ニワトリ孵化子の聴覚脳幹応答の評価

ここで説明する実験は、ノースウェスタン大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに従って実施されました。 1. 鶏の飼育 受精した白いレッグホーン鶏の卵を入手してください。注:科学研究に使用されているいくつかの鶏の品種がありますが、ここに示されている結果は白いレッグホーンチキン(Gallus gallus domesticus)からのものです。品種間のABRのばらつきは不明であるが、成体の産卵鶏と肉を生産するブロイラー鶏を比較すると、いくつかの違いが見つかっている24,25。 卵を38°C、湿度50%で、所望の試験日の21日前に孵化させる。注:卵を38°Cですぐに孵化させない場合は、14°C、湿度40%で保存できます。しかし、卵が14°Cに長く保たれているほど、生存可能な孵化子に発達する可能性は低くなります。7日後、卵の生存率は、卵が14°Cに保たれる期間に応じて50%まで低下する可能性があります。 卵の生存率も冬には低下します。 定期的に卵を1日2〜3回回します。ほとんどのインキュベーターには、これを自動的に実行するメカニズムがあります。 6個以上の卵を保持する発泡スチロールインキュベーターまたはインキュベーターを使用する場合は、孵化前日に卵子を小型の38°Cインキュベーターに移し、胚発生20日目(E20)。卵はインキュベーターにセットされてから21日後(E21)に孵化する必要があります。注:孵化の過程で、動物は卵から「配管」し始め、最終的に卵全体の周りを回る小さな穴を作ります。条件が乾燥しすぎると、卵が乾燥し、動物は孵化できなくなります。湿度は、卵の孵化生存率に関する以前の研究に基づいて、約50%に保つ必要があります26,27,28,29。 動物の年齢を決定します。ハッチが直接目撃されない場合、年齢の唯一の指標は羊水が乾燥するのにかかる時間が2〜3時間です。注:孵化子インキュベーターは、処理された孵化子の数に基づいて、毎日70%イソプロピルアルコールで徹底的に清掃する必要があります。鶏の孵化子はしばしば排泄物、羽毛、羊水をインキュベーターに残し、条件や空気の質を汚染する可能性があります。 2. 薬物製剤 動物を大きな計量ボートに入れて体重を量る。十分に穏やかな配置で、動物は動くべきではありません。注:質量は30〜45gの範囲です。若い動物は、卵黄の埋蔵量のためにしばしば重く、まだ廃棄物を排泄していません。24歳に近づく年配の動物とP2は通常体重が少ないです。 ケタミン(100mg / mL)とキシラジン(20mg / mL)の麻酔薬カクテルを調製し、投与量が動物の体重に基づいて50mg / kgケタミンおよび16.68mg / kgキシラジンになるようにする。注:この薬のカクテルは、1 mLのケタミン(100 mg / mL)、1.5 mLのキシラジン(20 mg / mL)、および2.5mLのH 2 Oで作ることができます麻酔カクテル注射は、動物の体重の30〜45 gの範囲に基づいて0.05〜0.1 mLの範囲です。 3. 薬物注射と動物準備 片手で動物を持ち、足を下に押さえるようにしてください。 動物の胸骨、キールを感じてください。キールの両側には胸の筋肉があります。 29G針と注射器を使用して皮膚に5mm浸透させ、ケタミン/キシラジンカクテルを乳房の筋肉に注入します。動物の体重に基づいて0.05〜0.1mLを注射する。 注射後、動物をインキュベーターに戻します。麻酔薬が効くので、動物の体温を数分間維持します。 鉗子を使って動物のつま先をつまみ、首がぐったりしているかどうかを確認します。反射がなく、首がぐったりしている場合、動物は無意識です。 羽の羽を使って鶏の性別を決定します。羽がすべて同じ長さであれば、動物は男性です。羽の長さが異なる場合、動物は女性30です。注:動物を性交する別の方法は通気です。男性性器はクロアカ31に見られる。この方法は非常に困難であり、正しく行われないと動物に害を及ぼす可能性があります。翼羽法を使用することをお勧めします。 綿の先端アプリケーターで脱毛クリームを頭と首の部分、特に鳥の耳の開口部の近くに塗布します。 70%イソプロピルアルコールワイプを使用して、羽毛、残りの脱毛クリーム、頭と首の皮膚を拭き取ります。 70%イソプロピルアルコールワイプを使用して、皮下電極と直腸プローブを滅菌します。 動物を遮音および電気的に遮蔽されたチャンバーに入れる。環境が電気的および音響的ノイズを最小限に抑え、最高の録音を行うようにします。注:ここでの実験は、24 x 24 x 25インチのカスタム免音エンクロージャで行われました。