بشأن التوصية ب DSO لمرضاهم لسببين رئيسيين: 1) عملية الشفاء الطويلة ، و 2) نقص البيانات (واحة دبي للسيليكون هو مفهوم جديد في مجال جراحة العيون). سيكون البحث الذي قدمناه ذا فائدة كبيرة لتخفيف كل من هذه المخاوف. واستنادا إلى بيانات من هذه الدراسة وغيرها، وافقت إدارة الأغذية والعقاقير على المرحلة الثانية من التجارب السريرية حيث سيتم إعطاء eFGF1 (NM141) في جداول جرعات مختلفة للمرضى الذين يخضعون ل DSO17.

تم تصميم الطريقة الموصوفة أعلاه بعد دراسة أجراها Soh et al. ، حيث تم تقييم التئام بطانة القرنية مع وبدون مثبط ROCK Y-27632 في كل من الجروح المخدوشة والمقشرة18. في حين أن Y-27632 سرع التجديد البطاني مع غشاء Descemet لا يزال سليما ، لم يتم العثور على شفاء كبير في الجروح المجردة حتى مع العلاج. باستخدام تقنية تجريد مماثلة متبوعة بالعلاج مع أو بدون eFGF1 (NM141) ، لم تكن الملاحظات التي وجدناها متسقة مع ملاحظات سوه وزملاؤه. إن غياب تلطيخ Trypan Blue في العديد من القرنيات المعالجة في اليوم 14 ، ووجود تقاطعات ضيقة إيجابية ZO-1 داخل الطبقة البطانية التي تم إصلاحها يجادل بأن حاجزا سليما ، وهو جزء من الوظيفة الطبيعية للجنة الانتخابات المركزية ، قد تم استعادته في كل من القرنيات العادية والضمورية. على الرغم من عدم تحديد كمي في هذه الدراسة ، إلا أن وجود خلايا إيجابية EdU في المنطقة المجردة وحولها يشير أيضا إلى الانتشار كآلية شفاء ، وهي آلية أنشأناها سابقا يمكن تحفيزها بواسطة eFGF1 (NM141) في القرنيات المصابة16. أظهر التحليل الإحصائي أن العلاج باستخدام eFGF1 (NM141) أدى إلى شفاء أكبر بكثير من DSO ، في المتوسط أكثر من ضعف ارتفاع القرنيات الضابطة في نقطة زمنية مدتها 14 يوما. على الرغم من أن معدلات الشفاء تختلف بشكل معتدل بين الأفراد – وهي سمة نموذجية للقرنيات المانحة – إلا أن تكرار النتائج على أحجام العينات الكبيرة يدل أيضا على طريقة قابلة للقياس بدرجة كبيرة. على حد علمنا ، لا توجد أمثلة أخرى على نموذج تجريد Descemet خارج الجسم الحي في الأدب.

المكونات الرئيسية للبروتوكول نفسه التي من شأنها أن تخدم قيمة للباحثين الآخرين الذين يدرسون واحة دبي للسيليكون هي استخدام Trypan Blue للكشف عن السدى العارية ، وتقنية معالجة الصور المستخدمة لقياس المنطقة الملطخة. يستخدم Trypan Blue بشكل شائع في جراحة العيون ، خاصة عند العمل مع غشاء Descemet للكشف عن الخلايا غير القابلة للحياة والمساعدة في رؤية الأنسجة. سمحت النقاط الزمنية للتلطيخ المدرجة في هذا البروتوكول بتكرار التلطيخ الفعال دون الإفراط في تعريض القرنيات ل Trypan Blue ، حيث ثبت أنها سامة ل CECs بتركيزات عالية19. إن تقليل المساحة الملطخة على مدى 14 يوما في جميع القرنيات ، والذي أكده Alizarin Red والكيمياء النسيجية المناعية ليكون نتيجة ل CECs المهاجرة ، يوضح طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لقياس الشفاء. باستخدام قائمة عتبة اللون في ImageJ ، قام العديد من المحللين بجمع البيانات ذات الانحرافات المعيارية باستمرار أقل من 1٪ (البيانات غير معروضة). على الرغم من أن البرامج البديلة قد تعمل بالمثل ، إلا أن ImageJ هو برنامج مفتوح المصدر قادر على إنتاج قياسات دقيقة للمنطقة لتتبع الشفاء.

