Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

Para as proteínas, a elucidação da dinâmica juntamente com o conhecimento estrutural tridimensional (3-D) leva a uma compreensão aprimorada das relações estrutura-função dos sistemas biomoleculares. Métodos estruturais, como cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica criogênica, capturam uma estrutura estática e muitas vezes requerem a determinação de múltiplas estruturas para elucidar aspectos da ligação biomolécula e da dinâmica¹. Este artigo discute um método baseado em soluções para mapear elementos estruturais globais, como locais de vinculação ou interações vinculativas, que são potencialmente mais transitórios e menos facilmente capturados por métodos estáticos. Sistemas fortes candidatos a essa metodologia são aqueles em que uma estrutura 3D foi previamente determinada por cristalografia de raios-X, espectroscopia de NMR ou outros métodos estruturais. Neste caso, aproveitamos a estrutura de cristal de raios-X do complexo SecA-SecYEG, um player central na via secretary geral da proteína, para mapear a localização de um local de ligação de peptídeo de sinal usando a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) antes do transporte da pré-proteína através da membrana². A manipulação do sistema biológico através de modificações genéticas aliadas ao nosso conhecimento da estrutura 3D possibilitou a determinação da conformação da sequência de sinal e da região madura precoce imediatamente antes da inserção no canal ³.

O FRET envolve a transferência de energia sem radiação de uma molécula (doador) para outra (aceitadora) de forma dependente da distância que é através do espaço ^4,5. A eficiência dessa transferência é monitorada através de uma diminuição do doador ou um aumento na intensidade de fluorescência aceitadora. A eficiência da transferência de energia pode ser descrita como

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

em que o valor R₀ é a distância em que a transferência é 50% eficiente⁶. A técnica já foi descrita como uma régua molecular e é eficaz na determinação de distâncias na faixa de 2,5-12 nm, dependendo da identidade dos corantes aceitadores de doadores 4,7,8,9. As intensidades de fluorescência do doador e as vidas com ou sem aceitação permitem a determinação da eficiência de transferência e, consequentemente, distâncias ^5,8. Devido à disponibilidade da tecnologia, sensibilidade do método e facilidade de uso, a FRET também encontrou ampla aplicação em áreas como espectroscopia de fluorescência de molécula única e microscopia confocal⁶. O advento de proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde tornou a observação da dinâmica intracelular e da imagem de células vivas relativamente fácil^10,11. Muitas aplicações FRET como essas são discutidas detalhadamente nesta questão virtual.

Neste estudo, focamos particularmente no uso de medidas de FRET para produzir valores de distância para determinar detalhes estruturais. Anteriormente, as medidas de FRET têm sido efetivamente utilizadas para determinar a conformação de moléculas de DNA quando ligadas à proteína 12,13,14, a dinâmica interna das proteínas e interações de ligação proteica 15,16,17. As vantagens deste método residem na capacidade de determinar elementos estruturais flexíveis e dinâmicos em uma solução com quantidades relativamente baixas de material. Significativamente, este método é particularmente eficaz quando utilizado em conjunto com as informações estruturais existentes e não pode ser usado como um meio de determinação da estrutura 3D. O método fornece a melhor visão e refinamento da estrutura se o trabalho se baseia em informações estruturais existentes, muitas vezes acoplado à simulação computacional^18,19. Aqui, descreve-se o uso de distâncias obtidas a partir de medições fret de estado estável e tempo resolvidos para mapear um local de ligação, local do qual não se sabia, em uma estrutura cristalográfica existente do complexo SecA-SecYEG, grandes proteínas na via secreta³ geral.

O caminho secreto geral, um sistema altamente conservado de procariotes a eucariotes até arqueias, media o transporte de proteínas através ou para dentro da membrana para sua localização funcional na célula. Para bactérias gram-negativas, como e. coli, o organismo usado em nosso estudo, proteínas são inseridas ou translocadas através da membrana interna para o periplasma. O complexo de canal secy bacteriano (chamado translocon) coordena com outras proteínas para translocar a proteína recém-sintetizada, que é direcionada para sua localização correta na célula através de uma sequência de sinal tipicamente localizada no N-terminus^20,21. Para proteínas destinadas ao periplasma, a proteína ATPase SecA associa-se ao túnel de saída do ribossomo, e com a pré-proteína após aproximadamente 100 resíduos terem sido traduzidos²². Juntamente com a proteína acompanhante da SecB, mantém a pré-proteína em um estado desdobrado. A SecA se liga ao translocon SecYEG, e através de muitos ciclos de hidrólise ATP, facilita o transporte de proteínas através da membrana^23,24.

SecA é uma proteína multi-domínio que existe em formas citosolísticas e ligadas à membrana. Uma proteína homodimemérica no citosol, a SecA consiste em um domínio de ligação pré-proteína ou cross-linking²⁵, dois domínios de ligação de nucleotídeos, um domínio de asa helicoidal, um domínio helicoidal de andaimes e o dedo de duas hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). Em estudos cristalográficos anteriores do complexo SecA-SecYEG, a localização do THF sugeriu que ele estava ativamente envolvido na translocação de proteínas e subsequentes experimentos de ligação cruzada com o peptídeo de sinal estabeleceu ainda mais a importância desta região na translocação de proteínas^30,31. Estudos anteriores, utilizando a metodologia de mapeamento DA FRET, demonstraram que peptídeos de sinal exógenos se ligam a esta região da SecA ^2,32. Para compreender completamente a conformação e localização da sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína antes da inserção no canal SecYEG, foi criada uma quimera proteica na qual a sequência de sinal e resíduos da região madura precoce foram anexados à SecA através de um linker Ser-Gly (Figura 1). Usando essa construção biologicamente viável, foi demonstrado ainda que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína se ligam ao THF de forma paralela². Posteriormente, utilizou-se a metodologia de mapeamento DO FRET para elucidar a conformação e a localização da sequência de sinal e da região madura precoce na presença de SecYEG conforme descrito abaixo de³.

O conhecimento da estrutura 3D do complexo SecA-SecYEG ^33,34,35 e a possível localização do local de ligação nos permitiu colocar criteriosamente rótulos de doadores-aceitadores em locais onde a intersecção de distâncias individuais de FRET identifica a localização do local de vinculação. Estas medidas de mapeamento fret revelaram que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína formam um grampo de cabelo com a ponta localizada na boca do canal SecYEG, demonstrando que a estrutura do grampo de cabelo é modelada antes da inserção do canal.