胚性ニワトリ聴覚脳幹をスライスしてトノトピック勾配とマイクロ回路を評価する

ここに示すすべての脳幹スライスは、脳幹組織(~200-300 μm)から取得され、5倍の対物レンズおよび微分干渉コントラスト(DIC)光学系を使用して画像化されました。カメラは解剖顕微鏡に取り付けられ、画像取得ソフトウェアを備えたコンピューターに接続されました(材料表を参照)。これらの図の衛星挿入図(右パネル)は、60倍の倍率の水浸対物レンズを使用して画像化されました。デジタル画像を取得する際に、脳幹スライスのすべての領域が均等に拡大されるように注意が払われました。写真は最適な明るさと焦点で撮影されました。脳幹スライスのデジタル画像は、重なり合う領域に基づいて平面的にステッチされ、明るさ、コントラスト、およびグレースケールをさらに調整するためにデスクトップコンピューターにインポートされました。ニワトリ聴覚脳幹の基本的な微小回路は、以前の研究1,2,5,13に従って同定された。顕微鏡(5倍対物レンズ)では、聴覚核は、スライスの背側領域に沿って同側および反対側の両方で各核の周りを行き交う重有髄神経線維に隣接する領域として特定されました。 図1は、E21ニワトリ胚由来の脳幹組織(200〜300μm)の伝統的な冠状切片を示しています。ここに示す4つの冠状動脈スライスは、聴覚脳幹核の相対的な等周波領域を表しており、最も低いCF聴覚領域(図1A、尾側)から最も高いCF聴覚領域(図1D、吻側内側)まで進行しています。図1A-Dの4つの冠状スライスすべてについて、標識されたNMとNLの拡大領域が中央の列に表示され、図パネルの右側に拡大(60倍の対物レンズ)が示されています(それぞれ衛星挿入図のaとb)。図1A,Bの矢印は聴神経線維の入力を示し、矢印はスライスの左側のNM軸索の分岐を示しています。図1Cは、角核として知られる別の鳥類蝸牛核構造を示しています(NA、左矢印、右矢印)。2つの最も吻側の冠状動脈スライスは、冠状動脈スライスの腹側外側領域に沿って位置する上オリバリー核(SON)を示しています(図1C、D、白い破線の円)。 図2は、E21ニワトリ胚由来の脳幹組織(200-300μm)の矢状切片を示す。3つの矢状スライスすべて(図2A-C)について、標識されたNMとNLの拡大領域が中央の列に表示され、図パネルの右側に拡大(60倍の対物レンズ)が表示されます(衛星画像ではそれぞれaとb)。NMとNLは、聴神経線維(図2A、中央の矢印)が高倍率で観察されたニューロンのクラスターに入り(図2A、中央、小、白い破線の円と矢印)、聴覚領域の始点を強調している場所を特定しました(図2A、左、大、白い破線の円と矢印)。SONは、最も外側のスライスの吻側外側領域で同定された(図2A、小さい、白い、破線の円)。図2Bは、NMおよびNLからの比較的低CFおよび高CFの両方の聴覚領域を吻側尾軸に沿って含む拡張トノトピック領域を示す(白色の輪郭領域、衛星挿入図も参照)。図2Cは、最も内側スライスの同側および反対側の軸索房および聴覚領域の終点(左および中央矢印)を示す。ここに示すスライスの向きは、図1に見られるような従来のスライスの向き(すなわち、冠状)とは対照的です。これは、電気生理学的記録に必要なガラスピペットのアプローチに最も適した向きを表示するために行われた。 トノトピック軸の大きな領域が図2Bに表されていることを確認するために、NMニューロンからの電流クランプ電気生理学記録を行った。 図3は、冠状スライス(図3A、B)および矢状スライス(図3C、D、補足ビデオS1、S2)から記録された成熟(E21)NMニューロンの機能的類似点および相違点を示す。2つのNMニューロンを冠状スライスの内側および外側の端から選択し(図1Bに示すスライスと同様)、矢状スライスのNMの吻側端および尾側端から2つのNMニューロンを選択した(図2Bに示すスライスと同様)。図3A、Bは、体細胞電流注入と同様の電気生理学的応答特性を示しています(−100 pA〜+200 pA、+10 pA刻み、100 ms持続時間)。これら2つのNMニューロンの発火パターンは、このスライス平面において微妙な違いを示し、中周波NMニューロンの相対的な等周波ラミナを示す。