Быстрое пятно Гольджи для визуализации дендритного позвоночника в гиппокампе и префронтальной коре
Summary
Протокол описывает модификацию быстрого метода Гольджи, который может быть адаптирован к любой части нервной системы, для окрашивания нейронов в гиппокампе и медиальной префронтальной коре крысы.
Abstract
Пропитка Гольджи с использованием набора окрашивания Гольджи с незначительными адаптациями используется для пропитки дендритных шипов в гиппокампе крыс и медиальной префронтальной коре. Этот метод является заметным улучшением по сравнению с предыдущими методами пропитки Гольджи, потому что предварительно смешанные химические вещества безопаснее в использовании, нейроны последовательно хорошо пропитываются, существует гораздо меньше фонового мусора, а для данной области существуют чрезвычайно небольшие отклонения в плотности позвоночника между экспериментами. Более того, мозг может накапливаться после определенного момента и храниться замороженным до дальнейшей обработки. С помощью этого метода можно изучить любую область мозга, представляющую интерес. После окрашивания и проскальзывания покрытия плотность дендритного позвоночника определяется путем подсчета количества шипов на длину дендрита и выражается в виде плотности позвоночника на 10 мкм дендрита.
Introduction
Метод использования дихромата калия и нитрата серебра для маркировки нейронов был впервые описан Камилло Гольджи 1,2 и впоследствии использован Сантьяго Рамоном-и-Кахалем для получения огромного объема работы, дифференцирующей нейронные и глиальные подтипы. Недавно опубликованная книга с его иллюстрациями теперь доступна3. После исследований Рамона-и-Кахала, которые были опубликованы более 100 лет назад, было использовано очень мало пропитки Гольджи. Пропитка Гольджи – это трудоемкий процесс, позволяющий осуществлять трехмерную визуализацию нейронов с помощью светового микроскопа. На протяжении многих лет было проведено множество модификаций метода Гольджи, чтобы сделать метод проще, а окрашивание более последовательным4. В 1984 году Габботт и Somogyi5 описали процедуру пропитки Гольджи с одним участком, которая позволила ускорить обработку. Этот метод пропитки Гольджи требует перфузии 4% параформальдегида и 1,5% пикриновой кислоты, постфиксации с последующим разделением вибратома в ванну с 3% дихромата калия. Секции крепятся на стеклянные горки, четыре угла обшивки приклеиваются так, чтобы при погружении в нитрат серебра диффузия происходила постепенно. Затем крышки отрываются, секции обезвоживаются, и в конечном итоге крышка постоянно скользит с монтажной средой. Этот метод был успешно использован для маркировки нейронов и глии 6,7,8 в гиппокампе. Быстрый метод Гольджи, описанный здесь, является улучшением, потому что существует гораздо меньшее воздействие как дихромата калия, так и нитрата серебра, и не используются параформальдегид и пикриновая кислота. Кроме того, хотя клетки, которые были пропитаны с использованием модификаций метода Габботта и Сомогьи5, могли быть проанализированы, часто участки подвергались чрезмерному или недостаточному воздействию или падали с слайдов на стадии обезвоживания, и, как правило, несколько экспериментов должны были быть объединены, чтобы иметь достаточное количество клеток для анализа.
Настоящий протокол описывает использование набора окрашивания Гольджи (см. Таблицу материалов) для маркировки дендритов и дендритных шипов в гиппокампе и медиальной префронтальной коре (mPFC) крысы. Преимущества этого метода перед предыдущими заключаются в том, что он быстрый, для исследователя меньше воздействия вредных химических веществ и происходит последовательное окрашивание нейронов. Протокол, описанный ниже, использовался с незначительными изменениями для оценки плотности дендритного позвоночника в гиппокампе и mPFC крысы во многих исследованиях 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает метод пропитки Гольджи, позволяющий быстро одновременно обрабатывать многие срезы. Это улучшение по сравнению с ранее описанными5 более трудоемкими методами и последовательно дает пропитанные нейроны для анализа. Кроме того, существует мень?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Исследовательской инициативой студентов Университета Святого СердцаGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
