השתמשנו בטכניקות סטנדרטיות של תגובה לגזע מוחי שמיעתי (ABR) ויישמנו אותן על תרנגולות בוקעות, מודל עופות מקדים לתפקוד שמיעתי. הפרוטוקול מתווה בפירוט את הכנת בעלי החיים ואת טכניקות רכישת ABR, עם שלבים שיכולים להיות מתורגמים למודלים אחרים של עופות או מכרסמים.
תגובת גזע המוח השמיעתי (ABR) היא בדיקה שלא תסולא בפז באודיולוגיה קלינית, בבעלי חיים שאינם בני אדם ובמחקר בבני אדם. למרות השימוש הנרחב ב-ABRs במדידת סינכרון עצבי שמיעתי ובהערכת הרגישות לשמיעה במערכות מודלים אחרות של בעלי חוליות, שיטות לרישום ABRs בתרנגולת לא דווחו במשך כמעט ארבעה עשורים. תרנגולות מספקות מודל חזק למחקר בבעלי חיים מכיוון שמערכת השמיעה שלהן קרובה להבשלה תפקודית בשלבי הבקיעה העובריים המאוחרים ובשלבי האבקוע המוקדמים. הדגמנו שיטות המשמשות ליצירת הקלטות ABR חד-ערוציות או דו-ערוציות באמצעות מערכי אלקטרודות מחט תת-עוריות באבקועני עוף. ללא קשר לתצורת הקלטת האלקטרודות (כלומר, מונטאז’), הקלטות ABR כללו 3-4 צורות שיא חיוביות בתוך 6 אלפיות השנייה הראשונות של גירוי קליק suprathreshold. משרעת צורת הגל של שיא לשוקת נעה בין 2-11 μV ברמות של עוצמה גבוהה, כאשר פסגות חיוביות הציגו תפקודי עוצמת השהיה צפויים (כלומר, עלייה בהשהיה כפונקציה של ירידה בעוצמה). מיקום אוזניות סטנדרטי היה קריטי להקלטות אופטימליות מכיוון שעור רפוי יכול לחסום את תעלת האוזן, ותנועת בעלי חיים יכולה לנתק את מתמר הגירוי. משרעת השיא הייתה קטנה יותר, והאחריות הייתה ארוכה יותר ככל שטמפרטורת הגוף של בעלי החיים ירדה, מה שתמך בצורך בשמירה על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית. עבור אבקועים צעירים (<3 שעות לאחר הבקיעה ביום הראשון), הסף הועלה ב~5 dB, שיא ההפסקות עלה ~1-2 אלפיות השנייה, ואמפליטודות השיא של שוקת לשוקת ירדו ~1 μV בהשוואה לאבקועים מבוגרים יותר. זה מצביע על בעיה פוטנציאלית הקשורה להולכה (כלומר, נוזל בחלל האוזן התיכונה) ויש לקחת אותה בחשבון עבור אבקועים צעירים. באופן כללי, שיטות ה-ABR המתוארות כאן מאפשרות הקלטה מדויקת וניתנת לשחזור של תפקוד שמיעתי in-vivo באבקועני עוף שניתן ליישם בשלבי התפתחות שונים. ממצאים כאלה מושווים בקלות למודלים אנושיים ויונקים של ליקוי שמיעה, הזדקנות או מניפולציות אחרות הקשורות בשמיעה.
המחקר של תגובות עצביות מעוררות לגירויים קוליים מתוארך למעלה מחצי מאה1. תגובת גזע המוח השמיעתי (ABR) היא פוטנציאל מעורר המשמש כמדד לתפקוד שמיעתי הן בבעלי חיים שאינם בני אדם והן בבני אדם במשך עשרות שנים. ה-ABR האנושי מציג חמש עד שבע פסגות בצורת גל המסומנות באופן קונבנציונלי על ידי ספרות רומיות (I-VII)2. פסגות אלה מנותחות על סמך ההשהיה שלהן (זמן ההתרחשות באלפיות השנייה) והמשרעת (גודל שיא לשוקת במיקרו-וולטים) של התגובות העצביות. ה-ABR מסייע בהערכת התפקוד והשלמות של עצב השמיעה, כמו גם רגישות לגזע המוח ולסף השמיעה. ליקויים במערכת השמיעה גורמים להיעדרות, מופחתת, ממושכת או חריגות של ABR ולאמפליטודות. למרבה הפלא, פרמטרים אלה כמעט זהים בבני אדם ובבעלי חיים אחרים, מה שהופך אותו למבחן אובייקטיבי עקבי של תפקוד שמיעתי על פני מודלים של בעלי חוליות3.
