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Neuroscience

Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

Published: July 12, 2022
doi:
10.3791/63476
, , ,
1Roxelyn and Richard Department of Communication Sciences and Disorders,Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center,Northwestern University, 3Department of Neurobiology,Northwestern University

Summary

Qui presentiamo un protocollo per ottenere fette uditive non coronali del tronco cerebrale dell’embrione di pollo per lo studio delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo all’interno di una fetta del tronco cerebrale. Queste sezioni includono sezioni sagittali, orizzontali e orizzontali/trasversali che comprendono regioni tonotopiche più grandi all’interno di un singolo piano di fette rispetto alle sezioni coronali tradizionali.

Abstract

L’embrione di pollo è un modello animale ampiamente accettato per studiare il tronco cerebrale uditivo, composto da microcircuiti altamente specializzati e topologia neuronale differenzialmente orientata lungo un asse tonotopico (cioè di frequenza). L’asse tonotopico consente la codifica segregata dei suoni ad alta frequenza nel piano rostrale-mediale e la codifica a bassa frequenza nelle regioni caudo-laterali. Tradizionalmente, fette di tessuto embrionale del tronco encefalico coronale permettono lo studio della lamina iso-frequenza individuale relativa. Sebbene sufficiente per indagare questioni anatomiche e fisiologiche relative alle singole regioni a isofrequenza, lo studio della variazione tonotopica e del suo sviluppo in aree uditive più ampie del tronco cerebrale è alquanto limitato. Questo protocollo riporta tecniche di affettamento del tronco cerebrale da embrioni di pollo che comprendono gradienti più ampi di regioni di frequenza nel tronco cerebrale uditivo inferiore. L’utilizzo di diversi metodi di affettamento per il tessuto uditivo del tronco cerebrale del pollo consente esperimenti elettrofisiologici e anatomici all’interno di una fetta del tronco cerebrale, dove gradienti più grandi di proprietà tonotopiche e traiettorie di sviluppo sono meglio conservati rispetto alle sezioni coronali. Le tecniche di taglio multiple consentono una migliore indagine delle diverse proprietà anatomiche, biofisiche e tonotopiche dei microcircuiti uditivi del tronco cerebrale.

Introduction

L’embrione di pollo è un prezioso modello di ricerca per studiare questioni biologiche di base in numerose e diverse aree scientifiche tra cui biologia cellulare, immunologia, patologia e neurobiologia dello sviluppo. Il microcircuito del tronco cerebrale uditivo del pollo è un eccellente esempio di un circuito altamente specializzato che può essere compreso in termini di morfologia e fisiologia uditiva. Ad esempio, Rubel e Parks (1975) hanno descritto per la prima volta l’orientamento tonotopico (cioè il gradiente di frequenza) del nucleo magnocellularis di pollo (NM) e del nucleo laminario (NL) come una funzione lineare attraverso l’asse dei nuclei, orientata ~30° rispetto al piano sagittale. I singoli neuroni in NM e NL codificano la loro migliore frequenza sonora – nota come frequenza caratteristica (CF) – lungo il piano rostrale-mediale fino alla regione caudo-laterale. I neuroni sensibili all’alta frequenza si trovano nella regione rostrale-mediale e i neuroni sensibili alla bassa frequenza si trovano caudo-lateralmente. Pertanto, i metodi tradizionali di dissezione del tessuto uditivo del tronco cerebrale per studiare le proprietà tonotopiche hanno utilizzato fette coronali successive. Infatti, i microcircuiti uditivi di embrioni di pollo in via di sviluppo sono stati stabiliti come sistema modello per studiare l’elaborazione del segnale delle funzioni uditive tonotopiche attraverso successive fette del tronco cerebrale del piano coronale da caudale a rostrale per decenni 1,2,3,4,5,6.

