Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

Proteinler için, 3 boyutlu (3-B) yapısal bilgi ile birlikte dinamiklerin aydınlatılması, biyomoleküler sistemlerin yapı-işlev ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açar. X-ışını kristalografisi ve kriyojenik elektron mikroskobu gibi yapısal yöntemler, statik bir yapı yakalar ve genellikle biyomolekül bağlanmasının ve dinamiğinin yönlerini aydınlatmak için çoklu yapıların belirlenmesini gerektirir¹. Bu makalede, bağlama siteleri veya bağlama etkileşimleri gibi genel yapısal öğeleri eşlemek için potansiyel olarak daha geçici ve statik yöntemlerle daha az kolay yakalanan çözüm tabanlı bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji için güçlü aday sistemler, 3 boyutlu bir yapının daha önce X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopisi veya diğer yapısal yöntemlerle belirlendiği sistemlerdir. Bu durumda, protein genel sekretuar yolunda merkezi bir oyuncu olan SecA-SecYEG kompleksinin X-ışını kristal yapısından yararlanarak, preproteinin membran² boyunca taşınmasından önce Förster rezonans enerji transferini (FRET) kullanarak bir sinyal peptid bağlanma bölgesinin yerini haritalandırıyoruz. Biyolojik sistemin genetik modifikasyonlar yoluyla manipülasyonu, 3-D yapısı hakkındaki bilgimizle birleştiğinde, kanal ^3’e yerleştirilmeden hemen önce sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunun belirlenmesini sağladı.

FRET, enerjinin bir molekülden (donör) diğerine (alıcı) radyasyonsuz transferini, mesafeye bağlı bir şekilde,^{uzay 4,5} boyunca içerir. Bu transferin etkinliği, donördeki bir azalma veya alıcı floresan yoğunluğundaki bir artış ile izlenir. Enerji transferinin verimliliği şu şekilde tanımlanabilir:

E = R 0 6/(R₀ 6 + R ⁶)

R₀ değerinin, aktarımın% 50 verimli olduğu mesafe⁶. Bu teknik daha önce moleküler bir cetvel olarak tanımlanmıştır ve donör-alıcı^boyaların 4,7,8,9 kimliğine bağlı olarak ^2.5-12 nm aralığındaki mesafelerin belirlenmesinde etkilidir. Donör floresan yoğunlukları ve alıcılı veya alıcısız ömürleri, transfer verimliliklerinin ve dolayısıyla^{mesafelerin 5,8} olarak belirlenmesine izin verir. Teknolojinin mevcudiyeti, yöntemin hassasiyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle, FRET ayrıca tek moleküllü floresan spektroskopisi ve konfokal mikroskopi⁶ gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Yeşil floresan proteini gibi floresan proteinlerin ortaya çıkışı, hücre içi dinamiklerin ve canlı hücre görüntülemenin gözlemlenmesini nispeten kolay hale getirmiştir^10,11. Bunlar gibi birçok FRET uygulaması bu sanal sayıda ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Bu çalışmada, yapısal detayları belirlemek için mesafe değerlerini elde etmek için FRET ölçümlerinin kullanımına özellikle odaklanıyoruz. Daha önce, FRET ölçümleri, protein 12,13,14’e, proteinlerin iç dinamiklerine ve protein bağlanma etkileşimlerine^15,16,17 bağlandığında DNA moleküllerinin konformasyonunu belirlemek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu yöntemin avantajları, nispeten düşük miktarda malzemeye sahip bir çözeltide esnek ve dinamik yapısal elemanları belirleme yeteneğinde yatmaktadır. Önemli bir şekilde, bu yöntem mevcut yapısal bilgilerle birlikte kullanıldığında özellikle etkilidir ve 3 boyutlu yapı belirleme aracı olarak kullanılamaz. Yöntem, çalışmanın genellikle hesaplamalı simülasyon^18,19 ile birleştirilen mevcut yapısal bilgilere dayanması durumunda yapının en iyi içgörüsünü ve iyileştirilmesini sağlar. Burada, kararlı durum ve zaman çözümlü FRET ölçümlerinden elde edilen mesafelerin kullanımı, genel sekretuar yolu^3’teki ana proteinler olan SecA-SecYEG kompleksinin mevcut bir kristalografik yapısı üzerinde, yeri bilinmeyen bir bağlanma bölgesini haritalamak için tanımlanmıştır.