ومع ذلك ، هناك جانب واحد من بروتوكول التجريد الذي وجدناه ضروريا لإنشاء الجروح ، ولكنه يعيق عملية الشفاء الشاملة. إن استخدام إبرة حادة بزاوية 30 جم لتسجيل غشاء Descemet على طول العلامة التي خلفتها لكمة الخزعة يمكن من إنشاء جرح دائري أملس يلاحظه الأطباء لدعم الشفاء الأسرع10. في الوقت نفسه ، تضر هذه الخطوة بالقرنية ، لأنها يمكن أن تخلق تمزقات في الألياف اللحمية مما يسبب موت الخلايا اللحمية ، ويعيق هجرة الخلايا البطانية عبر حافة الجرح ، ويحفز تكوين العقيدات التي تؤدي إلى وذمة أكثر ثباتا بعد العملية الجراحية20. عادة ما يستخدم الأطباء السريريون الذين يؤدون DSO خطاف Sinskey عكسي لبدء الجرح ، ولكن بدون أي ضغط داخل العين يحافظ على القرنية مشدودة ، تكون هذه الأداة أقل فعالية في نموذج خارج الجسم الحي . أداة بديلة قادرة على تمزيق غشاء Descemet دون الإضرار بالسدى الأساسي من شأنها أن تحسن البروتوكول ، على سبيل المثال قبضة الري والشفط التي أوصى بها Macsai و Shiloach10. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التجريب لتحديد ما إذا كانت هذه التقنية متوافقة مع نموذج خارج الجسم الحي .

التحدي الذي يبدو متأصلا في نموذج خارج الجسم الحي هو تكرار حدوث موت CEC في المنطقة الطرفية للجرح ، وخاصة في القرنيات الضمورية. هذا الكم الغامض أحيانا لمنطقة الجرح ، لأن دقة أداة عتبة اللون تصبح أكثر محدودية حيث تمتد المنطقة الملطخة إلى ما وراء مركز القرنية حيث يؤدي انحنائها إلى توزيع الضوء بشكل غير متساو. ومع ذلك ، حدثت هذه القياسات المتغيرة في المقام الأول في نقاط زمنية سابقة قبل أن تنحسر التلطيخ المحيطي تدريجيا مع إزالة CECs التالفة وتمدد الخلايا المجاورة أو ترحيلها أو تكاثرها لتحل محلها. وبحلول آخر 14 يوما، كانت المنطقة الملطخة قد توطنت مرة أخرى إلى مركز القرنية، وكانت جميع الصور قابلة للقياس. تم إجراء ملاحظة مماثلة بتردد مماثل من قبل Soh et al. ، حيث قدمت خمسة من 14 قرنية طبيعية ما أسموه “فشل الثقافة المبكر” (PCF) في وقت مبكر من فترة الثقافة18. في حين أن الضرر انعكس مع مرور الوقت في قرنياتنا ومع ذلك كان دائما في حالتهم ، يمكن أن يعزى ذلك إلى حقيقة أن طريقتهم تتطلب جرح مساحة أكبر من القرنية. قد تشير ملاحظة تلطيخ تريبان المحيطي الأكثر انتشارا في القرنيات الضمور إلى أن القرنيات الضمور أكثر عرضة لموت الخلايا البطانية من القرنيات السليمة. في حين أن السبب الدقيق لموت هذه الخلايا لم يتم توضيحه بعد ، إلا أننا نعتقد أنه من غير المرجح أن تكون هذه المشكلة ذات صلة بالقرنيات البشرية في الجسم الحي. لم يتم الإبلاغ عن الأضرار التي لحقت بالبطانة الطرفية في أي دراسات حالة سريرية لواحة دبي للسيليكون على حد علمنا ، مما يشير إلى أن هذه الظاهرة فريدة من نوعها بالنسبة للقرنيات المانحة المستزرعة خارج الجسم الحي6،8،10،11،21. وبصرف النظر عن حالتين حيث تم تلطيخ القرنيات الضابطة فقط، فقد تم إقران جميع ملاحظات التلطيخ المحيطي، لذلك من غير المرجح أن يكون السبب هو التعرض ل eFGF1 (NM141). ومع ذلك ، فمن الممكن أن يكون العلاج في تلك الحالات قد وفر تأثيرا وقائيا ضد الضرر الذي كان من شأنه أن يؤدي إلى تلطيخ محيطي في كلتا القرنيتين. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق في هذه الفرضية.

