تقطيع جذع دماغ الدجاج السمعي الجنيني لتقييم التدرجات التونية والدوائر الدقيقة
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للحصول على شرائح جذع الدماغ السمعية غير الإكليلية من جنين الدجاج للتحقيق في خصائص التوتر ومسارات النمو داخل شريحة جذع دماغ واحدة. وتشمل هذه الشرائح أقساما سهمية وأفقية وأفقية/عرضية تشمل مناطق تونوبية أكبر داخل مستوى شريحة فردي مقارنة بالمقاطع الإكليلية التقليدية.
Abstract
جنين الدجاج هو نموذج حيواني مقبول على نطاق واسع لدراسة جذع الدماغ السمعي ، ويتكون من الدوائر الدقيقة عالية التخصص والطوبولوجيا العصبية الموجهة بشكل مختلف على طول محور تونوتوبيا (أي تردد). يسمح المحور التونوتوبي بالترميز المنفصل للأصوات عالية التردد في المستوى الإنسي السطحي والترميز منخفض التردد في المناطق الجانبية المذنبة. تقليديا ، تسمح شرائح جذع الدماغ الإكليلي من الأنسجة الجنينية بدراسة الصفيحة الفردية ذات التردد المتساوي النسبية. على الرغم من أنها كافية للتحقيق في الأسئلة التشريحية والفسيولوجية المتعلقة بمناطق التردد المتساوي الفردية ، إلا أن دراسة التباين التونوتوبي وتطوره عبر مناطق جذع الدماغ السمعية الأكبر محدودة إلى حد ما. يبلغ هذا البروتوكول عن تقنيات تقطيع جذع الدماغ من أجنة الدجاج التي تشمل تدرجات أكبر من مناطق التردد في جذع الدماغ السمعي السفلي. يسمح استخدام طرق التقطيع المختلفة لأنسجة جذع الدماغ السمعية للدجاج بإجراء تجارب كهروفسيولوجية وتشريحية داخل شريحة جذع دماغ واحدة ، حيث يتم الحفاظ على تدرجات أكبر من الخصائص التونومية والمسارات التنموية بشكل أفضل من الأقسام الإكليلية. تسمح تقنيات التقطيع المتعددة بتحسين التحقيق في الخصائص التشريحية والفيزيائية الحيوية والطحنية المتنوعة للدوائر الدقيقة السمعية لجذع الدماغ السمعي.
Introduction
جنين الدجاج هو نموذج بحثي قيم لدراسة الأسئلة البيولوجية الأساسية في العديد من المجالات العلمية المتنوعة بما في ذلك بيولوجيا الخلية وعلم المناعة وعلم الأمراض والبيولوجيا العصبية التنموية. تعد الدوائر الدقيقة لجذع الدماغ السمعي للدجاج مثالا ممتازا على دائرة عالية التخصص يمكن فهمها من حيث التشكل السمعي وعلم وظائف الأعضاء. على سبيل المثال ، وصف Rubel and Parks (1975) لأول مرة الاتجاه التونوتوبي (أي تدرج التردد) لنواة الدجاج magnocellularis (NM) والنواة الصفيحية (NL) كدالة خطية عبر محور النوى ، موجهة ~ 30 درجة فيما يتعلق بالمستوى السهمي. تقوم الخلايا العصبية الفردية في NM و NL بتشفير أفضل تردد صوتي لها – يعرف باسم ترددها المميز (CF) – على طول المستوى الإنسي السطحي إلى المنطقة الجانبية. توجد الخلايا العصبية عالية الحساسية للتردد في المنطقة الإنسية على السطح وتوجد الخلايا العصبية منخفضة التردد الحساسة بشكل جانبي. على هذا النحو ، استخدمت طرق التشريح التقليدية لأنسجة جذع الدماغ السمعية لدراسة الخصائص التونومية شرائح إكليلية متتالية. في الواقع ، تم إنشاء الدوائر السمعية الدقيقة لأجنة الدجاج النامية كنظام نموذجي لدراسة معالجة الإشارات للوظائف السمعية التونوتوبية من خلال شرائح جذع الدماغ المتتالية من المستوى الإكليلي إلى السطح لعقود1،2،3،4،5،6.
