التطهير البصري للأنسجة النباتية للتصوير الفلوري
Summary
هنا ، يتم وصف طريقة لجعل الأنسجة النباتية شفافة مع الحفاظ على استقرار البروتينات الفلورية. تسهل هذه التقنية التصوير العميق للأنسجة النباتية التي تم تطهيرها دون تقسيم مادي.
Abstract
من الصعب مراقبة البنية الداخلية للعينات النباتية متعددة الطبقات وغير الشفافة مباشرة ، دون تشريح ، تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التألق الذاتي المنسوب إلى الكلوروفيل يعيق ملاحظة البروتينات الفلورية في النباتات. لفترة طويلة ، تم استخدام كواشف إزالة مختلفة لجعل النباتات شفافة. ومع ذلك ، فإن كواشف المقاصة التقليدية تقلل من إشارات الفلورسنت. لذلك ، لم يكن من الممكن مراقبة الهياكل الخلوية وداخل الخلايا مع البروتينات الفلورية. تم تطوير كواشف يمكنها تنظيف الأنسجة النباتية عن طريق إزالة الكلوروفيل مع الحفاظ على استقرار البروتين الفلوري. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا للتطهير البصري للأنسجة النباتية باستخدام كواشف التطهير أو ClearSee (CS) أو ClearSeeAlpha (CSA). يتضمن إعداد الأنسجة النباتية التي تم تطهيرها ثلاث خطوات: التثبيت والغسيل والتطهير. التثبيت هو خطوة حاسمة في الحفاظ على الهياكل الخلوية والاستقرار داخل الخلايا للبروتينات الفلورية. يعتمد وقت الحضانة للتطهير على نوع الأنسجة وأنواعها. في Arabidopsis thaliana ، كان الوقت اللازم للتطهير باستخدام CS هو 4 أيام للأوراق والجذور ، و 7 أيام للشتلات ، و 1 شهر للمدقات. تطلب CS أيضا وقتا قصيرا نسبيا قدره 4 أيام لجعل الأوراق الأمشاج من Physcomitrium patens شفافة. في المقابل ، أنتجت المدقات في التبغ والتورينيا صبغة بنية اللون بسبب الأكسدة أثناء معالجة CS. خفضت CSA الصبغة البنية عن طريق منع الأكسدة ويمكن أن تجعل التبغ ومدقات تورينيا شفافة ، على الرغم من أنها استغرقت وقتا طويلا نسبيا (1 أو 2 أشهر). كانت CS و CSA متوافقة أيضا مع التلطيخ باستخدام الأصباغ الكيميائية ، مثل DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) و Hoechst 33342 للحمض النووي و Calcofluor White ، SR2200 ، و Direct Red 23 لجدار الخلية. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة لتصوير النبات بأكمله للكشف عن المورفولوجيا السليمة ، والعمليات التنموية ، والتفاعلات بين النبات والميكروبات ، والتهابات الديدان الخيطية.
Introduction
يعد تصور الهياكل الخلوية وتوطين البروتينات في الكائنات الحية أمرا مهما لتوضيح وظائفها في الجسم الحي. ومع ذلك ، نظرا لأن الجسم الحي ليس شفافا ، فمن الصعب مراقبة البنية الداخلية للكائنات الحية دون تشريح. على وجه الخصوص ، في حالة الأنسجة النباتية ، التي هي متعددة الطبقات مع خلايا ذات أشكال مختلفة ، فإن عدم تطابق المؤشر الناجم عن هيكلها ووجود أصباغ تمتص الضوء يمثل مشكلة. على سبيل المثال، تحتوي أوراق النباتات على بنية معقدة تسمح لها باستخدام الضوء الذي يدخل أجسامها بكفاءة لعملية التمثيل الضوئي1، في حين أن البنية تسبب أيضا عدم تطابق معامل الانكسار، مما يجعل من الصعب ملاحظتها. ومع ذلك ، تحتوي الأوراق على العديد من الأصباغ الممتصة للضوء ، مثل الكلوروفيل ، الذي ينبعث منه تألق أحمر قوي ويتم إنتاج أصباغ بنية اللون عن طريق الأكسدة2,3. هذه الأصباغ تعيق أيضا ملاحظات المجهر الفلوري الكامل في النباتات. لذلك ، لمراقبة البنية الداخلية للنباتات ، تم استخدام إزالة اللون والتثبيت بواسطة الكحول وإزالة الهيدرات باستخدام هيدرات الكلورال لفترة طويلة للقضاء على عدم تطابق مؤشر الانكسار والتألق الذاتي4,5. تم اعتماد هذه الطرق التقليدية لسنوات عديدة ، ولكن لها عيب في القضاء على تألق البروتينات الفلورية في نفس الوقت6,7. هذا يمثل مشكلة لأن البروتينات الفلورية أصبحت لا غنى عنها في التصوير الفلوري الحالي.
