Bitki Parazitik Nematodu Ditylenchus dipsaci Kültürleme ve Eleme

Bu çalışma için kullanılan D. dipsaci suşu G-137, Prens Edward County’deki Fish Lake 4 Variety sarımsaktan toplandı ve Tarım ve Tarım-Gıda Kanada tarafından sağlandı. Yeni bir kültüre başlıyorsanız, aşılama metodolojisi15 için Poirier ve ark.’ya danışın. 1. D. dipsaci’nin kültürlenmesi Daha önce bildirilen çalışmaları takiben medya ve plakaları hazırlayın15. 23 g/L NA (bakınız Malzeme Tablosu) ve ultra saf su ile 500 mL Besin agar (NA) ortamı hazırlayın. Steril tekniği kullanarak, 25 mL otoklavlanmış NA ortamını 20 tek kullanımlık Petri kabına (100 mm çap x 15 mm derinlikte) dökün. Agar’ın oda sıcaklığında (22 ° C) ~ 2 saat boyunca kapak açıkken katılaşmasına izin verin ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun. Minimum organik, 20 g/L sakaroz, 15 g/L agar ve damıtılmış su içeren 3,2 g/L GA bazal ortam içeren 500 mL Gamborg B-5 (GA) ortamı hazırlayın (bkz. Steril tekniği kullanarak, 10 tek kullanımlık Petri kabına (100 mm çap x 25 mm derinlikte) 50 mL otoklavlanmış GA ortamı dökün. Agar’ın oda sıcaklığında (22 °C) kapağı ~ 5 saat açıkken katılaşmasına izin verin ve filiz transferi yapılana kadar steril bir torbada oda sıcaklığında dik olarak saklayın.NOT: Fazla ortam plakaları, kontaminasyonun meydana gelmesi durumunda yapılır. Önceki bir çalışmadan modifiye edilmiş bir yöntemi izleyerek tohum sterilizasyonu gerçekleştirin15. Bir karıştırma çubuğu, 2 forseps, bir cam petri kabı ve 1 L damıtılmış su ile bir adet 2 L beheri otoklav yapın. 200 mL’lik EtOH çözeltisi ve 200 mL’lik ‘lik ticari ağartıcı çözeltisi hazırlayın. Bezelye tohumu kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Bir laboratuvar tezgahında bir Bunsen brülör alevinin yakınında bir karıştırma çubuğu bulunan steril bir 2 L beherine 150 tohum dökün. Beher içindeki tohumlara 200 mL% 95 EtOH ekleyin, karıştırma plakasında 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve ardından EtOH’yi bir atık kabına dökün. Tohumları tamamen batırmak için beherin içine çamaşır suyu çözeltisi dökün. Bir karıştırma plakasında 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın, ardından çamaşır suyunu bir atık kabına dökün. Tohumları batırmak için beherin içine damıtılmış su dökün ve 20 dakika boyunca bir karıştırma tabağında kuvvetlice karıştırın. Su yıkamalarını üç kez tekrarlayın, her yıkamadan sonra damıtılmış suyu dökün. Son su yıkamadan sonra, sterilize edilmiş tohumları cam Petri kabına dökün. Kirlenmeyi kontrol etmek için, sterilize forseps kullanarak laminer sel davlumbazındaki her 10 cm’lik NA plakasına (adım 1.1.1’de hazırlanan) 6 tohum aktarın. Tohumları plakanın çevresine yerleştirin (dolgun tohumlar en iyi sonucu verir). Plakaları laboratuvar ambalaj filmine ayrı ayrı sarın ve karanlıkta 26 ° C’de 3 gün boyunca inkübe edin.NOT: İhtiyaçtan daha fazla tohumun kaplanması, kirlenmemiş tohumların seçici kullanımına izin verecektir. Aşağıdaki adımı izleyerek filiz aktarımı gerçekleştirin. Laminer akışlı bir davlumbazda, her GA plakasında 2 kirlenmemiş tohumu plakalamak için sterilize forseps kullanın (adım 1.1.2’de hazırlanmıştır). Plakaları ayrı ayrı laboratuvar ambalaj filmine sarın ve tohumların filizlenmesini sağlamak için oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca inkübe edin. Önceki bir çalışmadan değiştirilmiş bir yöntemi izleyerek in vitro yetiştirme gerçekleştirin 15. 