Tuttavia, l’organizzazione tonotopica di NM e NL è topologicamente e morfologicamente contorta. Gli input nervosi uditivi sono distribuiti in modo tale che gli input CF elevati terminano in strutture simili a bulbi terminali che coprono almeno un quarto della circonferenza somatica di una cellula NM adendritica. Al contrario, bassi input CF non sono organizzati con terminali simili a bulbi terminali ma con sinapsi di bouton multiple su dendriti di neuroni NM. Gli ingressi CF medi terminano sia come bulbo terminale che come sinapsi simili a bouton 4,7,8,9,10,11,12. In NL, il gradiente dendritico altamente stereotipato è evidente non solo nella lunghezza dendritica, ma anche nella larghezza dendritica. Questo gradiente dendritico unico si conforma strettamente all’asse tonotopico. I dendriti subiscono un aumento di 11 volte in lunghezza e un aumento di cinque volte in larghezza dai neuroni ad alta a bassa CF, rispettivamente6. Per superare tali distribuzioni contorte di questi nuclei in fette coronali, questo protocollo descrive gli approcci di dissezione nei piani sagittale, orizzontale e orizzontale / trasversale. Queste tecniche di affettamento forniscono esempi di tessuto uditivo del tronco cerebrale che presenta le massime proprietà tonotopiche in un singolo piano di fette.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l’uso degli animali della Northwestern University (IACUC) e sono state eseguite in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. I protocolli per la dissezione e la preparazione del tessuto del tronco encefalico sono in aderenza con i precedenti protocolli 5,13. 1. Manipolazione delle uova Acquista uova fecondate (Gallus gallus domesticus) da un fornitore di animali locale approvato dalla IACUC. Conservare le uova immediatamente dopo l’arrivo in frigorifero a 14 °C e incubare entro 5 giorni.NOTA: La vitalità dell’embrione diminuisce considerevolmente dopo 1 settimana. Sterilizzare le uova con etanolo al 70% prima dell’incubazione a 38 ± 1 °C e ~ 50% di umidità. 2. Composizione e preparazione del liquido cerebro-spinale artificiale (ACSF) Mescolare le seguenti sostanze chimiche in 1 L da 18,2 MΩcm dH 2 O per creare una soluzione madre ACSF 10x: NaCl (cloruro di sodio) 130 mM, NaHCO3 (bicarbonato di sodio) 26 mM, KCl (cloruro di potassio) 2,5 mM, NaH2PO4 (sodio diidrogeno fosfato) 1,25 mM, destrosio (D-(+)-glucosio) 10 mM. Conservare la soluzione madre in frigorifero. Preparare le soluzioni di MgCl 2 (cloruro di magnesio) 1 M e CaCl 2 (cloruro di calcio) 1 M separatamente in 18,2 MΩcm dH2 O e conservare in frigorifero. Immediatamente prima dell’uso, diluire 10x ACSF a 1x e bollire continuamente con 95% O 2/5% CO 2 per 15-20 minuti e aggiungere MgCl 2 e CaCl 2. Per preparare ACSF e dACSF (dissezione ACSF), regolare a una concentrazione finale di Mg 2+ 1 mM, Ca 2+ 3 mM e Mg 2+ 3 mM, Ca 2+ 1 mM, rispettivamente. Impostare la velocità di gorgogliamento per l’ACSF in modo che il pH sia 7,2-7,4 con un’osmolalità compresa tra 300 e 310 mOsm/L.NOTA: Avere l’ACSF posto in un bagno di ghiaccio durante il gorgogliamento è utile per mantenere una bassa temperatura della soluzione, che supporterà l’integrità strutturale del tessuto durante la dissezione. 3. Preparazione del blocco di agarosio (5%) Mescolare 5 g di agarosio in 100 mL di dACSF. Utilizzare un bagnomaria a 100 °C o un forno a microonde per 2-3 minuti, mescolando ogni 30 s per evitare grumi fino a quando l’agarosio si scioglie completamente e inizia a gorgogliare. Versare l’agarosio fuso in una capsula di Petri vuota fino a 5 mm di spessore e conservare a temperatura ambiente per fissare. Dopo la posa, sigillare la capsula di Petri con parafilm e conservare a 4 °C. Tagliare l’agarosio in blocchi cubici con una lama affilata e usarli al momento della dissezione. 4. Protocollo di dissezione e isolamento del tronco cerebrale uditivo Pulire l’area di dissezione con spray per soluzione di alcool etilico al 70%. Incollare il blocco di supporto o agarosio angolato sul vassoio vibratomo. Scegli le uova dell’età desiderata (E20 ed E21 nel presente protocollo). Maneggiare e incubare le uova seguendo i protocolli sopra elencati come al punto 1. Individua lo spazio pieno d’aria posizionando l’uovo sotto una luce intensa (speratura) e cercando questo spazio sul lato più grande o più rotondo dell’uovo. Acclimatare le uova a temperatura ambiente, rompere il guscio sullo spazio pieno d’aria ed esporre il sacco a membrana. Fai una leggera incisione nel sacco per esporre il becco. Con un bisturi, tirare delicatamente il collo e la testa fuori dall’uovo. Decapitare rapidamente la testa usando forbici affilate. Dopo la decapitazione, pulire la testa con dACSF ghiacciato per rimuovere il sangue in eccesso dal tampone di dissezione. Tenere la testa ferma in dACSF ghiacciato e fare un’incisione rostro-caudale. Inizia l’incisione dietro e tra gli occhi e segui la lunghezza del collo raccolto.NOTA: Gli embrioni più giovani possono richiedere meno pressione durante l’incisione. Separare la pelle per esporre il cranio. Taglia il cranio dietro l’occhio in una linea mediana verso la direzione laterale. Fallo per entrambi gli emisferi.NOTA: Questo passaggio aiuta a separare la porzione rostrale del cranio dal cervello attaccato mantenendo