Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей

Для белков выяснение динамики наряду с 3-мерными (3-D) структурными знаниями приводит к лучшему пониманию структурно-функциональных отношений биомолекулярных систем. Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия, захватывают статическую структуру и часто требуют определения нескольких структур для выяснения аспектов связывания биомолекул и динамики¹. В этой статье обсуждается основанный на решении метод отображения глобальных структурных элементов, таких как сайты связывания или взаимодействия привязки, которые потенциально более преходящи и менее легко захватываются статическими методами. Сильными системами-кандидатами для этой методологии являются те, в которых 3D-структура была ранее определена рентгеновской кристаллографией, ЯМР-спектроскопией или другими структурными методами. В этом случае мы используем рентгеновскую кристаллическую структуру комплекса SecA-SecYEG, центрального игрока в общем секреторном пути белка, для отображения местоположения сайта связывания сигнального пептида с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) до переноса препротеина через мембрану². Манипулирование биологической системой с помощью генетических модификаций в сочетании с нашими знаниями о 3D-структуре позволило определить конформацию сигнальной последовательности и ранней зрелой области непосредственно перед введением в канал ³.

FRET включает в себя безрадиационную передачу энергии от одной молекулы (донора) к другой (акцептору) в зависимости от расстояния, то есть через пространство ^4,5. Эффективность этого переноса контролируется либо через уменьшение донора, либо через увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции. Эффективность передачи энергии можно охарактеризовать как

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

в котором значение R₀ — это расстояние, на котором передача эффективна на 50%⁶. Методика ранее была описана как молекулярная линейка и эффективна при определении расстояний в диапазоне 2,5-12 нм в зависимости от идентичности донор-акцепторных красителей 4,7,8,9. Интенсивность и срок службы донорской флуоресценции с акцептором или без него позволяют определить эффективность переноса и, следовательно, расстояния ^5,8. Благодаря доступности технологии, чувствительности метода и простоте использования, FRET также нашел широкое применение в таких областях, как одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия и конфокальная микроскопия⁶. Появление флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок, сделало наблюдение за внутриклеточной динамикой и визуализацией живых клеток относительно легким^10,11. Многие приложения FRET, подобные этим, подробно обсуждаются в этом виртуальном выпуске.

В этом исследовании мы уделяем особое внимание использованию измерений FRET для получения значений расстояния для определения структурных деталей. Ранее измерения FRET эффективно использовались для определения конформации молекул ДНК при связывании с белком 12,13,14, внутренней динамики белков и белковосвязывающих взаимодействий 15,16,17. Преимущества этого метода заключаются в возможности определения гибких и динамичных конструктивных элементов в растворе с относительно небольшим количеством материала. Примечательно, что этот метод особенно эффективен при использовании в сочетании с существующей структурной информацией и не может быть использован в качестве средства определения 3D-структуры. Метод обеспечивает наилучшее понимание и уточнение структуры, если работа основывается на существующей структурной информации, часто в сочетании с вычислительным моделированием^18,19. Здесь описано использование расстояний, полученных из стационарных и разрешенных по времени измерений FRET, для картирования сайта связывания, местоположение которого не было известно, на существующей кристаллографической структуре комплекса SecA-SecYEG основных белков в общем секреторном пути³.

Общий секреторный путь, высококонсервативная система от прокариот до эукариот и архей, опосредует транспорт белков либо через мембрану, либо в мембрану к их функциональному расположению в клетке. Для грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, организма, используемого в нашем исследовании, белки вставляются или перемещаются через внутреннюю мембрану в периплазму. Бактериальный комплекс каналов SecY (называемый транслоконом) координируется с другими белками для перемещения вновь синтезированного белка, который направляется к его правильному расположению в клетке через сигнальную последовательность, обычно расположенную на N-конце^20,21. Для белков, связанных с периплазмой, белок АТФазы SecA связывается с выходным туннелем рибосомы и с препротеином после того, как приблизительно 100 остатков были переведены²². Наряду с белком шаперона SecB он поддерживает препротеин в развернутом состоянии. SecA связывается с транслоконом SecYEG и через многие циклы гидролиза АТФ облегчает транспорт белка через мембрану^23,24.

SecA представляет собой многодоменный белок, который существует в цитозольной и мембраносвязанной формах. Гомодимерный белок в цитозоле, SecA состоит из препротеин-связывающего или сшивающего домена²⁵, двух нуклеотид-связывающих доменов, спирального домена крыла, спирального каркасного домена и двух спиральных пальцев (THF)26,27,28,29 (Рисунок 1). В предыдущих кристаллографических исследованиях комплекса SecA-SecYEG расположение ТГФ предполагало, что он активно участвовал в транслокации белка, а последующие эксперименты по сшиванию с сигнальным пептидом дополнительно установили значение этой области в транслокации белка ^30,31. Предыдущие исследования с использованием методологии картирования FRET показали, что экзогенные сигнальные пептиды связываются с этой областью SecA ^2,32. Чтобы полностью понять конформацию и местоположение сигнальной последовательности и ранней зрелой области препротеина до вставки в канал SecYEG, была создана белковая химера, в которой сигнальная последовательность и остатки ранней зрелой области были прикреплены к SecA через линкер Ser-Gly (рисунок 1). Используя эту биологически жизнеспособную конструкцию, было дополнительно продемонстрировано, что сигнальная последовательность и ранняя зрелая область препротеина связываются с ТГФ параллельным образом². Впоследствии методология картирования FRET была использована для выяснения конформации и местоположения последовательности сигналов и ранней зрелой области в присутствии SecYEG, как описано ниже³.

Знание 3-D структуры комплекса SecA-SecYEG ^33,34,35 и возможного местоположения места связывания позволило нам разумно разместить донорско-акцепторные этикетки в местах, где пересечение отдельных расстояний FRET определяет местоположение места связывания. Эти измерения картирования FRET показали, что последовательность сигналов и ранняя зрелая область препротеина образуют шпильку с наконечником, расположенным в устье канала SecYEG, демонстрируя, что структура шпильки шаблонизируется до вставки канала.