50 mL 20 g / L sakkaroz çözeltisi hazırlayın. Filtre sakkaroz çözeltisini sterilize edin ve bir kenara koyun. Laminer bir akış başlığında, mevcut bir kültür plakasından kök dokusu (~ 2cm3) içeren bir agar parçasını kesin. Bezelye fideleri ile yeni GA plakasına 500 μL sakkaroz çözeltisi pipet yerleştirin ve sakkarozun üzerine agar küpü yerleştirin. Plakaları laboratuvar ambalaj filmine ayrı ayrı sarın ve kültürü oda sıcaklığında (~ 22 ° C) alüminyum folyo ile kaplı bir kutuda tutun. Kültürü korumak için her 8-9 haftada bir taze GA plakalarındaki alt kültür nematodları. Nematodlar ~ 8 hafta sonra ekstrakte edilmeye hazırdır. 2. D. dipsaci’nin çıkarılması ve toplanması Aşağıdaki adımları izleyerek D. dipsaci ekstraksiyonunu gerçekleştirin. Otoklav 50 mL beher, 80 mm huni, 150 mL damıtılmış su ve kahve filtreleri. Huni beher içine yerleştirin ve huniyi steril kahve filtresiyle hizalayın. Laminer bir akış başlığında, steril bir neşter kullanarak agar ve kök dokusunu 1cm3’e kesin. Agar küplerini kahve filtresiyle kaplı huniye aktarın ve kahve filtresini nemlendirmek için yavaşça agar üzerine damıtılmış su dökün. Kahve filtresiyle kaplı huniyi beherden çıkarın ve kahve filtresiyle kaplı huni değiştirildikten sonra su seviyesi filtrenin dibine dokunana kadar beheri damıtılmış suyla doldurun. Kahve filtresi kaplı huniyi ve beheri alüminyum folyo ile örtün. Solucanların kahve filtresinden toplama kabına geçmesine izin vermek için tezgahın üstünde gece boyunca (16 saat) bırakın.NOT: Bir nematod kültürü plakası, bir diseksiyon mikroskobu ile incelendiğinde solucanlar agarın içine girdiğinde ekstraksiyon için hazırdır. Tipik olarak, bir plaka ilk aşılamasından 6-8 hafta sonra ekstraksiyon için hazırdır. D. dipsaci koleksiyonunu gerçekleştirin.NOT: Ertesi gün, D. dipsaci solucanları beherin dibine yerleşmiş olacaktır. Kahve filtreli huniyi çıkarın ve toplama kabından üstteki 40 mL suyu aspire edin; yerleşmiş solucanları bozmadığınızdan emin olun. 10 mL’lik plastik serolojik pipet kullanarak, kalan sıvıyı 15 mL’lik konik santrifüj tüpünde toplayın.NOT: Bu koleksiyon doğrudan tahlillerde kullanılabilir. 24 saat içinde kullanılmayacaklarsa 4 ° C’ye yerleştirin. Solucanlar, hareketlilik üzerinde gözle görülür bir etkisi olmadan 4 ° C’de 3 gün boyunca bırakılabilir. Huni’nin çıkarılması, toplama kabındaki solucanları rahatsız edebilir. Toplamadan önce dibe çökelmelerine izin verin. 3. In vitro küçük moleküllü ekran Aşağıdaki adımları izleyerek tahlil plakalarını hazırlayın. Otoklavlanmış damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak, oluktan 40 μL damıtılmış suyu düz tabanlı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın. Sabitleme aletini hazırlayın ve kimyasalları ekleyin Bir laboratuvar tezgahındaki Bunsen brülör alevinin yanına iğneleyici tepsileri yerleştirin (bkz. Birbirini izleyen pimleyici tepsilerine aşağıdakileri ekleyin: 25 mL pim temizleme çözeltisi, 35 mL DMSO (suda), 45 mL damıtılmış su, 55 mL EtOH ve 65 mL EtOH. Her tepsinin önüne bir parça kurutma kağıdı yerleştirin Temizleme çözeltisindeki pimleri emzirerek ve pimleri çözelti içinde üç kez (3x) yukarı