intatto il tessuto cerebrale5. Affettare la porzione rostrale del cranio. Posiziona la lama dietro gli occhi e fai un taglio rapido.NOTA: Potrebbe essere necessario uno sforzo per tagliare il cranio attaccato in modo pulito. Immergere la testa in un piatto di dACSF freddo. Utilizzando un piccolo paio di forbici, fare incisioni mediane o laterali nella regione caudale del cranio per cercare di separare il cervello dal cranio senza causare danni ai tessuti. Esporre delicatamente il tronco cerebrale e il cervelletto. Ritrarre l’area dorsale dell’intero cranio, rimuovere con cura il tronco cerebrale ed esporlo con l’aiuto di un pennello fine con slittino delicato. Utilizzare una pinza curva per pulire il tronco cerebrale dal collegamento di tessuti e vasi sanguigni. Prestare particolare attenzione all’8° area del nervo cranico e assicurarsi di lasciare una breve lunghezza di fibre nervose intatte su entrambi i lati. Separare il tronco cerebrale dal cervelletto tagliando i peduncoli e rimuovendo accuratamente i vasi sanguigni. Tagliare il tronco cerebrale di vasi sanguigni aggiuntivi.NOTA: Assicurarsi che l’intera procedura venga eseguita in dACSF refrigerato con ghiaccio continuamente bollato con carbossigeno (95% O 2/5% CO2). 5. Affettatura con vibratomo NOTA: Nei passaggi successivi, la parte posteriore del tessuto deve essere sostenuta con un pezzo cubico di agarosio. Posizionare la lama della vibratoma lungo l’asse orizzontale e incollare il tronco cerebrale su un vassoio di affettatura. Incollare il lato rostrale, mantenendo verticale l’asse rostrale-caudale per le fette coronali.Mantenere l’asse laterale-mediale verticale per le fette sagittali. Incollare il lato ventrale, mantenendo verticale l’asse dorsale-ventrale per le fette orizzontali. Per ottenere il piano angolare acuto sagittale-orizzontale, incollare il lato ventrale del tronco cerebrale, mantenendo l’asse ventrale-dorsale verticale sulla superficie ipotenusa del blocco di agarosio, che viene tagliata con un angolo di 45°. Incollare la superficie opposta del blocco di agarosio rivolto verso il vassoio di affettatura e mantenere l’asse rostrale-caudale parallelo al bordo della lama. 6. Manipolazione di pezzi fragili o grandi di tessuto del tronco encefalico In un approccio alternativo alla fase 5, immergere il tronco cerebrale isolato in agarosio a basso punto di fusione (LMP) al 4% a ~40 °C in una capsula di Petri di 35 mm x 10 mm.Dopo aver versato l’agarosio sul tronco cerebrale immerso, posizionare la capsula di Petri sul ghiaccio per solidificare. Tagliare il blocco cubico di agarosio con tronco cerebrale incorporato usando una lama affilata. Incollare il blocco di agarosio LMP sul suo lato rostrale, mantenendo verticale l’asse rostrale-caudale del tronco cerebrale.Prendi le fette coronali fino a quando la regione NM può essere visualizzata. Rimuovere il blocco di agarosio dalla colla con una lama affilata. Per individuare i nuclei, posizionare delicatamente 0,5 μL di colorante (blu toluidina o arancione G) sulla NM con un ago sottile. Rimontare questo blocco sul vassoio di affettatura per fette sagittali o orizzontali e identificare i nuclei rispetto alla regione macchiata. Per prestazioni ottimali, impostare la velocità di slicing della vibratoma su 4 – 5 (~30 ± 4 mm/min), la frequenza di vibrazione a 85-87 Hz e l’ampiezza di taglio su 4-6 (~1 ± 0,2 mm). Dopo il sezionamento del tronco cerebrale, posizionare le fette raccolte sequenzialmente da 200-300 μm in una camera di fetta disponibile in commercio per equilibrarle per 1 ora a temperatura ambiente in ACSF, continuamente bollate con una miscela di 95% O 2/5% CO 2 (pH 7,2-7,4, osmolarità 300-310 mOsm / L). In queste condizioni, le fette rimangono vitali fino a 5-6 ore. 7. Elettrofisiologia: procedura patch clamp Trasferire una fetta del tronco encefalico nella camera di registrazione con perfusione continua di ACSF carbossigenato ~1,5 ± 0,5 ml/min. Pipette patch a tira con un estrattore di micropipette di diametro della punta 1-2 μm e resistenza nell’intervallo di 3-6 MΩ.Riempire le pipette con una soluzione interna a base di K-gluconato (per la registrazione di pinze a pinza corrente). Per testare le proprietà neuronali attraverso le diverse regioni tonotopiche all’interno di una fetta, individuare i neuroni alle due estremità del piano della fetta e avvicinarsi con l’elettrodo di registrazione. Mantenere una pressione positiva dell’aria sulla punta della pipetta mentre ci si avvicina a un neurone. Spostarsi verso il soma fino a visualizzare una rientranza sul neurone. Eseguire rapidamente i due passaggi successivi. Fare una tenuta gigaohm (1 GΩ) rilasciando la pressione dell’aria positiva. Mantenere l’impostazione dell’amplificatore in modalità tension-clamp e correggere l’offset della pipetta come zero pA. Eseguire un test di tenuta (impulso di prova di 10 mV a 100 Hz). Applicare una pressione dell’aria negativa per rompere una piccola zona della membrana neuronale. Per testare le proprietà intrinseche attive dei neuroni uditivi, applicare iniezioni di corrente somatica iperpolarizzanti e depolarizzanti.NOTA: esempi di questa procedura possono essere visualizzati in Video supplementare S1, S2. I dettagli di questa procedura sono forniti nelle legende video.