ومع ذلك ، فإن التنظيم التونوتوبي ل NM و NL معقد طوبولوجيا ومورفولوجيا. يتم توزيع مدخلات الأعصاب السمعية بحيث تنتهي مدخلات CF العالية في هياكل تشبه المصباح النهائي تغطي ما لا يقل عن ربع المحيط الجسدي لخلية NM الإضافية. على العكس من ذلك ، لا يتم تنظيم مدخلات CF المنخفضة مع محطات طرفية تشبه المصباح النهائي ولكن مع نقاط اشتباك عصبي متعددة على التشعبات من الخلايا العصبية NM. تنتهي مدخلات CF الوسطى كلمبة نهاية ونقاط اشتباك عصبي تشبه البوتون 4,7,8,9,10,11,12. في NL ، يتضح التدرج التغصني النمطي للغاية ليس فقط في الطول المتغصن ولكن أيضا في العرض الشجيري. يتوافق هذا التدرج التغصني الفريد بشكل وثيق مع المحور التونومي. تخضع التشعبات لزيادة طولها بمقدار 11 ضعفا وزيادة عرضها بمقدار خمسة أضعاف من الخلايا العصبية عالية إلى منخفضة CF ، على التوالي6. للتغلب على مثل هذه التوزيعات المعقدة لهذه النوى في شرائح إكليلية ، يصف هذا البروتوكول نهج التشريح في المستويات السهمية والأفقية والأفقية / المستعرضة. توفر تقنيات التقطيع هذه أمثلة على أنسجة جذع الدماغ السمعية التي تظهر أقصى خصائص التوتر في مستوى شريحة فردي.
Protocol
Representative Results
Discussion
سمحت الأقسام الإكليلية من أنسجة جذع الدماغ الجنينية الدجاج بدراسة الصفيحة الفردية ذات التردد المتساوي لعقود1،2،5. ومع ذلك ، فإن تنظيم tonotopic (أي التردد) لجذع الدماغ السمعي الدجاج معقد طوبولوجيا وقد يكون أكثر سهولة في المحاور التشريحية الأخرى اعتمادا على سؤال البحث المحدد. على الرغم من أنها كافية للتحقيق في الأسئلة التشريحية والفسيولوجية المتعلقة بمناطق التردد المتساووي الفردية ، إلا أن دراسة الاختلافات التونومية وتطورها عبر مناطق جذع الدماغ السمعية الأكبر محدودة إلى حد ما بالأقسام الإكليلية. للتغلب على هذا القيد ، يصف هذا البروتوكول النهج في المستويات السهمية والأفقية والأفقية / العرضية لتقديم أمثلة إضافية على أنسجة جذع الدماغ السمعية التي تظهر أقصى خصائص التوتر والتدرجات في قسم جذع الدماغ الفردي.
تظهر أقسام القوس في مناطق جذع الدماغ السمعية أن مناطق التوتر المختلفة موزعة عبر منطقة أكبر داخل الشريحة مقارنة بالأقسام الإكليلية (المنطقة السمعية السهمية = ~ 300-600 ميكرومتر ، المنطقة السمعية الإكليلية = ~ 200-350 ميكرومتر). على سبيل المثال ، تم تصور مناطق NM و NL على مساحة أكبر على طول المحور الوردي الذيلي في أقسام سهمية (على سبيل المثال ، الشكل 2B) ، وتم احتواء التدرج الوظيفي التونوتوبي الذي يمتد على طول هذا المحور التشريحي إلى حد كبير داخل شريحة سهمية واحدة. وقد تأكد ذلك أيضا من خلال تسجيلات المشبك الحالي للاختلافات العصبية الجوهرية التي تختلف على طول التدرج الذيلي للسطح كما تم الإبلاغ عنه سابقا14,15 (على سبيل المثال ، الشكل 3C ، D). يمكن للتجارب المستقبلية التي تسلط الضوء على الخصائص التشريحية والكيميائية النسيجية المناعية على طول المحور التونوتوبي أن تحقق بشكل أكبر في التدرجات المعروفة للخصائص السمعية داخل مستوى شريحة سهمية واحدة. وتشمل هذه ، على سبيل المثال لا الحصر ، أنماط التعبير عن قناة MAP2 وقناة البوتاسيوم ، والتي هي تدرجات معروفة للهندسة التغصنية والخصائص الجوهرية ل NM و NL التي تم عرضها سابقا في الأقسام الإكليليةالمتعاقبة 16.
