Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal
Summary
O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.
Abstract
A impregnação de Golgi, utilizando o kit de coloração golgi com pequenas adaptações, é usada para impregnar espinhas dendríticas no hipocampo de ratos e córtex pré-frontal medial. Esta técnica é uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores de impregnação de Golgi porque os produtos químicos pré-selecionados são mais seguros de usar, os neurônios são consistentemente bem impregnados, há muito menos detritos de fundo, e para uma determinada região, há desvios extremamente pequenos na densidade da coluna vertebral entre experimentos. Além disso, os cérebros podem ser acumulados após um certo ponto e mantidos congelados até um processamento mais aprofundado. Usando este método qualquer região de interesse cerebral pode ser estudada. Uma vez manchada e coberta escorregada, a densidade da coluna vertebral dendrítica é determinada contando o número de espinhas para um comprimento de dendrito e expressa como densidade da coluna vertebral por dendrito de 10 μm.
Introduction
O método de uso de dicromato de potássio e nitrato de prata para rotular neurônios foi descrito pela primeira vez por Camillo Golgi 1,2 e posteriormente usado por Santiago Ramon y Cajal para produzir um imenso corpo de trabalho diferenciando subtipos neuronais e gliais. Um livro recentemente publicado com suas ilustrações está agora disponível3. Após os estudos de Ramon e Cajal, publicados há mais de 100 anos, pouco golgi impregnação foi utilizada. A impregnação de Golgi é um processo trabalhoso que permite a visualização tridimensional de neurônios com um microscópio leve. Houve inúmeras modificações do método Golgi ao longo dos anos para facilitar o método e a coloração mais consistente4. Em 1984, Gabbott e Somogyi5 descreveram o procedimento de impregnação da seção única golgi que permitiu um processamento mais rápido. Este método de impregnação golgi requer perfusão com 4% de paraformaldeído e 1,5% de ácido picrico, pós-fixação seguida de vibratome seção em um banho de 3% de dicroma de potássio. As seções são montadas em lâminas de vidro, os quatro cantos de tampas colados de modo que, quando imersos em nitrato de prata, a difusão é gradual. As manchas são então retiradas, as seções são desidratadas e, eventualmente, cobrem o deslizamento permanentemente com o meio de montagem. Esta técnica foi usada com sucesso para rotular neurônios e glia 6,7,8 no hipocampo. O método golgi rápido descrito aqui é uma melhoria porque há muito menos exposição tanto ao dicromato de potássio quanto ao nitrato de prata e não são utilizados paraformaldeído e ácido picrico. Além disso, embora as células que foram impregnadas usando modificações do método Gabbott e Somogyi5 pudessem ser analisadas, muitas vezes as seções estavam sobreexe ou sub-expostas ou caíram dos slides durante a etapa de desidratação e, geralmente, vários experimentos tinham que ser agrupados para ter células suficientes para análise.
O presente protocolo descreve o uso do kit de coloração golgi (ver Tabela de materiais) para rotular dendritos e colunas dendríticas no hipocampo e córtex pré-frontal medial (mPFC) do rato. As vantagens desse método em relação aos anteriores são que ele é rápido, há menos exposição a produtos químicos nocivos para o pesquisador e há uma coloração consistente de neurônios. O protocolo descrito abaixo tem sido usado com pequenas modificações para avaliar a densidade da coluna vertebral dendrítica no hipocampo e mPFC do rato em muitos estudos 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo descreve um método de impregnação de Golgi que permite o processamento simultâneo rápido de muitas seções. É uma melhoria em relação aos5 métodos mais intensivos em mão-de-obra e produz consistentemente neurônios impregnados para análise. Além disso, há menos exposição a produtos químicos tóxicos usados na impregnação de Golgi. A parte mais desafiadora do processo é fazer com que as seções sejam planas nos slides, o que requer uma prática consideráve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
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