لذلك ، تم تطوير ClearSee (CS) و ClearSeeAlpha (CSA) ككواشف مسح بصري للأنسجة النباتية. يقلل كلا الكواشف من التألق الذاتي للكلوروفيل مع الحفاظ على استقرار البروتينات الفلورية7,8. CSA مفيد بشكل خاص عندما يتم إنتاج أصباغ بنية بسبب أكسدة الأنسجة. باستخدام كواشف المقاصة هذه ، من الممكن مراقبة البنية الخلوية وتوطين البروتين داخل جسم النبات دون تقسيم مادي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتكون هذه الطريقة من التثبيت والغسيل والتنظيف. التثبيت هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. إذا لم يتم ملاحظة البروتين الفلوري بعد تثبيت PFA ، فلن يتم ملاحظته بعد العلاج بمحلول المقاصة. يعد تغلغل محلول PFA في الأنسجة أمرا بالغ الأهمية ، ولكن لا ينصح بالعلاج بالتفريغ العالي لأنه يمكن أن يدمر بنية الخلية. يجب تحسين ظروف الفراغ وفترات التثبيت لكل نوع من الأنسجة والأنواع. يوصى بفحص البروتينات الفلورية حتى بعد التثبيت. على الرغم من أن العينات كانت ثابتة عادة لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، إلا أنه يمكن تثبيتها عند 4 درجات مئوية لفترة أطول (بين عشية وضحاها أو أكثر).
كما هو موضح في الشكل 6A ، كان لبعض ديوكسيكولات الصوديوم لون أصفر شاحب عند إذابتها. أظهرت محاليل ديوكسيكولات الصوديوم هذه تألقا ذاتيا قويا في منطقة 400-600 نانومتر بعد الإثارة عند 380 نانومتر (الشكل 6B). يمنع هذا التألق الذاتي التطهير البصري والتصوير الفلوري. يجب على المستخدمين التحقق من لون محلول ديوكسيكولات الصوديوم لأن جودة الكاشف قد تختلف بسبب النقاء أو الاختلاف من الكثير إلى الكثير أو لأسباب أخرى.
تحتوي محاليل المقاصة المستخدمة هنا على تركيزات عالية من ديوكسيكولات الصوديوم ، والتي يمكن أن تدمر بنية الغشاء. لوحظت علامة غشاء البلازما (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) حتى بعد علاج CS7. ومع ذلك ، قد يكون من الأفضل تقليل تركيز ديوكسيكولات الصوديوم ، اعتمادا على البنية والأنسجة ذات الاهتمام. في الواقع ، تم الحصول على صور ذات وضوح محسن لمدقات أرابيدوبسيس مع CS المعدل ، حيث يتم تقليل تركيز ديوكسيكولات الصوديوم بمقدار النصف. ومع ذلك ، فإن انخفاض تركيزات ديوكسيكولات الصوديوم يتطلب أوقات علاج طويلة (على سبيل المثال ، 1 شهر لمدقات أرابيدوبسيس ).
يمكن أن يقلل CS من التألق الذاتي الأحمر (>610 نانومتر) لإزالة الكلوروفيل في العينات المعالجة. ومع ذلك، ظل التألق الذاتي لنطاق 500-600 نانومتر (الأصفر إلى البرتقالي) حتى في العينات المعالجة ب CS7. ويعتقد أن هذا التألق الذاتي مشتق من جدار الخلية والمكونات الخلوية الأخرى، مثل اللجنين12،13. لذلك ، من الصعب جعل الأنسجة ، مثل السيقان ذات الجدران الثانوية المتقدمة ، شفافة تماما عن طريق علاج CS.