تظهر الأقسام الأفقية لمناطق جذع الدماغ السمعية أن NM و NL يقعان باتجاه خط الوسط. يعمل جزء من الألياف المحورية السمعية قطريا أو عموديا على المستوى الأفقي (الشكل 4). يمكن أن تتبع هذه الألياف عن طريق صنع شريحة زاوية حادة 45 درجة إلى المستوى السهمي. كانت الشرائح الأفقية / المستعرضة الناتجة أكبر من الشرائح السهمية أو الأفقية ، وكانت الألياف المحورية الطويلة تمر عبر المحور الوردي الذيلي لكل من الجانبين الجانبي والمعاكس. يمكن تصور كل من NM و NL في منطقة قطرية أكبر (~ 400-700 ميكرومتر) بحيث يمكن تصور الاتصالات المعاكسة على طول محور جانبي إنسي. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح مستوى الشريحة الأفقي / العرضي أيضا كيف أن المناطق السمعية والتدرج التونوتوبي الناتج يصنعان منعطفا زاويا (الشكل 5). إن التعرض الزاوي للوصلات المتعارضة في مساحة أكبر يجعل هذه الشرائح أكثر ملاءمة للتحفيز الكهروفسيولوجي ودراسات الدوائر الدقيقة من الشرائح الإكليلية التقليدية.
مزايا إضافية
يتطلب تكوين الدوائر الدقيقة السمعية تنسيقا زمنيا مكانيا للإشارات التي تعزز بقاء الخلايا العصبية ، وتكوين التشابك العصبي ، والتمايز المحوري ، والعمارة الشجيرية ، والنضج. وبالتالي ، يمكن استخدام أقسام جذع دماغ بديلة من الدائرة السمعية الدقيقة لجنين الدجاج لمواضيع البحث التالية: التنظيم المورفولوجي للخلايا العصبية في أبعاد مختلفة طبوغرافيا. تنظيم ورسم خرائط الشبكات العصبية لجميع النوى السمعية والدهليزية ؛ تحديد وتوصيف أنماط نشاط مكونات الدائرة في مستويات التردد المتساوي والتونوبوتي؛ التنظيم الطبوغرافي للدوائر الدقيقة المثيرة مقابل المثبطة والعلاقات مع مجموعات الخلايا العصبية المتخصصة (النوى) ؛ الموقع المكاني للخلايا العصبية النووية السمعية و CF17 التنبؤي ؛ الاستهداف المنهجي لأنواع محددة من الخلايا العصبية التونوتوبية ؛ تتبع الخلايا السلفية وتطورها إلى نوى محفوظة ؛ النسب الوراثي للخلايا إلى تطور الدوائر العصبية18 ؛ تشريح جذع الدماغ المقارن بين الأنواع ؛ التحقيق في الدوائر الدهليزية مثل مجمع ديتر الدهليزي (DC)19 ؛ والتزامن والحديث المتبادل بين النوى الدهليزية.
قد يساعد النهج متعدد الأوجه باستخدام مستويات شرائح مختلفة في الإجابة على الأسئلة الأساسية حول الخصائص التشريحية والفيزيائية الحيوية غير المعروفة للدوائر الدقيقة لجذع الدماغ. ومن الأمثلة الجيدة على ذلك العلاقة بين النوى السمعية الرئيسية (NM ، NA ، NL ، و SON) والنوى الدهليزية ، بما في ذلك النواة الظهرية لل lemniscus الجانبية (LLDp) ، والنواة شبه القمرية (SLu)20 ، والنواة العرضية (TN)3. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول وهذه الدراسات القائمة على الشرائح لها بعض القيود.
