部署社区科学家对稀有蝴蝶种群进行无损基因采样

1. 向社区科学家分发用品 通过查阅完整的 材料表，仔细查看并收集所需的与收藏相关的用品的完整清单。 如果样本采集将在多个地点和/或由多个个人/团队进行，请将所需的所有物资收集并组织到单独的可部署单位中（图1 和 图2）。 向社区科学家或其他负责实地收集的人员运送物资（可部署单位）。 如果人员不是本地人，请小心地将用品（每个可部署单元）装入单独的纸板运输箱中，并带有完整的运输标签和运输。注意：此阶段不需要加急运输。 2. 社区科学家馆藏准备 收到收集用品（包括收集钩箱）后，请仔细查看层压供应清单并进行全面清点。如果缺少任何用品，请通知项目负责人。 用 180 μL 裂解缓冲液预填充 1.5 mL 微量离心管，在每个微量离心管上贴上带有预印唯一 ID 标签的标签，并将所有试管放入 64 孔微量离心管储存盒中。装入后牢固盖紧盖子。注意：如果没有标签打印机，请使用防乙醇标记在每个小瓶的侧面和盖子上应用唯一的ID号。 确保所有数字设备（例如智能手机或相机）都已充满电，并已包装所有备用电池。 在小型冷却器中部分装满冰块，用于现场储存和收集样品的本地运输。 将所有收集用品装入收集钩箱或类似坚固、防风雨的容器中，以便安全运输和合并存储。 在进入现场之前，请详细查看无损遗传样本收集方案。注意：使用层压和压缩的图示方案在现场获得其他指导（补充图S1 和 补充图S2）。 3. 现场样品采集 到达现场后，使用铅笔或全天候笔在防风雨现场笔记本中记录一天中的时间、日期、整体财产名称（例如，阿巴拉契科拉国家森林）、特定的现场位置名称或描述和 GPS 读数（如果有），以及所有在场人员的全名和角色。 找到一个合适的栖息地，存在目标蝴蝶特有的幼虫宿主植物物种。注意：要小心避免或尽量减少对敏感栖息地、植物种群和野生动物的影响。此外，在访问站点和样本收集事件之前，请务必获得所有适当的土地所有者权限和/或许可。 使用智能手机或相机拍摄所有现场、样品采集位置、寄主植物以及可能与项目相关的任何其他信息的详细照片。使用智能手机或其他记录GPS坐标的相机。注意：所有智能手机都需要启用照片地理标记。 全面搜索所有幼虫寄主植物部分，如叶子、花蕾、花朵或发育中的果实，已知是通过产卵（产卵）成年雌蝶选择孵化卵的。对于大多数Lycaenidae，寻找白色的孵化卵，中心有一个明显的孔，类似于甜甜圈，新生幼虫从中出现（图3）。寻找颜色较深的未孵化卵，通常是绿色或蓝色，并且将完全完好无损，中间没有孔（图4）。使用手持镜头或其他放大设备仔细检查每个鸡蛋。 找到孵化的鸡蛋后，将丁腈手套戴在双手上。 使用干净、无菌、尖锐的镊子，抓住并轻轻地将孵化的鸡蛋从寄主植物上拉出，并将其直接放入预先填充有从 64 孔储存盒中提取的裂解缓冲液的标记微量离心管中。注意：一些寄主植物残留材料（直径小于15毫米）在收集过程中是可以接受和正常的。 每个寄主植物斑块/地点至少收集5个样本（每个样本包含1-20个孵化卵），目标是在一个位置总共>50个卵（如果有的话）。注意：这将有助于确保在每个样品植物/贴片中至少收集一些组织，并增加检测DNA的机会（个人观察）。 每次收集鸡蛋后，仔细清洁镊子尖端，将它们浸入 95% 乙醇的小瓶中，或从挤压瓶中浸入 95% 乙醇或使用酒精湿巾。注意：这将有助于最大限度地减少采样事件之间的组织残留。 如果有条件，将来自同一宿主斑块中多个植物的几个孵化卵（1-20 个卵）收集到单个微量离心管中并牢固地盖上盖子。