Prokaryotlardan ökaryotlara ve arkelere kadar oldukça korunmuş bir sistem olan genel salgı yolu, proteinlerin hücre içindeki fonksiyonel konumlarına membran boyunca veya içine taşınmasına aracılık eder. Çalışmamızda kullanılan organizma olan E. coli gibi Gram-negatif bakteriler için, proteinler iç zar boyunca periplazmaya yerleştirilir veya yer değiştirir. Bakteriyel SecY kanal kompleksi (translokon olarak adlandırılır), tipik olarak N-terminus^20,21’de bulunan bir sinyal dizisi aracılığıyla hücredeki doğru konumuna yönlendirilen yeni sentezlenmiş proteini translokasyona yerleştirmek için diğer proteinlerle koordine olur. Periplazmaya bağlı proteinler için, ATPaz SecA proteini, ribozomun çıkış tüneli ile ve yaklaşık 100 kalıntı çevrildikten sonra preprotein ile ilişkilidir²². SecB şaperon proteini ile birlikte, preproteini açılmamış bir durumda tutar. SecA, SecYEG translokonuna bağlanır ve birçok ATP hidrolizi döngüsü boyunca, membran^23,24 boyunca protein taşınmasını kolaylaştırır.

SecA, sitozolik ve membrana bağlı formlarda bulunan çok alanlı bir proteindir. Sitosoldeki homodimerik bir protein olan SecA, bir preprotein bağlanma veya çapraz bağlanma alanı²⁵, iki nükleotid bağlayıcı alan, bir sarmal kanat alanı, bir sarmal iskele alanı ve iki sarmal parmak (THF) ^{26,27,28,29’dan} oluşur (Şekil 1). SecA-SecYEG kompleksinin önceki kristalografik çalışmalarında, THF’nin yeri, protein translokasyonunda aktif olarak yer aldığını ve daha sonra sinyal peptidi ile çapraz bağlanma deneylerinin bu bölgenin protein translokasyonundaki önemini daha da ortaya koyduğunu ileri sürdü^30,31. FRET haritalama metodolojisini kullanan önceki çalışmalar, eksojen sinyal peptitlerinin SecA ^2,32’nin bu bölgesine bağlandığını göstermiştir. SecYEG kanalına yerleştirilmeden önce sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin konformasyonunu ve yerini tam olarak anlamak için, erken olgun bölgenin sinyal dizisinin ve kalıntılarının bir Ser-Gly bağlayıcı aracılığıyla SecA’ya bağlandığı bir protein kimera oluşturuldu (Şekil 1). Bu biyolojik olarak uygulanabilir yapı kullanılarak, preproteinin sinyal dizisinin ve erken olgun bölgesinin THF’ye paralel bir şekilde bağlandığı^{gösterilmiştir 2}. Daha sonra, FRET haritalama metodolojisi^{, aşağıda açıklandığı} gibi SecYEG’nin varlığında sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunu ve yerini aydınlatmak için kullanılmıştır.

SecA-SecYEG kompleksi^{33,34,35’in 3-D} yapısı ve bağlanma yerinin olası konumu hakkında bilgi^, bireysel FRET mesafelerinin kesişiminin bağlanma yeri yerini tanımladığı yerlere ^{bağışçı-alıcı} etiketlerini makul bir şekilde yerleştirmemize izin verdi. Bu FRET haritalama ölçümleri, sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin, ucu SecYEG kanalının ağzında bulunan bir saç tokası oluşturduğunu ve saç tokası yapısının kanal yerleştirmeden önce şablonlandığını gösterdiğini ortaya koymuştur.