تم تطوير العديد من كواشف المقاصة إلى جانب تلك المستخدمة هنا لمراقبة البروتينات الفلورية في النباتات باستخدام المجهر الفلوري 14،15،16،17. بالمقارنة مع هذه الطرق ، يزيل CS و CSA الكلوروفيل ويقللان من التألق الذاتي ، مما يجعل الأنسجة النباتية أكثر شفافية. في الآونة الأخيرة ، طور Sakamoto et al. طريقة محسنة ، iTOMEI ، للتثبيت ، وإزالة المنظفات ، والتركيب لضبط عدم تطابق معامل الانكسار18. في شتلات أرابيدوبسيس ، قام iTOMEI بتطهير الأنسجة في غضون 26 ساعة.
ينطبق CS على مجموعة واسعة من الأنواع النباتية ، مثل Arabidopsis thaliana و Physcomitrium patens7 و Chrysanthemum morifolium و Cucumis sativus و Nicotiana benthamiana و Nicotiana tabacum و Torenia fournieri8 و Allium ochotense19 و Astragalus sinicus20 و avocado21 و barley22 و Brassica rapa23 و Callitriche 24 ، الأوكالبتوس25 ، الذرة 26 ، مارشانتيا متعددة الأشكال 27 ، مونوفيلايا غلابرا 28 ، أوروبانش الصغرى 29 ، البطونية 30 ، الأرز 31 ، سولانوم ليكوبيرسيكوم 32 ، فول الصويا 33 ، الفراولة 34 ، القمح 35 ، وولفييلا هيالينا 36. بالنسبة للأنسجة الأكثر سمكا ، يمكن ل CS أيضا جعل أقسام الاهتزاز شفافة37,38. سمحت هذه الطريقة بإجراء دراسات على البنية الخلوية وأنماط التعبير الجيني في النباتات37,38. علاوة على ذلك ، لوحظت أيضا عدوى الديدان الخيطية20,39 ، والالتهابات الفطرية ، والتكافل 19,40,41 في أعماق الأنسجة المعالجة ب CS. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة مفيدة لتصوير الأنسجة الكاملة من المقاييس الدقيقة إلى الكلية ويمكن أن تساعد في اكتشاف تفاعلات جديدة بين مختلف الخلايا والأنسجة والأعضاء والكائنات الحية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (منحة في المعونة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة (JP16H06464 ، JP16H06280 إلى T.H.) ، منحة في المعونة للبحث العلمي (B ، JP17H03697 إلى D.K.) ، منحة في المعونة للبحوث الاستكشافية الصعبة (JP18K19331 إلى D.K.) ، منحة في المعونة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة (JP20H05358 ل D.K.)) والوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (برنامج PRESTO (JPMJPR15QC إلى Y.M.، JPMJPR18K4 إلى D.K.)). يشكر المؤلفون مركز التصوير الحي في معهد الجزيئات الحيوية التحويلية (WPI-ITbM) بجامعة ناغويا لدعم الدراسات المجهرية والتحرير (www.editage.com) لتحرير اللغة الإنجليزية.
Materials
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
| ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
| Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
| Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
| Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
| Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
| Needle | TERUMO | NN-2238S | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
| Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
| Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
| Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
| Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
| Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Vogelmann, T. C. Light within the plant. Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).
- Krause, G. H., Weis, E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).
- Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).
- Lersten, N. R. An annotated bibliography of botanical clearing methods. Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).
- Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications. Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy. Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).
- Vijayan, A., et al. A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule. eLife. 10, 1-38 (2021).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Research Square. , (2021).
- Tanaka, E., Ono, Y. Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation. Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).
- Ohtsu, M., et al. Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines. Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).
- Duman, Z., et al. Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock. Plants. 9 (11), 1481 (2020).
- Ho, W. W. H., et al. Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms. Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).
- Arsovski, A. A., et al. BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves. bioRxiv. , (2020).
- Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).
- Eliyahu, A., et al. Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation. Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).
- Kelliher, T., et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature. 542, 105-109 (2017).
- Aki, S. S., et al. Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha. Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).
- Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization. Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).
- Okazawa, A., et al. Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor. bioRxiv. , 448768 (2021).
- Chen, M., et al. VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida. New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11, 23 (2018).
- Alaguero-Cordovilla, A., et al. An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants. Plant, Cell & Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).
- Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein. The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).
- Kim, D. -. R., et al. A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees. Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).
- Wu, J., Mock, H. -. P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., Mühling, K. H. Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants. Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).
- Isoda, M., Oyama, T. Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level. Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).
- Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis. Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).
- Shwartz, I., et al. The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing. bioRxiv. , (2021).
- Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat. Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).
- Nouri, E., et al. Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling. Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).
- Evangelisti, E., et al. Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots. bioRxiv. , 434067 (2021).
