מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

עבור חלבונים, הבהרת הדינמיקה יחד עם ידע מבני תלת-ממדי (תלת-ממדי) מובילה להבנה משופרת של יחסי מבנה-תפקוד של מערכות ביו-מולקולריות. שיטות מבניות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית, לוכדות מבנה סטטי ולעתים קרובות דורשות קביעת מבנים מרובים כדי להבהיר היבטים של קשירת ביו-מולקולציה ודינמיקה¹. מאמר זה דן בשיטה מבוססת פתרון למיפוי אלמנטים מבניים גלובליים, כגון אתרי קשירה או אינטראקציות איגוד, שעשויים להיות ארעיים יותר ופחות קלים ללכידה בשיטות סטטיות. מערכות מועמדות חזקות למתודולוגיה זו הן כאלה שבהן מבנה תלת-ממדי נקבע בעבר על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה של NMR או שיטות מבניות אחרות. במקרה זה, אנו מנצלים את המבנה הגבישי של קרני הרנטגן של קומפלקס SecA-SecYEG, שחקן מרכזי במסלול ההפרשה הכללי של חלבונים, כדי למפות את מיקומו של אתר קשירת פפטידי אותות באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) לפני הובלת הפרפרוטאין על פני הממברנה². מניפולציה של המערכת הביולוגית באמצעות שינויים גנטיים יחד עם הידע שלנו על המבנה התלת-ממדי אפשרו את קביעת הקונפורמציה של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם מיד לפני ההחדרה לערוץ ³.

FRET כולל העברה נטולת קרינה של אנרגיה ממולקולה אחת (תורם) לאחרת (מקבל) באופן תלוי מרחק שנמצא דרך חלל ^4,5. היעילות של העברה זו מנוטרת באמצעות ירידה בתורם או עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של המקבלים. ניתן לתאר את היעילות של העברת אנרגיה כ

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

שבו ערך R₀ הוא המרחק שבו ההעברה יעילה ב-50%⁶. הטכניקה תוארה בעבר כשליט מולקולרי והיא יעילה בקביעת מרחקים בטווח של 2.5-12 ננומטר, בהתאם לזהותם של צבעי התורם-מקבל ^4,7,8,9. עוצמות הפלואורסצנציה של התורם ואורך החיים עם או בלי מקבל מאפשרים קביעת יעילות ההעברה וכתוצאה מכך, מרחקים ^5,8. בשל זמינות הטכנולוגיה, רגישות השיטה וקלות השימוש, FRET מצאה יישום רחב גם בתחומים כגון ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת ומיקרוסקופיה קונפוקלית⁶. הופעתם של חלבונים פלואורסצנטיים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק הפכה את התצפית על דינמיקה תוך-תאית והדמיה של תאים חיים לקלה יחסית^ל-10,11. יישומי FRET רבים כגון אלה נדונים בפירוט בנושא וירטואלי זה.

במחקר זה, אנו מתמקדים במיוחד בשימוש במדידות FRET כדי להניב ערכי מרחק כדי לקבוע פרטים מבניים. בעבר, נעשה שימוש יעיל במדידות FRET כדי לקבוע את הקונפורמציה של מולקולות דנ”א כאשר הן קשורות לחלבון 12,13,14, לדינמיקה הפנימית של חלבונים ולאינטראקציות קושרות חלבונים 15,16,17. היתרונות של שיטה זו טמונים ביכולת לקבוע אלמנטים מבניים גמישים ודינמיים בתמיסה עם כמויות נמוכות יחסית של חומר. באופן משמעותי, שיטה זו יעילה במיוחד כאשר משתמשים בה בשילוב עם מידע מבני קיים ואינה יכולה לשמש כאמצעי לקביעת מבנה תלת-ממדי. השיטה מספקת את התובנה הטובה ביותר ואת העידון של המבנה אם העבודה מתבססת על מידע מבני קיים שלעתים קרובות בשילוב עם סימולציה חישובית^18,19. כאן מתואר השימוש במרחקים המתקבלים ממדידות FRET במצב יציב ובזמן לפתרון זמן כדי למפות אתר מחייב, שמיקומו לא היה ידוע, על מבנה קריסטלוגרפי קיים של קומפלקס SecA-SecYEG, חלבונים עיקריים במסלול ההפרשה הכללי³.