对于使用较大草本或木本寄主物种的蝴蝶物种，如果宿主斑块有限，则从同一植物的不同位置收集多个卵。注意：如果植物的叶子相互接触，则植物位于同一宿主补丁中。如果植物或斑块之间存在明显的物理分离，则应将其视为不同的样本。如果收集另一种组织类型，例如幼虫外露或单条腿，请仅将一条腿、腿碎片或幼虫外分泌物放入微量离心管中（每人一个样本）。 确保所有收集的材料完全浸没在每个 1.5 mL 微量离心管内的裂解缓冲液中。如果需要，在坚硬的表面上敲击有问题的试管底部以重新浸没任何样品。 用干净的一次性实验室湿巾擦拭镊子晾干。注意：仔细清洁镊子对于避免样品之间的交叉污染至关重要。 收集新样品时，丢弃用过的丁腈手套，并用干净的手套替换它们。 在防风雨的野外笔记本中，使用铅笔或全天候笔记录从微量离心管分配的唯一 ID 标签以及样品类型（例如，卵、幼虫外露或腿）、孵化卵的大致数量以及收集信息，例如收集器名称、日期、位置、寄主植物物种和任何其他注释（图 2）。 将装有蛋渣样品的封闭微量离心管放回64孔微量离心机储存盒中。 在现场时，将 64 孔微量离心机储存盒保持在带冰的冷却器中。 在现场时，将所有其他收集用品保存在收集钩箱中，以便在站点之间安全、统一地存储和运输。 4. 字段收集完成时 确保所有含有样品的微量离心管都放在装有冰的冷却器的 64 孔微量离心机储存盒中，以便运输。 将所有现场收集用品放回收集铲斗箱中。 将所有样品运回办公室或实验室，并仔细仔细检查每个微量离心管，以确保所有样品材料完全浸没在裂解缓冲液中。 将装有样品的64孔微量离心机储存盒放入冰箱中，直到装运或处理。注意：-18°C的平均商用冰箱可以接受短期储存。 仔细评估收集工具箱中的所有耗材，并根据需要更换任何耗材。注意：如果计划了多个字段收集事件，这一点尤其重要。 将收集处理箱存放在安全的位置，直到下一次现场收集事件。 下载所有数字映像，并确保所有数字映像都安全地备份在服务器或基于云的存储系统上。 扫描或拍摄包含采集数据的原始防风雨、现场笔记本页面或现场数据表，直到所有信息都可以输入到项目电子表格或数据库中。 5. 提交样本和数据 从冰箱中取出所有装有样品的64孔微量离心机储存盒。 将装有样品和现场笔记本或现场数据表的 64 孔微量离心机储存盒小心地包装在标准运输箱中，将提供的运输标签附上原始发件人的帐号，并通过快递公司保证隔夜次日交付给项目总监。 通过电子邮件将包裹跟踪号和扫描的笔记本页面或现场数据表的副本发送给项目主管。 6. 脱氧核糖核酸提取 收到64孔微量离心机储存盒后，将其储存在-20°C以保存样品中的DNA，直到准备好进行DNA提取。 在实验室中，通过研磨从-20°C解冻后储存在裂解缓冲液中的昆虫组织来提取DNA。 加入20μL蛋白酶K，让样品在56°C下在加热的培养箱中浸泡不超过24小时。 根据特定制造商的建议添加适当的清洁和洗涤缓冲液13。 将悬浮在缓冲液中的样品转移到连接到 2 mL 收集瓶的离心柱中。 使用离心机以 6，021 × g 旋转 60 秒。加入适当的洗涤缓冲液并适当地向下旋转。 使用游脱缓冲液 （30 μL） 释放结合的 DNA，并将样品离心到新鲜的 1.5 mL 微量离心管中。储存在-20°C。注意：如果DNA浓度超过0.010 ng / mL，请继续测序。按组织类型划分的DNA浓度见 图5 。 7. DNA序列的数据分析 在生成的序列中修剪或编辑低质量的基本调用。 根据公共数据库查询序列以确认物种识别。 将序列相互对齐，以比较个体之间的差异。