هناك قيد آخر لهذه الطريقة يتمثل في الحصول على قرنيات مانحة تمثل النمط الظاهري ل FECD الذي تم تصميم DSO له. القرنيات المانحة من أي نوع نادرة، وبالتالي الحاجة إلى عملية جراحية تتجنب استخدام الأنسجة المانحة. لأغراضنا ، القرنيات الوحيدة المتاحة هي تلك المرفوضة من الزرع لأسباب مختلفة. كما تصنف بنوك العيون هذه القرنيات على أنها طبيعية أو ضمور بناء على معايير تشمل وجود الأمعاء ، وتنمية الطفولة المبكرة المنخفضة أو غير القابلة للقياس ، ومورفولوجيا CEC غير المنتظمة. كما أن تأكيد التشخيص الضموري قبل قبول الأنسجة من بنك العين يكاد يكون مستحيلا ، لأن التاريخ الطبي لمعظم المتبرعين لا يتضمن تاريخ العين السابق والمعلومات الوحيدة المقدمة هي قيمة ECD ، وملاحظات الفني ، وفي بعض الحالات صورة تمثيلية مضاربة. لم تظهر القرنيات الضمور التي تم الحصول عليها لهذه الدراسة التقاء بالمعوية المركزية على المجهر البؤري الذي تم إجراؤه بعد اكتمال فترة الزرع ، مما يشير إلى أنها قد تمثل مراحل “مبكرة” من FECD. لا نتوقع أن يكون لهذا تأثير كبير على الآثار المترتبة على الدراسة ، حيث أن الغرض من واحة دبي للسيليكون هو إزالة المناطق المتقاربة من الأمعاء ، مما يسمح للخلايا الطرفية السليمة بالهجرة إلى الداخل.

توفر هذه الطريقة تقنية قابلة للتطبيق للغاية وقابلة للتكرار لتقييم العوامل التي قد تؤثر على انتشار CEC وهجرتها. يحتوي النموذج على العديد من الميزات التي تجعله أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية من النماذج المختبرية التي تنطوي على CECs المستزرعة ، حتى عند زرعها على ترقيع أنسجة القرنية البشرية22،23،24. أولا ، تكون CECs المراد تحفيزها في طبقة أحادية تماما كما هي موجودة في عين المريض ، وتهاجر عبر سدى القرنية كما تفعل بعد DSO السريري. السدى المعنية هي من نفس المريض مثل CECs ، وبالتالي التحكم في الاختلافات اللحمية المحتملة المتعلقة ب FECD. ليست هناك حاجة لزراعة وفصل وتوسيع ثقافات CECs مع التحديات والإمكانات المرتبطة بالانتقال البطاني إلى الوسيط (EnMT) أثناء عملية الاستزراع. البروتوكول الموصوف هو نفسه مشابه جدا لإجراء DSO السريري. في حين أنها تتجاوز خطوات الثقافة والتوسع ، فإن هذه الطريقة لها قيود على أن مدة الدراسة مقيدة بتورم القرنية ، حيث لا يتم الحفاظ على الطبقة الظهارية. هذا يمنعنا من التحقيق في مورفولوجيا CECs التي هاجرت لتغطية المنطقة المجردة ، مما يترك من غير الواضح ما إذا كانت ستعيد ترتيبها في نهاية المطاف في صفيف سداسي في هذا النموذج. طور Garcin et al. حلا محتملا واحدا باستخدام آلة التخزين النشطة (ASM) الخاصة بهم ، وهو جهاز ثبت أنه يحافظ على القرنيات في الثقافة لمدة تصل إلى 3 أشهر مع وذمة أقل بكثير من القرنيات التي يتم الاحتفاظ بها في زراعة الأعضاء التقليدية25. قد يكون مثل هذا الجهاز مفيدا في تكرار هذا العمل والتوسع فيه.

هذا النموذج له فائدة محتملة في اختبار علاجات التئام الجروح الأخرى (على سبيل المثال ، مثبطات ROCK) ، وتقييم التعديلات على التقنية الجراحية ومقارنة الشفاء عبر مختلف مجموعات المانحين أو مراحل المرض. نأمل أن يشجع هذا البحث، بالاقتران مع بيانات التجارب السريرية عند ظهوره، الأطباء السريريين على اعتبار واحة دبي للسيليكون خيارا علاجيا قيما لمرضاهم المؤهلين للحصول على شهادة FECD.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم تمويل هذا العمل من قبل Trefoil Therapeutics و NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. يود المؤلفون أن يشكروا توني وونغ على نصائح وخدمات علم الأمراض النسيجية ، ومركز نيكون للتصوير في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لاستخدام المجهر البؤري ، والدكتورين ناتالي أفشاري وماريان ماكساي على مشورتهم حول التقنية الجراحية. بالإضافة إلى ذلك ، يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمتبرعين بالعيون وبنوك العيون لتوفير القرنيات.