מסלול ההפרשה הכללי, מערכת שמורה מאוד, מפרוקריוטים דרך אאוקריוטים ועד ארכיאה, מתווך את העברת החלבונים לרוחב או לתוך הממברנה למיקומה התפקודי של התא. עבור חיידקים גראם-שליליים, כגון E. coli, האורגניזם ששימש במחקר שלנו, חלבונים מוחדרים לתוך הממברנה הפנימית או עוברים טרנסלוקציה על פני הממברנה הפנימית לפריפלסמה. קומפלקס תעלות ה-SecY החיידקי (המכונה טרנסלוקון) מתאם עם חלבונים אחרים כדי לבצע טרנסלוקציה של החלבון המסונתז החדש, המופנה למיקומו הנכון בתא באמצעות רצף אותות הממוקם בדרך כלל ב-N-terminus^20,21. עבור חלבונים הקשורים לפריפלזמה, החלבון ATPase SecA מתחבר למנהרת היציאה של הריבוזום, ועם הפריפרוטאין לאחר שכ-100 שאריות תורגמו²². יחד עם חלבון המלווה של SecB, הוא שומר על הפרפרוטאין במצב של התגלגלות. SecA נקשר לטרנסלוקון SecYEG, ובאמצעות מחזורים רבים של הידרוליזה של ATP, מאפשר הובלת חלבונים על פני הממברנה^23,24.

SecA הוא חלבון רב-תחומי שקיים בצורות ציטוזוליות וממברנה הקשורות לממברנה. החלבון ההומודימרי בציטוזול, SecA מורכב מתחום קשירת פרפרוטאין או קישור צולב²⁵, שני תחומים קושרי נוקלאוטידים, תחום כנף סלילית, תחום פיגומים סליליים ושתי אצבעות סליל (THF)^26,27,28,29 (איור 1). במחקרים קריסטלוגרפיים קודמים של קומפלקס SecA-SecYEG, מיקומו של ה-THF הציע כי הוא היה מעורב באופן פעיל בטרנסלוקציה של חלבונים וניסויים צולבים שלאחר מכן עם פפטיד האותות ביססו עוד יותר את המשמעות של אזור זה בטרנסלוקציה של חלבונים^30,31. מחקרים קודמים, שהשתמשו במתודולוגיית המיפוי FRET, הראו כי פפטידי אותות אקסוגניים נקשרים לאזור זה של SecA ^2,32. כדי להבין באופן מלא את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרה-פרוטאין לפני ההחדרה לתעלת SecYEG, נוצרה כימרה חלבונית שבה רצף האותות והשאריות של האזור הבוגר המוקדם חוברו ל-SecA באמצעות מקשר Ser-Gly (איור 1). באמצעות מבנה בר-קיימא ביולוגית זה, הוכח עוד יותר כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין נקשרים ל-THF באופן מקביל². לאחר מכן, מתודולוגיית מיפוי FRET שימשה כדי להבהיר את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם בנוכחות SecYEG כמתואר להלן³.

הידע על המבנה התלת-ממדי של מתחם SecA-SecYEG 33,34,35 והמיקום האפשרי של אתר הכריכה אפשרו לנו למקם באופן שיפוטי תוויות תורמים-מקבלים במיקומים שבהם ההצטלבות של מרחקי FRET בודדים מזהה את מיקום אתר הכריכה. מדידות מיפוי FRET אלה גילו כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין יוצרים סיכת שיער עם הקצה הממוקם בפתחו של ערוץ SecYEG, מה שמדגים כי מבנה סיכות השיער מעוצב לפני החדרת התעלה.