Representative Results

Tutte le fette del tronco cerebrale mostrate qui sono state acquisite dal tessuto del tronco encefalico (~ 200-300 μm) e visualizzate utilizzando un’ottica a contrasto di interferenza oggettiva e differenziale (DIC) 5x. La telecamera è stata montata sul microscopio da dissezione e collegata a un computer con software di acquisizione delle immagini (vedi Tabella dei materiali). L’inserto satellitare per queste figure (pannelli di destra) è stato ripreso utilizzando un obiettivo di immersione in acqua con ingrandimento 60x. È stata prestata attenzione per garantire che tutte le aree della fetta del tronco cerebrale fossero ugualmente ingrandite durante l’ottenimento di immagini digitali. Le fotografie sono state scattate con luminosità e messa a fuoco ottimali. Le immagini digitali delle fette del tronco cerebrale sono state cucite in modo planare in base all’area sovrapposta e importate su un computer desktop per ulteriori regolazioni di luminosità, contrasto e scala di grigi. I microcircuiti di base del tronco cerebrale uditivo del pollo sono stati identificati secondo il precedente lavoro 1,2,5,13. Al microscopio (obiettivo 5x), i nuclei uditivi sono stati identificati come l’area adiacente alle fibre nervose fortemente mieliniche che scorrono attorno a ciascun nucleo sia omolateralmente che controlateralmente lungo le regioni dorsali della fetta. La figura 1 mostra le sezioni coronali tradizionali del tessuto del tronco encefalico (200-300 μm) da un embrione di pollo E21. Le quattro sezioni coronali mostrate qui rappresentano le regioni relative a isofrequenza dei nuclei uditivi del tronco encefalico, dalla regione uditiva CF più bassa (Figura 1A, caudo-laterale) che progredisce alla regione uditiva CF più alta (Figura 1D, rostrale-mediale). Per tutte e quattro le fette coronali nella Figura 1A-D, le regioni ingrandite di NM e NL marcate sono mostrate nella colonna centrale e ingrandite (obiettivo 60x) sulla vista destra del pannello della figura (a e b, rispettivamente, nei riquadri satellitari). La freccia nella Figura 1A,B mostra l’input delle fibre nervose uditive e la punta della freccia mostra la biforcazione degli assoni NM a sinistra della fetta. La figura 1C mostra un’altra struttura del nucleo cocleare aviario nota come nucleo angolare (NA, freccia a sinistra e punta di freccia a destra). Le due fette coronali più rostrali mostrano il nucleo olivario superiore (SON) situato lungo la regione ventrale-laterale della fetta coronale (Figura 1C, D, cerchi tratteggiati bianchi). La figura 2 mostra sezioni sagittali di tessuto del tronco encefalico (200-300 μm) da un embrione di pollo E21. Per tutte e tre le fette sagittali (Figura 2A-C), le regioni ingrandite di NM e NL marcate sono mostrate nella colonna centrale e ingrandite (obiettivo 60x) sulla vista destra del pannello della figura (a e b, rispettivamente nelle immagini satellitari). NM e NL sono stati identificati dove le fibre nervose uditive (Figura 2A, freccia centrale) sono entrate nel gruppo di neuroni osservati a ingrandimento più elevato (Figura 2A, cerchi e punte di freccia al centro, piccoli, tratteggiati bianchi) ed evidenziano il punto di partenza della regione uditiva (Figura 2A, sinistra, grande, cerchio tratteggiato bianco e punta di freccia). SON è stato identificato nella regione rostro-laterale della fetta più laterale (Figura 2A, piccolo, bianco, cerchio tratteggiato). La figura 2B mostra regioni tonotopiche estese che contengono regioni uditive CF relativamente basse e alte da NM e NL lungo l’asse rostrale-caudale (regioni delineate in bianco, vedi anche inserto satellitare). La figura 2C mostra i ciuffi assonali omolaterali e controlaterali nella fetta più mediale e il punto finale della regione uditiva (frecce sinistra e centrale). L’orientamento delle fette mostrato qui contrasta con l’orientamento tradizionale delle fette come mostrato nella Figura 1 (cioè coronale). Questo è stato eseguito per visualizzare l’orientamento che meglio si adatta all’approccio di una pipetta di vetro richiesta per le registrazioni elettrofisiologiche. Per confermare che un’ampia regione dell’asse tonotopico era rappresentata nella Figura 2B, sono state eseguite registrazioni elettrofisiologiche a morsetto di corrente da neuroni NM. La Figura 3 mostra somiglianze funzionali e differenze di neuroni NM maturi (E21) registrati da una fetta coronale (Figura 3A,B) e da una fetta sagittale (Figura 3C,D, Video supplementare S1, S2). Due neuroni NM sono stati selezionati dalle estremità mediale e laterale di una fetta coronale (simile alla fetta mostrata in Figura 1B), e due neuroni NM sono stati selezionati dalle estremità rostrale e caudale di NM in una fetta sagittale (come nella fetta mostrata in Figura 2B). La figura 3A,B mostra proprietà di risposta elettrofisiologica simili alle iniezioni di corrente somatica (da -100 pA a +200 pA, incrementi di +10 pA, durata 100 ms). Il modello di attivazione di questi due neuroni NM mostra sottili differenze in questo piano di fette, indicando la lamina relativa a isofrequenza per i neuroni NM a media frequenza. La Figura 3C,D mostra che i modelli di attivazione hanno differenze sostanziali lungo l’asse rostrale-caudale, indicando un gradiente tonotopico relativamente più alto da un neurone NM a bassa frequenza (Figura 3C) a un neurone NM ad alta frequenza (Figura 3D). Entrambi i neuroni si sono presentati con i loro schemi di attivazione stereotipati come precedentemente riportato14,15. La figura 4 mostra sezioni orizzontali di tessuto del tronco encefalico (200-300 μm) di un embrione di pollo E21. Per entrambe le sezioni orizzontali (Figura 4A,B), le regioni ingrandite di NM e NL marcate sono mostrate nella colonna centrale e ingrandite (obiettivo 60x) sulla vista destra del pannello della figura (a e b, rispettivamente, nei riquadri satellitari). Nelle fette orizzontali, NM e NL sono stati identificati verso la linea mediana e i neuroni sono stati distribuiti lungo l’asse laterale-mediale (Figura 4A, B, regioni di contorno tratteggiate al centro, bianche). Le immagini ingrandite mostrano la grande estensione del gradiente tonotopico. I neuroni a bassa frequenza sono nelle regioni caudo-laterali e i neuroni ad alta frequenza sono nelle aree rostrale-mediali (Figura 4A, B, a destra, satelliti). Le fibre che attraversano la linea mediana lungo l’asse rostrale-caudale mostrano le connessioni controlaterali dei nuclei uditivi, ma l’organizzazione di queste fibre non è su un piano semplice. Tuttavia, fette angolari acute da una sezione orizzontale / trasversale possono seguire queste fibre assonali verso il piano sagittale. Sezioni di tessuto del tronco encefalico spesso 200-300 μM con un angolo acuto (45°) da un piano orizzontale sono mostrate nella Figura 5. I nuclei uditivi del tronco encefalico possono essere visti attraverso una grande diffusione diagonale a partire dalla fetta più laterale e termina alla fetta più mediale (Figura 5A-C, pannelli centrali etichettati, area delineata bianca). Inoltre, l’orientamento angolare delle regioni NM e NL può anche essere visualizzato in sezioni asimmetriche successive (Figura 5A-C, pannelli centrali etichettati, area delineata bianca tratteggiata). Le immagini ingrandite (obiettivo 60x) mostrano l’asse tonotopico dei nuclei uditivi mentre scorre lungo l’asse rostrale-mediale a caudo-laterale (Figura 5A-C, a destra, inserto satellite). L’orientamento delle sezioni nella Figura 5 è simile a quello della Figura 2. Contrastano con la presentazione tradizionale delle immagini ma sono più adatti per esperimenti elettrofisiologici. Figura 1: Sezioni seriali coronali rappresentative del tronco encefalico. (A-D) A sinistra: fette dall’asse caudale a quello rostrale, i nuclei uditivi e le fibre