音響ノイズ、および交流電流(米国では60Hz)からの電気ノイズを排除する部屋または部屋であれば十分です。 動物の体温を維持するために、加熱パッドまたは温度制御システムを使用してください。 潤滑された直腸プローブを挿入して、動物の体温が37〜41°C(98.6〜105°F)の間で維持されていることを確認してください32,33。注:プローブのサイズが正しくない場合、動物は温度プローブの上に横たわることができます。 動物の頭を所定の位置に固定するか、くちばしを物体に押し付けて、不要な動きを避けます。これは、呼吸が妨げられていない場合、粘土をモデリングすることで行うことができます。 動物が試験中に意識を取り戻し始めた場合、元の投与量の2分の1である麻酔薬カクテルの補助注射を投与する。注:体の動きや発声は、サプリメントの投与量を投与しなければならないという兆候です。小さなくちばしの動きは呼吸を示し、許容されます。 4. 電極の配置 参照電極、活性電極、および共通接地電極の 3 つのステンレス鋼、塩化銀ニードル電極を使用します。メモ: 参照電極は、反転または「-」とも呼ばれます。活性電極は、非反転または「+」とも呼ばれる。 各電極を頭部に皮下に2〜3mm入れるが、頭蓋骨を貫通するほど深くはない。長さ7mm、直径0.4mmの電極を使用してください。 電極を皮膚から突き出し、先端を露出させます。これは、皮膚との接触を最小限に抑え、動物34全体にわたって一貫した挿入深さを保証するのに役立つ。注:電極線は、電極を配置した後、電極を引き抜いたり、皮膚を引っ張ったりする張力がないように、十分な弛みがあるはずです。 シングルチャンネル録音の場合は、正中線の頭蓋骨の上、外耳道の尾まで活性電極を配置します。 参照電極を刺激が届く耳の後ろに置き、グランド電極を首の反対側の外耳道の後ろに置きます。注:動物の頭蓋骨または外耳道で手術を行う場合は、動物の正中線の首の参照電極を置きます。これとステップ 4.4.1 はどちらも水平電極記録モンタージュと見なされます。 2 チャンネル録音の場合は、アダプター・ケーブルを必要とする 2 つの負極と結合された正極を使用します。接地電極を皮下に首に置き、各外耳道の後ろに1つの参照電極を置きます。 電極のインピーダンスを確認します。電極全体のインピーダンスが5.0kΩを超えないようにしてください。電極間インピーダンスを3.0kΩ以下に維持してください。 5. ABR録音 集録ハードウェアとソフトウェアに応じて、使用する刺激周波数にわたって正しいサウンドレベルが得られるようにキャリブレーションを実行してください。メモ:キャリブレーションの手法は機器によって異なります(説明を参照)。一部のプログラムでは、サウンド減衰をソフトウェア内で編集できます。ここで実施された較正手順では、1/8インチのB&K 4138コンデンサーマイクロホンを使用して、ひよこの外耳道(約5mm)に近似した閉じたカプラーシステム内で周波数刺激を記録しました。鶏の孵化子校正表は 補足表として提供されています。 音変換装置を動物の活動的な耳に向かって動かす。音響探触子を外耳道の2mmの浅い深さに置きます。メモ:音響探触子によっては、プラスチック製の鏡を外耳道に取り付けて挿入することができます。スペキュラムの配置は重要です。音が運河の壁によって遮られたり、外耳道が挟まれて閉じられたりすると、ABRは存在しないか、しきい値の〜40dBシフトに似ています。 試験中に動物に結果が異常または存在しないかどうかを確認してください。その場合は、外耳道に音響探触子の位置を変えます。注:皮膚が緩んでおり、動物の動きが可能であるため、録音中に鏡の配置がずれることがあります。しかし、正しい麻酔薬注射と動物が完全に意識を失えば、記録は30〜45分間中断されずに行うことができます。 6. データ取得 十分な機器/ソフトウェアを利用して、音刺激を生成し、ABR録音を録音/取得します。メモ:ABR取得用の市販またはカスタムシステムは数多くあります。これらの実験には、市販のインテリジェント聴覚システム(IHS)SmartEP USBプラットフォームが使用されました。記録パラメータを操作する機能は非常に重要です。これらには、刺激強度、刺激長、刺激周波数、刺激提示率、ハイパスおよびローパスフィルタ、アーチファクト除去、掃引数、サンプリング速度、エンベロープ形状、および刺激分極が含まれるがこれらに限定されない。 アーチファクト除去(AR)の上限と下限を±25μVに設定し、スイープ中の動物の動きやノイズがそのスイープを解析から除外するようにします。