フェルスター共鳴エネルギー伝達マッピング:全球構造特徴を解明する新しい方法論

タンパク質については、3次元(3次元)構造知識とともにダイナミクスを解明することで、生体分子系の構造と機能の関係の理解を深めることができます。X線結晶学や極低温電子顕微鏡などの構造的方法は、静的構造を捉え、生体分子結合やダイナミクスの側面を解明するために複数の構造の決定を必要とすることが多い¹。この記事では、結合部位や結合相互作用など、静的な方法ではキャプチャしにくい可能性のあるグローバル構造要素をマッピングするためのソリューションベースの方法について説明します。この方法論の有力な候補系は、X線結晶学、NMR分光法、または他の構造法によって3次元構造が以前に決定されたものである。この場合、タンパク質一般分泌経路の中心プレーヤーであるSecA-SecYEG複合体のX線結晶構造を利用して、膜²を横切るプレタンパク質の輸送の前にフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を用いてシグナルペプチド結合部位の位置をマッピングする。遺伝子改変による生体系の操作と3次元構造に関する我々の知識を組み合わせることで、チャネル ³への挿入直前のシグナル配列と早期成熟領域の立体構造の決定が可能となった。

FRETは、空間^4,5を通る距離依存的な方法で、ある分子(ドナー)から別の分子(アクセプター)へのエネルギーの放射線のない移動を含む。この転送の効率は、ドナーの減少またはアクセプター蛍光強度の増加のいずれかによってモニターされます。エネルギー移動の効率は、次のように記述できます。

E = R 0 6/(R₀ 6 + R ⁶)

ここで、R0値は、転送が₅₀%効率的である距離である⁶。この技術は、以前に分子定規として記載されており、ドナー – アクセプター色素4,7,8,9の同一性に応じて、2.5〜12nmの範囲の距離を決定するのに有効である。ドナーの蛍光強度および寿命は、アクセプターの有無にかかわらず、転写効率の決定を可能にし、その結果、距離^5,8である。この技術の利用可能性、方法の感度、および使いやすさにより、FRETは、単一分子蛍光分光法および共焦点顕微鏡⁶などの分野でも幅広い用途を見出しました。緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の出現により、細胞内動態の観察および生細胞イメージングが比較的容易になった^10,11。このような多くのFRETアプリケーションについては、この仮想問題で詳しく説明します。

この研究では、構造の詳細を決定するための距離値を得るためにFRET測定を使用することに特に焦点を合わせています。これまで、FRET測定は、タンパク質12、¹³、¹⁴に結合したときのDNA分子の立体構造、タンパク質の内部動態、およびタンパク質結合相互作用^15、16、17を決定するために効果的に使用されてきた。この方法の利点は、比較的少量の材料を含むソリューション中で柔軟で動的な構造要素を決定する能力にあります。重要なことに、この方法は、既存の構造情報と組み合わせて使用する場合に特に効果的であり、3次元構造決定の手段として使用することはできません。この方法は、作業がしばしば計算シミュレーションと組み合わされた既存の構造情報に基づいて構築されている場合、構造の最良の洞察と洗練を提供する^18,19。ここでは、定常状態および時間分解FRET測定から得られた距離を使用して、SecA-SecYEG複合体の既存の結晶学的構造上の結合部位を、一般^{分泌経路3}の主要なタンパク質上に位置が知られていなかった。

一般分泌経路は、原核生物から真核生物、古細菌まで高度に保存された系であり、細胞内の機能的位置への膜を横切ってまたは膜内へのタンパク質の輸送を媒介する。我々の研究で使用された生物である大腸菌などのグラム陰性菌の場合、タンパク質は内膜を横切ってペリプラズムに挿入または転座する。細菌のSecYチャネル複合体(トランスロコンと呼ばれる)は、他のタンパク質と協調して、新たに合成されたタンパク質を転座させ、これは、典型的にはN末端に位置するシグナル配列を介して細胞内のその正しい位置に向けられる^20,21。ペリプラズムに結合したタンパク質の場合、ATPase SecAタンパク質はリボソームの出口トンネルと会合し、約100残基が翻訳された後のプレタンパク質と^{会合する22}。SecBシャペロンタンパク質とともに、プレタンパク質を折り畳まれていない状態に維持する。SecAは、SecYEGトランスロコンに結合し、そしてATP加水分解の多くのサイクルを経て、膜を横切るタンパク質輸送を促進する^23、24。

SecAは、細胞質ゾルおよび膜結合形態で存在するマルチドメインタンパク質である。細胞質ゾル中のホモ二量体タンパク質であるSecAは、プレタンパク質結合または架橋ドメイン²⁵、2つのヌクレオチド結合ドメイン、ヘリカルウィングドメイン、ヘリカルスキャフォールドドメイン、および2つのヘリックスフィンガー(THF)²⁶、^27、28、29からなる(図1)。SecA-SecYEG複合体の以前の結晶学的研究において、THFの位置は、それがタンパク質転座に積極的に関与していることを示唆し、その後のシグナルペプチドとの架橋実験は、タンパク質転座におけるこの領域の重要性をさらに確立^した30,31。FRETマッピング方法論を用いた以前の研究では、外因性シグナルペプチドがSecA^2,32のこの領域に結合することが実証^された。SecYEGチャネルへの挿入前のプレタンパク質のシグナル配列と初期成熟領域の立体構造と位置を完全に理解するために、初期成熟領域のシグナル配列と残基がSer-Glyリンカーを介してSecAに結合したタンパク質キメラを作成した(図1)。この生物学的に生存可能な構築物を用いて、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が並行してTHFに結合することをさらに実証^した2。続いて、FRETマッピング方法論を用いて、下記³のようにSecYEG存在下におけるシグナル配列および初期成熟領域の立体構造および位置を解明した。

SecA-SecYEG複合体^33,34,35の³次元構造と結合部位の可能な位置に関する知識により、個々のFRET距離の交点が結合部位の位置を特定する場所にドナー-アクセプター標識を慎重に配置することができました。これらのFRETマッピング測定は、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が、先端がSecEGチャネルの口に位置するヘアピンを形成することを明らかにし、ヘアピン構造がチャネル挿入前にテンプレート化されることを実証した。