di collegamento contrassegnate da un cerchio tratteggiato bianco. L’inserto centrale è una vista più ampia della regione uditiva, dove i nuclei sono mostrati all’interno di cerchi tratteggiati bianchi a: NM e b: NL. Le frecce mostrano le fibre afferenti del nervo uditivo e la punta di freccia mostra la biforcazione dell’assone NM in A,B. La freccia mostra NA in C. Il cerchio tratteggiato bianco laterale mostra SON in C,D. A destra: l’inserto satellitare mostra questi nuclei a 60x obiettivo: a: NM e b: NL. Abbreviazioni: NM = nucleo magnocellularis; NL = nucleo laminaris; NA = nucleo angolare; SON = nucleo olivario superiore; LF = neuroni a frequenza relativamente bassa; MF = neuroni a media frequenza; HF = neuroni ad alta frequenza; D = dorsale; L = laterale; V = ventrale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Sezioni seriali sagittali rappresentative del tronco encefalico. (A-C) A sinistra: fette dall’asse laterale a quello mediale con i nuclei uditivi etichettati in un cerchio tratteggiato bianco. L’inserto centrale mostra la stessa regione dei nuclei uditivi in una vista più grande, contrassegnata all’interno di cerchi tratteggiati bianchi. (A) Il cerchio tratteggiato bianco al centro della fetta evidenzia il SON; freccia che mostra le fibre nervose uditive e punta di freccia che mostra NA. Una macchia nera scura sulla punta destra della fetta è un artefatto di imaging. Le regioni del cervelletto possono essere viste dorsale alla regione uditiva in entrambe le fette A e B nel pannello sinistro. (B) Una fetta sagittale il cui orientamento è stato cambiato sul piano coronale (durante il taglio). La regione uditiva è stata identificata con colorante blu (freccia nera) e di nuovo affettata nel piano sagittale. (A-C) Inserire la regione centrale NM e NL contrassegnata da linee bianche tratteggiate. A destra: la vista satellitare mostra a: NM e b: NL osservati con un ingrandimento dell’obiettivo 60x. Il gradiente tonotopico LF e HF nei nuclei uditivi è mostrato lungo l’asse rostro-caudale. Le frecce che puntano verso l’area scura in (C) mostrano fibre NM fortemente mieliniche che attraversano la linea mediana attraverso l’asse mediale. Le fibre collegano entrambi i lati dei nuclei uditivi. Abbreviazioni: NM = nucleo magnocellularis; NL = nucleo laminaris; NA = nucleo angolare; SON = nucleo olivario superiore; LF = neuroni a frequenza relativamente bassa; HF = neuroni ad alta frequenza; D = dorsale; V = ventrale; R = rostrale; C = caudale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Registrazioni elettrofisiologiche della risposta neuronale alle iniezioni di corrente somatica (da -100 pA a +200 pA, incrementi di +10 pA, durata 100 ms) in modalità morsetto. I neuroni sono stati selezionati per le registrazioni nella stessa fetta ma in regioni estremamente opposte della NM. (A,B) Risposte neuronali rappresentative in una singola fetta coronale che indicano proprietà relative di isofrequenza con sottili differenze. Le proprietà di risposta rappresentano due diversi neuroni MF registrati dalle regioni più mediale (A) e laterale (B) della NM in una fetta coronale. (C,D) Registrazioni neuronali rappresentative da una singola fetta sagittale. Le registrazioni mostrano una risposta NM relativamente LF (C) e una risposta NM HF (D), evidenziando le differenze sostanziali nel gradiente tonotopico all’interno di una singola sezione sagittale. Abbreviazioni: NM = nucleo magnocellularis; LF = neuroni a frequenza relativamente bassa; MF = neuroni a media frequenza; HF = neuroni ad alta frequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Sezioni seriali orizzontali rappresentative del tronco encefalico. (A,B) A sinistra: fette lungo l’asse dorsale-ventrale, i nuclei uditivi sono contrassegnati da cerchi tratteggiati bianchi. Le fibre afferenti del nervo cranico 8collegano i nuclei uditivi contrassegnati con la freccia. L’inserto centrale è una vista più ampia della regione dei nuclei uditivi con nuclei uditivi contrassegnati da linee tratteggiate bianche sono mostrate le regioni NM e NL. Un chiaro movimento topologico dei nuclei uditivi può essere visto in A,B. (A,B) A destra: ampia vista satellitare che mostra a: NM e b: NL. L’inserto destro mostra i nuclei uditivi osservati con un ingrandimento obiettivo 60x e l’asse topologico curvo da LF a HF lungo un asse caudo-laterale a rostrale-mediale. Abbreviazioni: NM = nucleo magnocellularis; NL = nucleo laminaris; LF = neuroni a frequenza relativamente bassa; HF = neuroni ad alta frequenza; L = laterale; R = rostrale; C = caudale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Sezioni seriali angolari acute orizzontali/trasversali rappresentative (45°). (A-C) A sinistra: sezioni seriali del tronco encefalico, nuclei uditivi contrassegnati in cerchio tratteggiato bianco. L’inserto centrale è una vista più ampia della regione uditiva. (A) L’inserto centrale mostra la più grande diffusione di neuroni NM e NL in queste fette. (B,C) Inserto centrale: i nuclei uditivi contrassegnati da linee tratteggiate bianche mostrano un graduale cambiamento topologico rispetto a (A-C). A destra: inserto satellitare che mostra i nuclei uditivi a: NM e b: NL con ingrandimento obiettivo 60x. L’asse tonotopico dalle regioni LF a HF in NM e NL ruota angolarmente da fette laterali a fette mediali. Abbreviazioni: NM = nucleo magnocellularis; NL = nucleo laminaris; LF = neuroni a frequenza relativamente bassa; HF = neuroni ad alta frequenza; V = ventrale; R = rostrale; D = dorsale; C = caudale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Video supplementare S1: Iniezioni di corrente somatica iperpolarizzanti e depolarizzanti. Proprietà di risposta da un neurone a bassa frequenza e alta frequenza a iniezioni di corrente somatica di 100 ms in modalità morsetto corrente. I neuroni sono stati selezionati dalla stessa fetta sagittale del tronco cerebrale. Le iniezioni vanno da -100 a +200 pA in incrementi di +10 pA, durata di 100 ms. I potenziali d’azione sono visti in risposta a sufficienti passi correnti depolarizzanti. Il video corrisponde alle tracce finali mostrate nella Figura 3C. Clicca qui per scaricare questo file. Video supplementare S2: Iniezioni di corrente somatica iperpolarizzanti e depolarizzanti. Simile al video supplementare S1, questo video mostra le proprietà di risposta da un neurone a bassa frequenza e alta frequenza a iniezioni di corrente somatica di 100 ms in modalità morsetto corrente. I neuroni sono stati selezionati dalla stessa fetta sagittale del tronco cerebrale. Le iniezioni vanno da -100 a +200 pA in incrementi di +10 pA, durata di 100 ms. I potenziali d’azione sono visti in risposta a sufficienti passi correnti depolarizzanti. Il video corrisponde alle tracce finali mostrate in Figura 3D. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Le sezioni coronali del tessuto embrionale del tronco encefalico di pollo hanno permesso lo studio della lamina iso-frequenza individuale relativa per decenni 1,2,5. Tuttavia, l’organizzazione tonotopica (cioè la frequenza) del tronco cerebrale uditivo del pollo è topologicamente contorta e può essere più accessibile in altri assi anatomici a seconda della specifica domanda di ricerca. Sebbene sufficienti per indagare questioni anatomiche e fisiologiche relative alle singole regioni a isofrequenza, lo studio delle variazioni tonotopiche e il suo sviluppo in aree uditive più ampie del tronco cerebrale sono in qualche modo limitati dalle sezioni coronali. Per superare questa limitazione, questo protocollo descrive gli approcci nei piani sagittale, orizzontale e orizzontale / trasversale per fornire ulteriori esempi di tessuto uditivo del tronco cerebrale che mostra le massime proprietà tonotopiche e gradienti in una singola sezione del tronco cerebrale.

