В городе Ово Внутрисосудистая инъекция куриным эмбрионам
Summary
Общей целью данной работы является описание того, как выполнить внутриклеточную инъекцию экзогенных материалов в куриные эмбрионы. Такой подход очень полезен для изучения биологии развития куриных эмбрионов.
Abstract
В качестве классической модельной системы биологии эмбрионов куриный эмбрион был использован для исследования эмбрионального развития и дифференцировки. Доставка экзогенных материалов в куриные эмбрионы имеет большое преимущество для изучения функции генов, трансгенного разведения и подготовки химер во время эмбрионального развития. Здесь мы показываем метод внутрисосудистой инъекции in ovo, при котором экзогенные материалы, такие как плазмидные векторы или модифицированные первичные половые клетки (PGC), могут быть перенесены в донорские куриные эмбрионы на ранних стадиях развития. Результаты показывают, что внутрисосудистая инъекция через дорсальную аорту и головку позволяет введенным материалам диффундировать во весь эмбрион через кровеносную систему. В представленном протоколе эффективность введения экзогенных плазмидных и лентивирусных векторов, а также колонизация вводимых экзогенных ПГК в гонаду-реципиента определялись путем наблюдения флуоресценции у эмбрионов. В данной статье подробно описаны процедуры этого метода, тем самым обеспечивая отличный подход к изучению функции генов, биологии эмбриона и развития, а также производства гонадно-химерной курицы. В заключение данная статья позволит исследователям с большим успехом и воспроизводимостью выполнить внутрисосудистую инъекцию экзогенных материалов в куриные эмбрионы.
Introduction
Куриные эмбрионы широко использовались на протяжении веков в развитии, иммунологическом, патологическом и других биологических применениях 1,2,3. Они имеют много неотъемлемых преимуществ перед другими животными моделями в изучении токсикологии и клеточной биологии4. Куриные эмбрионы легко доступны и могут манипулироваться in vitro и непосредственно наблюдаться на любой стадии развития, что обеспечивает удобную систему моделирования эмбрионов.
В целом, современные методы доставки куриного эмбриона, такие как электротрансфекция и инъекция в подгерминальную полость, имеют ограничения, такие как потребность в специализированном оборудовании и разработанной программе, а также неэффективность из-за наличия желтка и белка 5,6,7. Здесь мы показываем простой и эффективный метод транспортировки экзогенных материалов в куриные эмбрионы. Это может быть мощным инструментом, используемым при изучении биологии развития. Введенные материалы распространяются на весь эмбрион через кровообращение. Во время раннего развития куриных эмбрионов PHC могут мигрировать через кровь, колонизировать генитальный хребет, а затем развиваться в гаметы, которые обеспечивают ценный возможный путь для доставки экзогенных материалов8. В настоящее время этот метод широко используется при изучении функции генов, биологии эмбриона и развития, а также химерного и трансгенного производствакурицы 9,10,11.
Внутрисосудистая инъекция в куриные эмбрионы является хорошо зарекомендовавшим себя и широко используемым методом 12,13,14. В этой статье мы показываем всестороннее описание этого протокола, включая инъекционные материалы, места, дозировку и репрезентативные результаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод внутрисосудистой инъекции куриных эмбрионов оптимизирован для переноса в эмбрион экзогенных материалов (векторных, вирусных или ПГК). На основе этого метода мы построили модели куриного эмбриона со стабильной гиперэкспрессией или интерференцией генов (SpinZ, JUN, UBE2I и т.д.) <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31972547). Мы высоко ценим редактирование Цзин Вана и закадровый голос Малика Донлика в Университете штата Вашингтон, США.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