מערכת מודל אחת כזו היא העוף, והיא שימושית במיוחד ממגוון סיבות. ציפורים ניתן לסווג כמו altricial או precocial4. ציפורים אלטריאליות בוקעות עם חושים שעדיין מתפתחים; לדוגמה, ינשופי אסם אינם מראים ABR עקבי עד ארבעה ימים לאחר הבקיעה5. בעלי חיים מוקדמים כמו העוף בוקעים עם חושים כמעט בוגרים. הופעת השמיעה מתרחשת בהתפתחות העוברית, כך שימים לפני הבקיעה (היום העוברי 21), מערכת השמיעה קרובה להבשלה תפקודיתשל 6,7,8. ציפורים אלטריאליות ורוב המודלים של יונקים רגישים לגורמים חיצוניים המשפיעים על ההתפתחות ודורשים גידול בעלי חיים עד שהשמיעה מבשילה. ניתן לבצע ABRs עוף באותו יום כמו הבקיעה, ולוותר על הצורך בהאכלה או בסביבה מועשרת.
העוף העוברי היה מודל נחקר היטב לפיזיולוגיה והתפתחות, במיוחד בגזע המוח השמיעתי. מבנים ספציפיים כוללים את גרעין שבלול העוף, המחולק לגרעין מגנוצלריס (NM) וגרעין זוויתי (NA), ואת מתאם העופות של הזית העליון המדיאלי המכונה גרעין למינריס (NL)6,7. ה-ABR אידיאלי להתמקדות בתפקוד השמיעתי המרכזי לפני רמת המוח הקדמי וקליפת המוח הקדמי. תרגום בין מדידות ABR in-vivo לבין מחקרים עצביים במבחנה של התפתחות8, פיזיולוגיה9, טונוטופיה10 וגנטיקה11,12 מספק הזדמנויות מחקר אידיאליות התומכות במחקרים של תפקוד שמיעתי כולל.
למרות שה-ABR נחקר בהרחבה במודלים של יונקים, היה פחות מיקוד עבור עופות. מחקרי ABR קודמים של העופות כוללים אפיונים של הבודגריגר13, נקר14, שחף15, ציפורי צלילה16, זברה פינץ’17, עופות דורסיםיומיים 18, קנרית19, שלושה מינים של ינשוף 5,20,21,22 ועוף 23. בהתחשב בכמעט ארבעה עשורים שחלפו מאז האפיון היסודי האחרון של העוף ABR, רבים מהציוד והטכניקות ששימשו בעבר השתנו. תובנות ממחקרים במודלים אחרים של עופות יכולים לסייע בפיתוח מתודולוגיית ABR של עוף מודרני תוך שהם משמשים גם כהשוואה ל-ABR העוף. מאמר זה יתווה את המערך והתכנון הניסיוניים כדי לאפשר רישום ABR בתרנגולות האבקועות שניתן ליישם גם על שלבי התפתחות עובריים ועל מודלים אחרים של מכרסמים קטנים ועופות. בנוסף, בהתחשב בהתפתחות המוקדמת של העוף, ניתן לבצע מניפולציות התפתחותיות ללא כל גידול בעלי חיים נרחב. ניתן להעריך מניפולציות לעובר מתפתח שעות ספורות בלבד לאחר שבעל החיים בוקע עם יכולות שמיעה כמעט בוגרות.