الاحتياطات والقيود
اعتمادا على المؤسسة التي تجري التجارب ، قد تختلف المبادئ التوجيهية الأخلاقية والتعامل مع أجنة الدجاج. في حين أن المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر تسمح بقطع الرأس السريع ، هناك طرق بديلة للقتل الرحيم لجنين الدجاج21. أنسجة جذع دماغ جنين الدجاج النامية في وقت مبكر ناعمة وحساسة مقارنة بالأجنة الأكبر سنا. لديها العديد من الاتصالات والأوعية الدموية على السطح التي تحتاج إلى مزيد من الحذر عند إزالتها. يجب الاحتفاظ بالأنسجة في dACSF البارد ودمجها مع 95٪ O 2/5٪ CO2 لزيادة قابلية البقاء.
طريقة التقطيع السهمي مفيدة فقط للتونوتوبي الجانبي. توفر طريقة التقطيع هذه شرائح أكبر من الشرائح الإكليلية ، والتي قد يكون التعامل معها محفوفا بالمخاطر. ومع ذلك ، يمكن للمرء تقليم الشرائح باستخدام طرق الإبرة المتقاطعة الموضحة بالتفصيل في مكان آخر22. يمكن أن يؤدي استخدام 4٪ من كتلة الأغاروز LMP المدمجة في جذع الدماغ إلى إنقاذ الهياكل الحساسة في الشرائح ، ولكن يجب توخي الحذر لعدم صب الأغاروز الساخن بشكل مفرط. إن ضبطه بسرعة عن طريق وضع جذع الدماغ المسدود بالأغاروز في بيئة مبردة لمدة 1 دقيقة تقريبا يجعل الشرائح أكثر قابلية للتطبيق للتسجيلات الكهروفسيولوجية.
تطبيق الغراء الفائق بكميات زائدة يمكن أن يكون ساما. يجب تطبيقه بالحد الأدنى ، ويجب غسل الكميات الفائضة على الفور عن طريق تغيير dACSF. بالنسبة للشرائح الزاوية الحادة (45 درجة) ، يعد قطع زاوية كتلة الأغاروز أمرا بالغ الأهمية ؛ يمكن للمرء استخدام مرآة لرؤية الزاوية الأمامية أثناء قطع كتلة الأغاروز بشفرة حادة. قد تحتوي الشفرات المتاحة تجاريا على طبقة شمعية يجب مسحها بالكحول وتجفيفها قبل الاستخدام. مطلوب التحسين لسرعة القطع الاهتزازي وتردده لأن خصلات الألياف المحورية أصعب من الأنسجة القشرية أو المصفوفة. الحفاظ على سعة عالية واستخدام محلول تشريح مبرد قد يمنع تلف الأنسجة.
يجب تحضير جميع المحاليل طازجة ، ويجب إضافة Ca2 + و Mg2+ إلى ACSF بعد فقاعات 95٪ O 2/5٪ CO2 . خلاف ذلك ، قد يكون هناك هطول الأمطار من Ca2 +. يجب استخدام فرشاة الطلاء للتعامل مع الشرائح بلطف داخل الاهتزاز. حافظ على إجمالي وقت التقطيع أقل من 15 دقيقة إن أمكن. يمكن استخدام ماصة باستور الزجاجية للمناورة بشرائح جذع الدماغ.
لا تستخدم عوامل الغسيل المنظفة أو المسببة للتآكل للأواني الزجاجية والمعدات التي تلامس الشرائح المستخدمة في الفيزيولوجيا الكهربية. تمثل الصور الملتقطة مظهر أنسجة سميكة 200-300 ميكرومتر تحت بصريات تباين التداخل التفاضلي (DIC). ستكون الجودة البصرية أسوأ من الكيمياء النسيجية المناعية أو المجهر الإلكتروني ، ولكنها تعكس بدقة ما سيراه المجرب عند إجراء التسجيلات الكهروفسيولوجية.
