蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

1. 透明化液の調製 CS溶液を調製するには、10%(w / v)キシリトール、15%(w / v)デオキシコール酸ナトリウム、および25%(w / v)尿素をマグネチックスターラー上の蒸留水に溶解します。注:デオキシコール酸ナトリウム粉末は、空気中に浮遊しやすいため、ドラフトチャンバーで計量する必要があります。CSは、暗所で室温で1年以上保存することができます。 CSA溶液を調製するために、上記で得られたCS溶液に亜硫酸ナトリウム(終濃度50mM)を添加する。注:還元剤が容易に失活するので、使用直前にCS溶液に亜硫酸ナトリウムを加えてください。 固定液の調製 40mLの滅菌水を円錐形のチューブに移し、2gのパラホルムアルデヒドを加える。200 μLの2 N NaOHを加えて、溶液のpHを上昇させる。チューブを閉じてパラフィルムで密封した後、すべてが溶解するまで時折反転させて60°Cでインキュベートする。 溶液を室温まで冷却した後、5mLの10倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、pHを7.4に調整した。滅菌水を加えて、容量を50mLにします。注:新しく調製した固定液が好ましい。この溶液は、-30°Cで数ヶ月間保存することもできる。 3. サンプルの固定 マイクロチューブ内の固定液に植物試料を浸漬し(図1A)、固定液の体積が試料体積の5倍以上であることを確認する。 マイクロチューブをパラフィルムで密封し、針を使って穴を開けます。真空減圧中にサンプルがこぼれる危険があるため、チューブを開いたままにしないでください。 マイクロチューブをデシケーターに入れ、真空度(約690mmHg)をゆっくりと調整して、サンプルから気泡が徐々に現れるようにします(図1B-C)。デシケーターを排気した後、真空ポンプの電源を切ります。マイクロチューブを室温で30分間邪魔されずに放置する。 デシケーターを慎重に通気して、サンプルを乱さないようにします。真空ポンプの電源を再び入れ、デシケーターを排気した後に電源を切ります。マイクロチューブを室温で30分間邪魔されずに放置する。メモ:デシケーターの通気中にサンプルが損傷しないように注意する必要があります。サンプルへの固定液の浸透は、2回の真空処理によって増強される。さらなる真空処理は、固定液をより厚いサンプルに浸透させるのに役立ちます。 固定液をマイクロチューブにぶつけずにデシケーターを慎重に開きます。マイクロピペットを使用して、固定液を除去し、1x PBSを添加する。1分間保存した後、古いPBSを新しい1x PBSと交換します(図1D)。 4. 清算 PBSを除去した後、透明化溶液のサンプル容量の5倍加える。 マイクロチューブをパラフィルムで密封し、針を使って穴を開けます。サンプルをデシケーターに入れ、ステップ3.3のように排気し、真空ポンプをオフにします。マイクロチューブを室温で60分間邪魔しないでおきます。 デシケーターをそっと開きます。マイクロチューブをパラフィルムで閉じ、蛍光タンパク質の光退色を避けるために、室温で暗所に保管してください。マイクロチューブを1〜2日ごとに反転させて、クリアリングプロセスを加速します。 クリアリングソリューションが緑色に変わったら、ソリューションが無色になるまで新しいクリアリングソリューションと交換します(図1E-H)。 図1:CS処理の手順。 (A)シロイヌナズナの苗木を4%PFA(パラホルムアルデヒド)溶液中で。(B)試料をデシケーターに入れる。(c)苗を真空下で固定する。(d)減圧処理後のPFA溶液に苗を浸漬する工程。(e)得られた3日間清澄化液処理苗。クリアリング溶液の緑色に注意してください。(f)透明化溶液を、処理の3日後に交換する。(g)得られた5日間透明化液処理苗。(h)清澄溶液を、処理の5日後に交換する。スケールバー:1センチメートル(A、C-H)と5センチメートル(B)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5. 化学染料染色 マイクロチューブに、核染色用のヘキスト33342(終濃度10μg/mL)または細胞壁染色用のカルコフルオールホワイト(終濃度1mg/mL)を加え、1時間待ちます。色素溶液を除去した後、新鮮な透明化溶液でサンプルを1時間洗浄する。注:一晩の染色および洗浄は、組織への蛍光色素の浸透を改善し、バックグラウンド蛍光を低減することができる。塩基性フクシン9(リグニン)、オーラミンO9(リグニン、スベリン、およびクチン)、ナイルレッド9(スベリン)、ダイレクトイエロー969、ダイレクトレッド239、およびSR220010、11(細胞壁)などの様々な蛍光色素がCS溶液と適合性である。 6. 観察 シリコーンゴムシートをカミソリの刃で切断し、スペーサー用のフレームを作製した(図2A)。注:シリコンゴムシートの厚さは、サンプルの厚さに応じて調整してください。透明化液で処理したサンプルは柔らかいため、カバーガラスで直接覆うと破損します。 シリコンフレームをカバーガラス(25 x 60 mmなど)の上に置きます(図2B)。処理したサンプルをフレーム内に置き、約100μLの透明化溶液を加えて、フレーム内の気泡を除去します。別のカバーガラス(18 x 18 mmまたは24 x 24 mm)で覆い、クリアリング溶液の蒸発を防ぎます(図2C)。 蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。観察後、マイクロチューブに入れた透明化液にサンプルを戻し、暗所で室温で保存する。 図2:顕微鏡観察のためのサンプル調製 。(A)厚さ0.2mmのシリコーンシートをフレームに切ります。(B)シリコンシートフレームをカバーガラスの上に置きます。(C)透明化液で処理したサンプル(点線の枠線)を枠内に置き、カバーガラスで覆う。スケール バー: 5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。