Materials

0.2µm sterile 1000 mL filter units VWR 10040-440
0.2µm sterile 250 mL filter units VWR 10040-464
0.2µm sterile 500 mL filter units VWR 10040-436
10mL syringe Luer-Lok Tip Becton Dickinson 302995
12 well tissue culture treated plate Corning 3513
15 mL conical Tubes VWR 89039-668
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
2mL aspirating pipette VWR 414004-265
310 direct heat CO2 incubator Forma Scientific 13-998-082 Set to 37°C, 6% CO2
50 mL conical tubes VWR 89039-660
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) Thermo Scientific C10337
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes VWR 89130-896, -898,  -900, -902
6 well tissue culture treated plate Corning 3516
70% ethanol BDH BDH1164-4LP
Alexa Fluor 488 azide Thermo Scientific A10266
Alizarin Red S Sigma A5533-25G
Analytical balance Sartorious R200D
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) Thermo Scientific 15240-062
Anti-magnetic stainless steel forceps Excelta 7-SA
Bottle top dispenser Ward's Science 470134-946
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP9700-100
Calcium chloride (CaCl) Amresco 1B1110-500G
Chex-all II sterilzation pouches Propperman  24008
Cirpofloxacin hydrochloride Alfa Aesar J61970
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) Sigma 469130-50g
Dissecting microscope Nikon SMZ1270
Dry vacuum pump Welch 2019B-01
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific A31606-01
Frosted micro slides VWR 48311-703
Galaxy miniStar microcentrifuge VWR C1413, VWR
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Scientific A32727
Goat serum Sigma G9023
Haemo-Sol detergent Haemo-Sol International LLC 026-050
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Thermo Scientific H3570
Hot plate/stirrer Corning PC-320
Human corneas Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank NA
Hydrochloric acid (HCl) BDH BDH7204
ImageJ National Institute of Health Version 1.52a
Infinity 3s microscopy camera Lumenera 1URCAP2
Infinity analyze software Lumenera Version 6.5.5
Insulin transferrin selenium (ITS) Corning 41400-045
Iris scissors, 11 cm World Precision Instruments 501264-G
L- Ascorbic acid Sigma A4544-25G
Manual single channel pipet Rainin  17014-392, -391, -382
Needle PrecisionGlide 30G Becton Dickinson 305106
N-Met141 TTHX1114 Biopharmaceutical Development Program NA
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) Thermo Scientific 51985-034
Orion Star A211 pH meter Thermo Scientific STARA211
Petri dishes VWR 89107-632
Potassium chloride (KCl) BDH BDH9258-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) VWR 0781-500G
Powerpette plus pipet controller VWR 75856-456
Precision water bath 188 Precision Scientific Incorporated WB05 Set to 37°C
Purifier Class II model biosafety cabinet Labconco 36213043726
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363212
Scalpel size 22 stainless steel  Sklar 446479
Sodium chloride (NaCl) VWR 2041-2.5K
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 0404-1KG
Standard shaker VWR 89032-092
Standard solid refrigerator VWR 10820-402 Set to 4°C
Sterilmatic autoclave Market Forge STM-EL
Syringe filters VWR 28145-477
Test tube rocker Thermo Scientific M48725Q
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm Sklar 96-1146
Trypan Blue Thermo Scientific 15250-061
Tween-20 Sigma P7949-100mL
Vibrance antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories Inc. H-1800
VistaVision cover glasses, no. 1 VWR 16004-098
Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) Thermo Scientific 33-9100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. Fuchs’ corneal dystrophy. Expert Review of Ophthalmology. 5 (2), 147-159 (2010).
  2. Ku, B., et al. Endothelial cell loss in penetrating keratoplasty, endothelial keratoplasty, and deep anterior lamellar keratoplasty. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (4), 199 (2017).
  3. Gain, P., et al. Global survey of corneal transplantation and eye banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  4. Braunstein, R. E., Airiani, S., Chang, M. A., Odrich, M. G. Corneal edema resolution after "descemetorhexis&#34. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 29 (7), 1436-1439 (2003).
  5. Pan, J. C., Eong, K. G. A. Spontaneous resolution of corneal oedema after inadvertent ‘descemetorhexis’ during cataract surgery. Clinical and Experimental Ophthalmology. 34 (9), 896-897 (2006).