図3C,Dは、発火パターンが吻側-尾側軸全体で実質的な違いを有することを示しており、低周波NMニューロン(図3C)から高周波NMニューロン(図3D)への比較的高いトノトピック勾配を示しています。両方のニューロンは、以前に報告されたように、ステレオタイプの発火パターンを示しました14,15。 図4は、E21ニワトリ胚の脳幹組織(200-300μm)の水平断面を示す。両方の水平スライス(図4A、B)について、標識されたNMとNLの拡大領域が中央の列に表示され、図パネルの右側に拡大(60倍の対物レンズ)が表示されます(それぞれ衛星インセットのaとb)。水平スライスでは、NMとNLが正中線に向かって識別され、ニューロンは外側内側軸に沿って広がっていました(図4A、B、中央、白、破線の輪郭領域)。拡大画像は、トノトピック勾配の大きな範囲を示しています。低周波ニューロンは尾側領域にあり、高周波ニューロンは吻側内側領域にあります(図4A、B、右、衛星)。吻側 – 尾側軸に沿って正中線を通る繊維は、聴覚核の反対側の接続を示すが、これらの繊維の構成は単純な平面内ではない。ただし、水平/横断面からの鋭い角度スライスは、これらの軸索線維を矢状面に向かってたどることができます。水平面から鋭角(45°)で厚さ200〜300μMの脳幹組織のスライスを図5に示します。聴覚脳幹核は、最も外側のスライスから始まり、最も内側のスライスで終わる大きな斜めの広がりを横切って見ることができます(図5A-C、ラベル付きの中央パネル、白い輪郭の領域)。さらに、NMおよびNL領域の角度配向は、連続した非対称スライスで視覚化することもできます(図5A-C、ラベル付き中央パネル、白、破線の輪郭領域)。拡大画像(60倍対物レンズ)は、聴覚核が吻側内側軸から尾外側軸に沿って進むときの眼圧視軸を示しています(図5A-C、右、衛星挿入図)。図 5 のスライスの向きは、図 2 の向きと似ています。それらは従来の画像の提示とは対照的ですが、電気生理学的実験により適しています。 図1:脳幹の代表的な冠状連続切片。 (A-D) 左:尾軸から吻側軸へのスライス、聴覚核、および白い破線の円でマークされた接続繊維。中央の挿入物は聴覚領域のより大きなビューであり、核は白い破線の円a:NMおよびb:NL内に示されています。矢印は聴神経求心性線維を示し、矢印はA、BのNM軸索分岐を示す。矢印はCのNAを示す。横方向の白い破線の円は、C、DのSONを示しています。右:衛星挿入物は、これらの原子核を60倍の対物レンズで示しています:a:NMおよびb:NL。略語:NM =核マグノセルラリス;NL =核ラミナリス;NA =角核;SON =優れたオリバリー核;LF =比較的低周波ニューロン。MF =中周波ニューロン;HF =高周波ニューロン;D =背側;L =横方向。V =腹側。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:脳幹の代表的な矢状連続切片。 (A-C) 左:外側軸から内側軸へのスライスで、聴覚核は白い破線の円でラベル付けされています。中央の挿入物は、同じ聴覚核領域を拡大して示しており、白い破線の円でマークされています。(A)スライスの中央にある白い破線の円は、SONを強調しています。矢印は聴神経線維を示し、矢印はNAを示す。スライスの右側の先端にある暗い黒い斑点は、イメージングアーティファクトです。小脳の領域は、左パネルのスライスA及びBの両方で聴覚領域に対して背側が見ることができる。(B)向きが冠状面に変更された矢状スライス(スライス中)。聴覚領域は青色染料(黒い矢印)で識別され、矢状面で再びスライスされました。(A-C)中央の挿入NMおよびNL領域は、白破線でマークされています。右:60倍の対物倍率で観察されたa:NMとb:NLの衛星図。聴覚核におけるLFおよびHFトノトピック勾配は、吻側尾軸に沿って示される。(C)の暗い領域を指す矢印は、内側軸を通って正中線を横切って走る重有髄NM線維を示す。繊維は聴覚核の両側を接続します。略語:NM =核マグノセルラリス;NL =核ラミナリス;NA =角核;SON =優れたオリバリー核;LF =比較的低周波ニューロン。HF =高周波ニューロン;D =背側;V =腹側;R =吻側;C =尾側。