Le sezioni sagittali delle regioni uditive del tronco encefalico mostrano che diverse aree tonotopiche sono distribuite su una regione più ampia all’interno della fetta rispetto alle sezioni coronali (area uditiva sagittale = ~ 300-600 μm, area uditiva coronale = ~ 200-350 μm). Ad esempio, le regioni NM e NL sono state visualizzate su un’area più ampia lungo l’asse rostro-caudale in sezioni sagittali (ad esempio, Figura 2B), e il gradiente tonotopico funzionale che corre lungo questo asse anatomico era in gran parte contenuto all’interno di una singola fetta sagittale. Ciò è stato ulteriormente confermato con registrazioni di corrente di differenze neuronali intrinseche che variano lungo il gradiente rostrale-caudale come precedentemente riportato14,15 (ad esempio , Figura 3C, D). Esperimenti futuri che evidenziano le proprietà anatomiche e immunoistochimiche lungo l’asse tonotopico potrebbero indagare ulteriormente i gradienti noti delle proprietà uditive all’interno di un singolo piano di fette sagittali. Questi includono, ma non sono limitati a, la colorazione MAP2 e i modelli di espressione dei canali del potassio, che sono noti gradienti di architettura dendritica e proprietà intrinseche di NM e NL che sono stati precedentemente mostrati nelle successive sezioni coronali16.