גזע המוח השמיעתי של ציפורים נחקר היטב, ומבנים רבים מקבילים למסלול השמיעה של היונקים. עצב השמיעה מספק קלטים מעוררים על שני הגרעינים המרכזיים מסדר ראשון, גרעין השבלול מגנוצלריס (NM) וזוויתי (NA). NM שולחת הקרנה מעוררת באופן דו-צדדי אל המטרה השמיעתית שלה, גרעין למינריס (NL)7. NL מקרין לגרעין mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. NL מקרין גם את גרעין האוליברי העליון (SON), המספק עיכוב משוב ל-NM, NA ו-NL42. המיקרו-מעגל של גזע המוח השמיעתי התחתון הזה נשמר בצורה נהדרת לתפקוד שהוא משרת, לוקליזציה קולית ושמיעה דו-כיוונית33. לאזורי גזע המוח השמיעתי העליון של הציפור יש גם גרעינים המקבילים ללמניסקוס הלטרלי של היונקים ולקוליקולוס נחות במוח האמצעי. בהתחשב בדמיון זה, הרכב ה- ABR של העופות עד המוח האמצעי השמיעתי דומה בכל בעלי החוליות.
בעוד שמיני עופות רבים מראים שלוש פסגות חיוביות בטווח של 6 אלפיות השנייה לאחר הופעת הגירוי, המתאם של פסגות ABR עם מבנים שמיעתיים מרכזיים אכן כולל שונות מסוימת. ניתן להניח באופן סביר שגל I הוא התגובה העצבית הראשונה של הפפילה הבזילרית ההיקפית ועצב השמיעה, והוא מפגין שונות מועטה בין פרטים (איור 1C). זיהוי הגלים הבאים פחות ודאי ועשוי להיות שונה בין המינים. Kuokkanen et al.17 קבעו לאחרונה כי גל III של ABR של ינשוף האסם נוצר על ידי NL; לפיכך, סביר לטעון כי גל II מקורו ב- NM ו- NA של גרעין השבלול20. עם זאת, גל הינשוף III הוגדר כשיא חיובי שנוצר 3 אלפיות השנייה לאחר הופעת הגירוי. זה מתאים לגל II כפי שמוגדר בתרנגולת האבקועה ABR. באסם ינשוף ABR, גלים I ו- II שולבו.
בעוד שעוף האבקוע מוצג בדרך כלל עם שלוש פסגות בטווח של 6 אלפיות השנייה, מדי פעם נצפתה פסגה רביעית (למשל, ראו איור 1A). יהיה צורך בנתוני אוכלוסייה, גודל מדגם גדול יותר ופרדיגמות ניסיוניות נוספות כדי לתמוך בגל רביעי, ובמקרים מסוימים בתרנגולת ABR בעלת חמישה גלים. הממצא העקבי ביותר היה שלושת ייצוגי השיא שהוצגו כאן.
מאחר שה-ABR מוגדר כמדד לסינכרוניזציה עצבית, הגרעינים העיקריים במסלול השמיעתי יכולים לייצג כל שיא חיובי ב-ABR. האות העובר מעצב השמיעה ל-NM/NA ולאחר מכן ל-NL עשוי להגדיר את גלים I, II ו-III ב-ABR של עוף האבקוע, בהתאמה. בנוסף, השיא הרביעי המאוחר יותר של ה-ABR של העוף יכול לייצג גזע מוח עליון או מבנה שמיעתי של המוח האמצעי. האפיון של ABRs העופות צריך גם לשקול את ההבדל בין ציפורים קדם-קוציואליות ואלטריאליות. ההבשלה של תגובות שמיעתיות תשתנה בין המינים ותושפע גם מתכונות קריטיות אחרות כמו התנהגות טורפים ו/או למידה קולית4. ללא קשר, השיטות והטכניקות המתוארות מיושמות בקלות על מגוון מיני עופות ובעלי חוליות.