テストされた母集団全体で、アーティファクトのために拒否された掃引全体の1%未満でした。 少なくとも1024回のスイープを収集して、総平均応答を求めます。これは、それぞれ512スイープの2つの録音で行うことができます。これにより、応答が刺激を誘発し、反復可能であることも保証されます。 ゲインを 100,000、ローパスフィルタを 100 Hz、ハイパスフィルタを 3000 Hz に設定します。メモ: ローパスフィルターとハイパスフィルターの設定は、IHS システムを使用した録音に最適です。したがって、これらのパラメーターは推奨事項です。BIOSIGソフトウェアを使用した他の鳥類のABR記録は、30〜3000Hz 5、13、14、16、22の間の信号をフィルタリングした。 刺激の提示率を 1 秒あたり 10 ~ 20 の刺激に設定します。プレゼンテーション率が高いと、ABR のピーク待機時間が、特に後のピーク13 でシフトします。プレゼンテーション率が低いと、ABR の取得に必要な時間が長くなります。 クリック刺激の時間時間を100μsに設定します。 トーンバースト刺激を使用する場合は、目的の効果に基づいて刺激の周波数と持続時間を編集します。トーンバースト刺激には100〜4000Hzの範囲が用いられたが、成鶏の行動聴覚の範囲は2〜9000Hz35の範囲であった。メモ: IHS システムでは、トーンバースト刺激の立ち上がり時間と立ち下がり時間は、スペクトルエンベロープ形状が台形である場合にのみ変更できます。ただし、余弦の二乗エンベロープとブラックマンエンベロープは、動物のABR実験で一般的に使用されるプリセットの立上り時間と立ち下がり時間を提供します。IHSシステムは、トーンバーストのスペクトルエンベロープを表示して、適切な立上り時間と立ち下がり時間を確保することができます。クリック刺激の立ち上がり時間と立ち下がり時間はIHSでは編集できません。 サンプリングレートを許容最大値(通常は40kHz)に設定して、最高の解像度のデータを得ます。注: IHS を含む一部のシステムでは、限られた数のサンプリング・ポイントが使用され、記録ウィンドウの長さが変更されます。40 kHz(25 μs周期)のサンプリングレートでは12ミリ秒の記録ウィンドウしか許さないため、トーンバーストABRをキャプチャするには、20 kHzのサンプリングレート(50 μs周期)を使用して24ミリ秒の記録ウィンドウを可能にしました。クリックとトーンバーストのABRを直接比較する場合は、サンプリングレートを一定に保ち、同じ解像度を維持します。 刺激分極を交互に設定します。これは、ABR録音から蝸牛マイクロフォニックの視覚化を排除するために行われます。蝸牛マイクロフォニックを視覚化するには、刺激極性の希薄化または凝縮を使用します。メモ: 刺激を選択するときに、多くの設定を変更できます。提供されるゲインとフィルタの設定は、他の機器の設定には最適ではない場合があります。ほとんどのABRマシンの工場出荷時のデフォルトは、孵化鶏に記録するように設定されていません。 512 回のスイープを記録する場合は、2 つの別々のテストを組み合わせて、1024 回のスイープ平均を作成します。 クリックまたはトーンバースト刺激の場合は、超閾値強度でABRを獲得します。 誘発された応答が識別できなくなるまで、より低い強度で記録を続けます。 ABR閾値を、検出可能な誘発応答を惹起する最も低い刺激強度として定義する。刺激強度を 5 dBSPL のステップで下げて、検出可能なピークを引き出す最も低い刺激強度を見つけます。 7. 安楽死と実験終了 ABRが取得されたら、安楽死溶液(ペントバルビタールナトリウム390mg / mLフェニトインナトリウム50mg / mL)の過剰摂取(0.1mL)を調製する。 つま先のピンチで反射がないことを確認した後、安楽死液を29G針で乳房筋肉に5mmの深さで注入する。注射技術は麻酔薬注射と同じである。注:動物は数分後に有効期限が切れます。動きが検出されなくなるまで動物を操作したり首を切ったりしないでください。代替の安楽死技術は、翼の下の上腕静脈に静脈内注射を行うことである。 動物が反射的でなく、呼吸と鼓動が止まったらすぐに、鋭いはさみやはさみで素早く首を切ってください。 加熱パッド、直腸プローブ、および塩化銀電極を70%イソプロピルアルコールワイプで清掃します。 取得したすべてのトレースが保存されていることを確認します。さらに分析するには、ファイルを.txtファイルとしてエクスポートし、メモ帳で表示したり、スプレッドシートにインポートしたりできます。