Le sezioni orizzontali delle regioni uditive del tronco encefalico mostrano che la NM e la NL si trovano verso la linea mediana. Una porzione di fibre assonali uditive corre diagonalmente o perpendicolarmente al piano orizzontale (Figura 4). Queste fibre possono essere seguite facendo una fetta angolare acuta di 45° rispetto al piano sagittale. Le fette orizzontali/trasversali risultanti erano più grandi delle fette sagittali o orizzontali e lunghe fibre assonali attraversavano l’asse rostro-caudale sia per i lati omolaterali che controlaterali. Sia NM che NL possono essere visualizzati in una regione diagonale più ampia (~400-700 μm) in modo tale che le connessioni controlaterali possano essere visualizzate lungo un asse laterale-mediale. Inoltre, il piano della fetta orizzontale/trasversale mostra anche come le regioni uditive e il gradiente tonotopico risultante fanno una svolta angolare (Figura 5). L’esposizione angolare di connessioni controlaterali in un’area più ampia rende queste fette più adatte per la stimolazione elettrofisiologica e gli studi di microcircuiti rispetto alle tradizionali fette coronali.

Ulteriori vantaggi
La formazione di microcircuiti uditivi richiede il coordinamento spaziotemporale di segnali che promuovono la sopravvivenza neuronale, la sinaptogenesi, la differenziazione assonale, l’architettura dendritica e la maturazione. Pertanto, una sezione alternativa del tronco cerebrale del microcircuito uditivo dell’embrione di pollo può essere utilizzata per i seguenti argomenti di ricerca: organizzazione morfologica dei neuroni in dimensioni topograficamente diverse; organizzare e mappare i connettomi di tutti i nuclei uditivi e vestibolari; identificazione e caratterizzazione dei pattern di attività dei costituenti circuitali nei piani iso-frequenza e tonotopici; l’organizzazione topografica dei microcircuiti eccitatori rispetto a quelli inibitori e le relazioni con popolazioni neuronali specializzate (nuclei); localizzazione spaziale dei nuclei uditivi neuroni e sua CF17 predittiva; targeting sistematico di specifici tipi neuronali tonotopici; tracciare le cellule progenitrici e il loro sviluppo in nuclei conservati; lignaggio genetico delle cellule all’evoluzione dei circuiti neuronali18; anatomia comparata del tronco encefalico tra le specie; indagine di circuiti vestibolari come il complesso vestibolare di Deiter (DC)19; e sincronia e diafonia tra nuclei vestibolari.

Un approccio sfaccettato che utilizza diversi piani di fette può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulle proprietà anatomiche e biofisiche sconosciute dei microcircuiti del tronco cerebrale. Un buon esempio è la relazione tra i principali nuclei uditivi (NM, NA, NL e SON) e i nuclei vestibolari, incluso il nucleo dorsale del lemnisco laterale (LLDp), il nucleo semilunare (SLu)20 e il nucleo tangenziale (TN)3. Tuttavia, questo protocollo e questi studi basati su fette hanno alcune limitazioni.

Precauzioni e limitazioni
A seconda dell’istituzione che esegue gli esperimenti, le linee guida etiche e la gestione degli embrioni di pollo possono differire. Mentre le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso degli animali da laboratorio consentono una rapida decapitazione, esistono metodi alternativi per l’eutanasia degli embrioni di pollo21. Il tessuto del tronco cerebrale dell’embrione di pollo a sviluppo precoce è morbido e delicato rispetto agli embrioni più vecchi. Ha diverse connessioni e vasi sanguigni sulla superficie che richiedono ulteriore cautela quando li rimuovono. Il tessuto deve essere conservato in dACSF ghiacciato e perfuso con il 95% di O 2/5% di CO2 per aumentare la vitalità.