ve aşağı hareket ettirerek sabitleme aletini temizleyin. Bu protokolde, ‘3x’ ve ’10x’, pinner’ı bir çözelti içinde sırasıyla üç veya on kez yukarı ve aşağı hareket ettirmek olarak tanımlanır. Leke kağıdındaki pimleri lekeleyin. Bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, pimleri damıtılmış suda 3 kat durulayın, ardından pimleri lekeleyin. Prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Son olarak, pimleri% 95 EtOH’de 3 kat durulayın, ardından pimleri lekeleyin. Bir kez daha tekrarlayın. Pinner’ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin. 96 delikli kimyasal stok plakalarından kimyasalları, kimyasal plakaya 3x sabitleyerek tahlil plakalarına ekleyin, ardından pimleri 10X’i tahlil plakasına aktarın. Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda dökün. Plakalar arasındaki iğneleme aletini aşağıdaki sırayla yıkayarak temizleyin, lekeleme kağıdı üzerinde aralarında leke yapın: DMSO’da 3x (bir kez), damıtılmış suda 3x (bir kez), EtOH’de 3x (bir kez), EtOH’de 3x (iki kez). Pinner’ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin. Tüm sabitleme tamamlandığında adım 3.2.2’yi yineleyin.NOT: Tarama, 60 μM’lik son konsantrasyonda gerçekleştirilmiştir. Solucanların eklenmesi Önce yeniden askıya alarak ve ardından gözlem için bir slayta düşük tutma uçları kullanarak 5 μL’yi pipetleyerek koleksiyondaki nematodların sayısını sayın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak 5 μL’deki nematod sayısını sayın. Steril damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu 2 solucan / μL’ye ayarlayın. Çok kanallı bir pipet ve bir oluk kullanarak, 96 delikli plakaların her bir oluğuna 10 μL (~ 20 solucan) ekleyin.NOT: Tarif edilen kültür ve toplama yöntemi kullanılarak kültür plakası başına yaklaşık 15.000 D. dipsaci nematodu toplanacaktır. Kuyu başına yirmi solucan kullanılır, çünkü küçük sayı, mobil ve hareketsiz olanların net bir şekilde görselleştirilmesini ve muhasebeleştirilmesini kolaylaştırır. Plakaları laboratuvar ambalaj filmine kapatın ve nemli bir kağıt havluyla sarın. Kutuya yerleştirin ve 200 rpm’de ayarlanmış 20 °C sallama inkübatöründe yapışkan bir ped üzerine yapıştırın. Plakaların minimum hareketini sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyerek plakaların kutuda stabilize edildiğinden emin olun. 4. Veri toplama ve analizi 5. günde plakaları diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. DMSO solvent kontrollerindeki ve ilaçla tedavi edilen kuyulardaki mobil ve toplam D. dipsaci sayısını sayın. Solucanlar nispeten hareketsizse, 19,20 hareketini uyarmak için kuyuya 40 mM’lik son konsantrasyona 2 μL1 M NaOH ekleyin.NOT: NaOH eklendikten sonra, solucanlar anında hareket eder ve 5 dakika içinde görüntülenmesi gerekir. Mobil solucanların oranını hesaplamak için mobil solucanların sayısı ve toplam solucan sayısı kullanılacaktır. Tahlilin uzunluğu, ekranın amacına bağlı olarak değişebilir. Mobil solucanların oranını hesaplayın. D. dipsaci ekranlarında, tekrarlanabilir bir şekilde% 0 mobil solucan veren kuyular güçlü vuruşlar olarak kategorize edilir.NOT: Diseksiyon mikroskopları aşamasında plakaların uzun süre maruz kalması önlenir, çünkü ışık kaynağı plakaları ısıtabilir ve biyotahlil üzerinde değişken etkilere neden olabilir.