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:電流クランプモードでの体細胞電流注入(-100 pA〜+200 pA、+10 pA刻み、100 ms持続時間)に対するニューロン応答の電気生理学的記録。 ニューロンは、NMの極端な反対領域である同じスライス内の記録のために選択された。(A,B)単一の冠状動脈スライスにおける代表的なニューロン応答は、微妙な違いを伴う相対的な等周波特性を示す。応答特性は、コロナスライス内のNMの最も内側(A)および外側(B)領域から記録された2つの異なるMFニューロンを表す。(C,D)単一の矢状スライスからの代表的なニューロン記録。記録は、比較的LF NM応答(C)とHF NM応答(D)を示しており、単一の矢状断面に沿ったトノトピック勾配の実質的な違いを強調しています。略語:NM =核マグノセルラリス;LF =比較的低周波ニューロン。MF =中周波ニューロン;HF =高周波ニューロン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:脳幹の代表的な水平連続切片。 (A,B)左:背側から腹側軸に沿ったスライス、聴覚核は白い破線の円でマークされています。8番目の 脳神経求心性線維は、矢印でマークされた聴覚核を接続します。中央の挿入物は、耳核領域の拡大図であり、白い破線の下にマークされた聴覚核NMおよびNL領域が示されている。聴覚核の明確なトポロジカル運動は、 A、Bに見ることができます。(A,B)右: a:NMと b:NLを示す大きな衛星図。右の挿入物は、60倍の対物倍率で観察された聴覚核と、尾側外側から吻側内側軸に沿ったLFからHFまでの湾曲したトポロジカル軸を示しています。略語:NM =核マグノセルラリス;NL =核ラミナリス;LF =比較的低周波ニューロン。HF =高周波ニューロン;L =横方向。R =吻側;C =尾側。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:代表的な水平/横の鋭角(45°)シリアルセクション。 (A-C)左:脳幹の連続切片、白い破線の円でマークされた聴覚核。中央の挿入物は、聴覚領域のより大きなビューです。(A)中央の挿入物は、これらのスライスにおけるNMおよびNLニューロンの最大広がりを示す。(B,C)中央の挿入物:白い破線でマークされた聴覚核は、(A-C)と比較すると徐々にトポロジカルな変化を示します。右:聴覚核a:NMとb:NLを60倍の対物倍率で示す衛星挿入物。NMおよびNLのLF領域からHF領域へのトノトピック軸は、外側スライスから内側スライスに向かって角度的に回転します。略語:NM =核マグノセルラリス;NL =核ラミナリス;LF =比較的低周波ニューロン。HF =高周波ニューロン;V =腹側;R =吻側;D =背側;C =尾側。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足ビデオS1:過分極および脱分極体性電流注射。 低周波および高周波ニューロンから電流クランプモードでの100ミリ秒の体細胞電流注入までの応答特性。ニューロンは、同じ矢状脳幹スライスから選択された。注入の範囲は-100〜+200 pAで、+10 pA刻み、時間持続時間は100 msです。活動電位は、十分な脱分極電流ステップに応答して見られる。ビデオは、 図3Cに示す最終的なトレースに対応しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ビデオS2:過分極および脱分極体細胞電流注射。 補足ビデオ S1と同様に、このビデオは、電流クランプモードでの100ミリ秒の体細胞電流注入に対する低周波および高周波ニューロンからの応答特性を示しています。ニューロンは、同じ矢状脳幹スライスから選択された。注入の範囲は-100〜+200 pAで、+10 pA刻み、時間持続時間は100 msです。活動電位は、十分な脱分極電流ステップに応答して見られる。ビデオは、 図3Dに示す最終的なトレースに対応します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。