Il metodo di affettamento sagittale è utile solo per la tonotopia omolaterale. Questo metodo di affettatura fornisce fette più grandi rispetto alle fette coronali, la cui gestione potrebbe essere precaria. Tuttavia, si possono tagliare le fette usando metodi ad ago incrociato descritti in dettaglio altrove22. L’utilizzo del 4% di tronco cerebrale incorporato nel blocco di agarosio LMP può salvare strutture delicate a fette, ma bisogna fare attenzione a non versare agarosio eccessivamente caldo. Impostarlo rapidamente posizionando il tronco cerebrale bloccato dall’agarosio in un ambiente refrigerato per ~ 1 minuto rende le fette più praticabili per le registrazioni elettrofisiologiche.

L’applicazione di supercolla in quantità eccessive può essere tossica. Deve essere applicato in minima parte e le quantità in eccesso devono essere lavate immediatamente sostituendo il dACSF. Per fette angolari acute (45°), tagliare l’angolo del blocco di agarosio è fondamentale; Si può usare uno specchio per vedere l’angolo anteriore mentre si taglia il blocco di agarosio con una lama affilata. Le lame disponibili in commercio potrebbero avere un rivestimento in cera che dovrebbe essere rimosso con alcool e asciugato prima dell’uso. L’ottimizzazione è necessaria per la velocità e la frequenza di taglio del vibratomo poiché i ciuffi di fibre assonali sono più duri del tessuto corticale o della matrice. Mantenere un’ampiezza elevata e utilizzare una soluzione di dissezione refrigerata può prevenire danni ai tessuti.

Tutte le soluzioni devono essere preparate fresche e Ca 2+ e Mg2+ devono essere aggiunti all’ACSF dopo aver gorgogliato il 95% di O 2/5% di CO2 . In caso contrario, potrebbero esserci precipitazioni di Ca2+. Un pennello dovrebbe essere usato per maneggiare delicatamente le fette all’interno del vibratomo. Mantenere il tempo totale di suddivisione inferiore a 15 minuti, se possibile. Una pipetta Pasteur di vetro può essere utilizzata per manovrare le fette del tronco cerebrale.

Non utilizzare detergenti o detergenti corrosivi per vetreria e attrezzature che entrano in contatto con le fette utilizzate in elettrofisiologia. Le immagini scattate rappresentano l’aspetto di tessuto spesso 200-300 μM in ottica DIC (Differential Interference Contrast). La qualità visiva sarà più scarsa dell’immunoistochimica o della microscopia elettronica, ma riflette accuratamente ciò che uno sperimentatore vedrà quando esegue registrazioni elettrofisiologiche.

Gli studi relativi allo sviluppo precoce di microcircuiti lungo un asse anatomico alternativo, siano essi dorso-ventrale, rostrale-caudale o omolaterale-controlaterale, sono limitati nel tronco cerebrale uditivo del pollo. Una ragione di ciò è che il ruolo dei codici trascrizionali e la regolazione dello sviluppo tonotopico nel tronco cerebrale non sono ancora completamente compresi. Fenomeni funzionali come la modulazione top-down e l’attività spontanea vengono spesso persi osservando l’attività in vitro. Tuttavia, la ricerca in vivo è completata da registrazioni specifiche e dirette di singoli neuroni possibili solo in queste condizioni di fetta. Il perfezionamento dell’ottenimento del tessuto del tronco cerebrale lungo diversi orientamenti potrebbe fornire informazioni approfondite sullo sviluppo e la complessità dei gradienti tonotopici nel microcircuito uditivo del tronco cerebrale del pollo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è sostenuto dalla sovvenzione NIH/NIDCD R01 DC017167. Ringraziamo Kristine McLellan per aver fornito commenti editoriali su una versione precedente del manoscritto.

Materials

Adobe photoshop 2021 Adobe
Anti-vibration table 30"x 36" – OTMC – 63533 TMC
Cell sens standard software OLYMPUS
Digidata 1440A MOLECULAR DEVICES
Digital amplifier  multiclamp 700B MOLECULAR DEVICES
DSK line-up linearslicer pro7 TED PELLA, INC
Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 OLYMPUS AMERICA INC
Micropipette puller P-97 SUTTER INSTRUMENTS
Microscope BX51W1 OLYMPUS AMERICA INC
MS ICE software Microsoft Corporation
Ohaus balance model AV212 Ohaus Adventurer
Olympus DPSI0 /DPS80 camera OLYMPUS
pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares MOLECULAR DEVICES
pH meter lab 850 benchtop SCHOTT INSTRUMENTS
Sharp stainless blade Dorco/Personna
Vapor pressure osmometer model 5600 WESCOR INC
Water purification systems Smart2pure 6UV/UF Thermo Scientific
Chemicals- list
Agrose Low melt IB70051 IBI SCIENTIFIC
CaCl2 (Calcium Chloride) ACROS organics
Cynergy instant adhesive CA6001 Resinlab
Dextrose (D-(+)-glucose) VWR Life Science
Ethyl alcohol IBI SCIENTIFIC
KCl (Potassium Chloride) Amresco.Inc
MgCl2 (Magnesium Chloride) Sigma-Aldrich
NaCl (Sodium Chloride) Amresco.Inc
NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) Amresco.Inc
NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) Amresco.Inc
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Mohan, S., Roy, A., Ordiway, G., Sanchez, J. T. Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits. J. Vis. Exp. (185), e63476, doi:10.3791/63476 (2022).
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