الدراسات المتعلقة بالتطور المبكر للدوائر الدقيقة على طول محور تشريحي بديل ، سواء كانت ظهرية بطنية ، أو ذيلية ، أو متناقضة ، محدودة في جذع الدماغ السمعي الدجاج. أحد أسباب ذلك هو أن دور الرموز النسخية وتنظيم التطور التونوتوبي في جذع الدماغ لا يزال غير مفهوم تماما. غالبا ما تضيع الظواهر الوظيفية مثل التشكيل من أعلى إلى أسفل والنشاط التلقائي عند مراقبة النشاط في المختبر. ومع ذلك ، يتم استكمال البحث في الجسم الحي بتسجيلات عصبية واحدة محددة ومباشرة ممكنة فقط في ظروف الشريحة هذه. يمكن أن يوفر صقل الحصول على أنسجة جذع الدماغ على طول اتجاهات مختلفة معلومات ثاقبة حول تطور وتعقيد التدرجات التونوتوبية في الدوائر الدقيقة لجذع الدماغ السمعي للدجاج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDCD R01 DC017167. نشكر كريستين ماكليلان على تقديم تعليقات تحريرية على نسخة سابقة من المخطوطة.
Materials
| Adobe photoshop 2021 | Adobe | ||
| Anti-vibration table 30"x 36" – OTMC – 63533 | TMC | ||
| Cell sens standard software | OLYMPUS | ||
| Digidata 1440A | MOLECULAR DEVICES | ||
| Digital amplifier multiclamp 700B | MOLECULAR DEVICES | ||
| DSK line-up linearslicer pro7 | TED PELLA, INC | ||
| Micromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| Micropipette puller P-97 | SUTTER INSTRUMENTS | ||
| Microscope BX51W1 | OLYMPUS AMERICA INC | ||
| MS ICE software | Microsoft Corporation | ||
| Ohaus balance model AV212 | Ohaus Adventurer | ||
| Olympus DPSI0 /DPS80 camera | OLYMPUS | ||
| pClamp and Axoclamp data Acquisition Softwares | MOLECULAR DEVICES | ||
| pH meter lab 850 benchtop | SCHOTT INSTRUMENTS | ||
| Sharp stainless blade | Dorco/Personna | ||
| Vapor pressure osmometer model 5600 | WESCOR INC | ||
| Water purification systems Smart2pure 6UV/UF | Thermo Scientific | ||
| Chemicals- list | |||
| Agrose Low melt IB70051 | IBI SCIENTIFIC | ||
| CaCl2 (Calcium Chloride) | ACROS organics | ||
| Cynergy instant adhesive CA6001 | Resinlab | ||
| Dextrose (D-(+)-glucose) | VWR Life Science | ||
| Ethyl alcohol | IBI SCIENTIFIC | ||
| KCl (Potassium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma-Aldrich | ||
| NaCl (Sodium Chloride) | Amresco.Inc | ||
| NaH2PO4 (Sodium Dihydrogen Phosphate) | Amresco.Inc | ||
| NaHCO3 (Sodium Bicarbonate) | Amresco.Inc |
References
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., et al. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).
- Shao, M., et al. Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period. Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).
- Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).
- Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. Journal of Visualized Experiments. (49), e2527 (2011).
- Sanchez, J. T., Lu, Y., Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. Glutamate signaling in the auditory brainstem. Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. 64 (4), 75-108 (2017).
- Parks, T. N. Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study. Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Köppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).
- Fukui, I., et al. Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).
- Wang, X., et al. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- Hong, H., Sanchez, J. T. Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system. Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).
- Hong, H., et al. Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).
- Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis. eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).
- Tabor, K. M., et al. Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).
- Lipovsek, M., Wingate, R. J. Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei. Elife. 7, 40232 (2018).
- Passetto, M. F., et al. Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter’s vestibular complex of the chick brain. Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).
- Curry, R. J., Lu, Y. Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons. Brain Research. 1752, 147258 (2021).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX – Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).