החשיבות של שמירה על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים מודגמת באיור 2. ככל שטמפרטורת הגוף הפנימית ירדה, ההשהיה של תגובות ה-ABR עלתה עבור אותה רמת עוצמת גירוי. זה בולט יותר כאשר טמפרטורת הגוף יורדת מתחת ל 32 °C36,37. העלייה בהשהיה של כ-1 אלפיות השנייה ב-ABR נמוכה מבעברב-23 העוף. עם זאת, קטאיאמה23 השתמשה באבקוע בן 12 יום שהתקרר ולאחר מכן התחמם במשך 4 שעות. הנתונים באיור 2 תועדו במהלך תהליך הקירור במשך תקופה של 20 דקות. כדי לרכוש את האיכות הטובה ביותר ואת הרישומים העקביים ביותר, יש לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה, וכל ההקלטות צריכות להיעשות באותה טמפרטורה פיזיולוגית בקרב בעלי חיים.
השפעת הגיל על ה- ABR היא קלה אך חשובה לשקול. בעוד שרק ההשהיה של גלים I ו-II של ה-ABR הייתה שונה באופן משמעותי, הסיבה לכך היא שרק שלושה אבקועים צעירים שימשו באיור 3; שלושת האחרים לא הציגו שלוש פסגות ABR הניתנות לזיהוי. משרעת ABR ושינויי סף עשויים להיות ברורים גם אם משתמשים בגדלים גדולים של מדגם או משווים ABRs ספציפיים לתדר. השפעה זו הקשורה לגיל יכולה להיגרם על ידי נוזל באוזן התיכונה של העוף. שינויים מוליכים כאלה מובילים לעלייה ניכרת בסף ה-ABR הן עבור מודלים אנושיים והן עבור מודלים אחרים של יונקים38,39.
באמצעות שני מונטאז’ים שונים של הקלטה נצפו תגובות דומות (איור 4A). בעוד שהמונטאז’ הנפוץ ביותר ממקם את אלקטרודת הייחוס מאחורי האוזן המקבלת גירוי, אלקטרודת הייחוס ברקמת הצוואר יכולה להיות שימושית אם יש התערבות כירורגית המלווה את ה- ABR. עם זאת, אם נעשה שימוש בהקלטות ABR דו-ערוציות, יש למקם את אלקטרודות הייחוס בנפרד ובאופן סימטרי, דבר שקשה אם מניחים את אלקטרודת הייחוס בצוואר. המיקום המסטואידי של אלקטרודת הייחוס מומלץ לתקנן כמה שיותר היבטים של ההקלטה. הקלטת ABR דו-ערוצית היא כלי יעיל הדורש מעט הכנה נוספת ומביאה לתגובות דומות בין האוזניים. הבדלי משרעת קלים נבעו ככל הנראה ממיקום האוזנייה. הקלטה דו-ערוצית מאפשרת השוואה קלה בין אוזן או חצי כדור מוח שעברו מניפולציה ניסיונית לעומת שליטה. הגדרה זו תידרש גם לבדיקת ABRs דו-כיווניים. ניסויים עתידיים באמצעות ABR עוף יכולים להתייחס לספרות קודמת על תצורות הקלטה ומונטאז’ים34.