  6. Shah, R. D., et al. Spontaneous corneal clearing after Descemet’s stripping without endothelial replacement. Ophthalmology. 119 (2), 256-260 (2012).
  7. Ziaei, M., Barsam, A., Mearza, A. Spontaneous corneal clearance despite graft removal in Descemet stripping endothelial keratoplasty in Fuchs endothelial dystrophy. Cornea. 32 (7), 164-166 (2013).
  8. Huang, M. J., Kane, S., Dhaliwal, D. K. Descemetorhexis without endothelial keratoplasty versus DMEK for treatment of fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 37 (12), 1497 (2018).
  9. Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Pilot study of corneal clearance with the use of a rho-kinase inhibitor after descemetorhexis without endothelial keratoplasty for Fuchs endothelial corneal dystrophy. Cornea. 40 (7), 899-902 (2021).
  10. Macsai, M. S., Shiloach, M. Use of topical rho kinase inhibitors in the treatment of Fuchs dystrophy after Descemet stripping only. Cornea. 38 (5), 529-534 (2019).
  11. Moloney, G., et al. Descemetorhexis without grafting for Fuchs endothelial dystrophy-supplementation with topical ripasudil. Cornea. 36 (6), 642-648 (2017).
  12. Thalmann-Goetsch, A., Engelmann, K., Bednarz, J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 75 (5), 490-495 (1997).
  13. Landshman, N., et al. Regeneration of cat corneal endothelium induced in vivo by fibroblast growth factor. Experimental Eye Research. 45 (6), 805-811 (1987).
  14. Lee, J., Blaber, M. Increased functional half-life of fibroblast growth factor-1 by recovering a vestigial disulfide bond. Journal of Proteins & Proteomics. 1, 37-42 (2010).
  15. Xia, X., et al. Engineering a cysteine-free form of human fibroblast growth factor-1 for "second generation" therapeutic application. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (4), 1444-1453 (2016).
  16. Eveleth, D., Pizzuto, S., Weant, J., Jenkins-Eveleth, J., Bradshaw, R. Proliferation of human corneal endothelia in organ culture stimulated by wounding and the engineered human fibroblast growth factor 1 derivative TTHX1114. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: the Official Journal of the. 36 (9), 686-696 (2020).
  17. TTHX1114(NM141) in Combination With DWEK/DSO. ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04676737?term=TTHX1114&draw=2&rank=2 (2020)
  18. Soh, Y. Q., et al. Predicative factors for corneal endothelial cell migration). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 338-348 (2016).
  19. van Dooren, B. T. H., Beekhuis, W. H., Pels, E. Biocompatibility of trypan blue with human corneal cells. Archives of Ophthalmology. 122, (2004).
  20. Davies, E., Jurkunas, U., Pineda, R. Predictive Factors for Corneal Clearance After Descemetorhexis Without Endothelial Keratoplasty. Cornea. 37 (2), 736-742 (2018).
  21. Borkar, D. S., Veldman, P., Colby, K. A. Treatment of Fuchs endothelial dystrophy by Descemet stripping without endothelial keratoplasty. Cornea. 35 (10), 1267-1273 (2016).
  22. Amano, S., Mimura, T., Yamagami, S., Osakabe, Y., Miyata, K. Properties of corneas reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal stroma. Japanese Journal of Ophthalmology. 49 (6), 448-452 (2005).
  23. Rolev, K., OʼDonovan, D. G., Coussons, P., King, L., Rajan, M. S. Feasibility study of human corneal endothelial cell transplantation using an in vitro human corneal model. Cornea. 37 (6), 778-784 (2018).
  24. Spinozzi, D., et al. In vitro evaluation and transplantation of human corneal endothelial cells cultured on biocompatible carriers. Cell Transplantation. 29, 1-11 (2020).
  25. Garcin, T., et al. Three-month storage of human corneas in an active storage machine. Transplantation. 104 (6), 1159-1165 (2020).

Tags

Corneal Organ CultureDescemet’s Stripping Only (DSO)Fuch’s Endothelial Corneal Dystrophy (FECD)Engineered Fibroblast Growth Factor 1Endothelial KeratoplastyCorneal Endothelial CellsDescemet’s MembraneCorneal GuttaeWound HealingCorneal Transplantation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pizzuto, S., Duffey, G., Weant, J., Eveleth, D. A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet’s Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1. J. Vis. Exp. (185), e63482, doi:10.3791/63482 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image