מתודולוגיה זו אכן מגיעה עם מספר מגבלות. כפי שצוין בשלב 5.1, מיקום ספקולום לקוי יכול להוביל לשינוי של 40 dBSPL בתגובה. זה יכול לגרום לפרשנות שגויה של בעל חיים שעבר מניפולציה או שינוי. אמצעי הזהירות הבאים מומלצים: לרכוש מדגם גדול של נתוני בקרה לפני רכישת ה- ABRs של מודלים מניפולטיביים או מוטנטיים. אין להפחית את עוצמת הגירוי ביותר מ-20 dBSPL בין ההקלטות. אם המשרעת או ההשהיה זזות יותר מהצפוי, בדקו את מיקום החיה והספקולום. חזור על גירוי ABR כדי להתבונן בשינויים. אם הספקולום זז, בדוק מחדש בדיקות קודמות. מגבלה נוספת היא כיול של ABRs. ללא כיול מתאים להקלטת רמת לחץ הקול, העוצמה המוצגת לבעל החיים אינה ידועה. בעת מדידת פלט קול, השתמש באותו ספקולום כמו בהקלטה ניסיונית ובמיקרופון קטן בתוך חלל המעריך את אורך תעלת האוזן של החיה (כ-5 מ”מ). מדוד את אותם תדרי טון המשמשים בניסויים, מכיוון שהכיולים הם ספציפיים לתדרים. המדריך הן למערכות חומרה והן למערכות תוכנה עשוי להגיע עם הוראות לכיול. ישנם גם מסננים נוספים כגון מסנני פאזה ליניארית ומסנני פאזה מינימליים, אשר יכולים לשפר את הלחץ ואת הטון פרץ ABRs43. מסננים אלה לא שימשו במחקר הנוכחי. גם שיקולים נוספים, כמו זמן העלייה והירידה של מעטפת ספקטרלית של פרץ טון המשתנה כפונקציה של תדירות או שינוי זמן העלייה והירידה של גירויי הקליק לא נבדקו. אלה הן חקירות עתידיות טובות ברגע שניתן יהיה לרכוש ABRs אמינים ועקביים.
ההשוואה של עוף האבקוע לדגמי עופות אחרים מבטיחה. גם בודג’ריגרים וינשופים מזרחיים מציגים שלוש פסגות חיוביות של מיקרו-וולט בתוך 6 אלפיות השנייה הראשונות של ה-ABR13,22. במינים שונים של נקרים נראים גם שלוש פסגות, אך ההשהיה שלהם מאוחרת יותר בזמן. בנוסף, טווח רגישות התדרים הטובה ביותר בנקרים הוא בין 1500 ל-4000 הרץ, שהוא מעט גבוה יותר מהסף הטוב ביותר של העוף ב-1000 הרץ. אצל העוף הבוגר, הרגישות הטובה ביותר היא ב-2000 הרץ35, כך שייתכן שיהיה שיפור בשמיעה על תדרים גבוהים ככל שאבקועים של עוף יתפתחו למבוגרים. התפתחות זו תהיה שונה בין מיני הציפורים, תוך התחשבות בהתפתחות המטריאלית או המוקדמת של החיה4.
השיטות הניסוייות המתוארות כאן יכולות לסייע בקביעת הגורמים המובילים לפגיעה או לשינויים בתגובות ובספי הסף השמיעתיים, כמו גם במחקרים בשלבים שונים של התפתחות עוברית. מניפולציה גנטית, הזדקנות וחשיפה לרעש הן כולן מניפולציות ידועות בבעלי חיים ובמודלים אחרים של עופות 24,25,44,45. יש להרחיב את השיטות הללו למודל העוף כעת, כאשר טכניקות כמו אלקטרופורציה בתוך אובו מאפשרות ביטוי של חלבונים הנשלטים באופן מוקדי וזמני בצד אחד של גזע המוח השמיעתי12,46. זה מאפשר השוואה ישירה של ABRs מהאוזן שעברה מניפולציה גנטית לאוזן הבקרה הקונטרה-צדדית באמצעות פרדיגמת הקלטה דו-ערוצית.
באופן כללי, ה-ABR של תרנגולות האבקועים הוא שיטת מחקר שימושית, כמעט זהה למדידות של תפקוד השמיעה במודלים אנושיים ואחרים של יונקים. זוהי גם מתודולוגיה לא פולשנית, in-vivo . מלבד הזרקת הרדמה ומיקום אלקטרודות תת-עוריות של כמה מילימטרים, אין צורך במניפולציה פיזיקלית אחרת. תיאורטית ניתן לבחון אבקוע מספר פעמים במהלך זמן התפתחותי של ימים או שבועות אם הוא נשמר בסביבה מתאימה. פרוטוקול זה לא רק מפרט את הצעדים הדרושים ואת פרמטרי הרישום עבור עוף האבקוע ABR, אלא הוא מציע מאפיינים של ABR עוף שיכולים ליידע בדיקות נוספות לתפקוד גזע המוח השמיעתי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על-ידי NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |