כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית
Summary
הפרוטוקול מתאר שינוי של שיטת גולגי המהירה, אשר ניתן להתאים לכל חלק של מערכת העצבים, עבור הכתמת נוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם מצחית המדיאלית של החולדה.
Abstract
ספיגת גולגי, באמצעות ערכת הכתמת גולגי עם התאמות קלות, משמשת להפריית קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס החולדה ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. טכניקה זו היא שיפור ניכר לעומת שיטות קודמות של הספגת גולגי מכיוון שהכימיקלים המעורבים מראש בטוחים יותר לשימוש, נוירונים ספוגים היטב בעקביות, יש הרבה פחות פסולת רקע, ועבור אזור נתון, יש סטיות קטנות מאוד בצפיפות עמוד השדרה בין ניסויים. יתר על כן, המוח יכול להצטבר לאחר נקודה מסוימת ולשמור קפוא עד עיבוד נוסף. באמצעות שיטה זו ניתן ללמוד כל אזור מעניין במוח. לאחר מוכתם וכיסוי החליק, צפיפות עמוד השדרה דנדריטי נקבע על ידי ספירת מספר קוצים לאורך דנדריט מבוטא כמו צפיפות עמוד השדרה לכל 10 מיקרומטר דנדריט.
Introduction
השיטה של שימוש באשלגן דיכרומט וכסף חנקתי לתיוג נוירונים תוארה לראשונה על ידי קמילו גולגי 1,2 ולאחר מכן שימשה את סנטיאגו רמון y Cajal כדי לייצר גוף עצום של עבודה המבדילה תת-סוגים עצביים וגליאליים. ספר שפורסם לאחרונה עם האיורים שלו זמין כעת3. בעקבות מחקריו של רמון y Cajal, אשר פורסמו לפני יותר מ -100 שנה, מעט מאוד ספיגה גולגי שימש. הספגת גולגי היא תהליך מייגע המאפשר הדמיה תלת ממדית של נוירונים עם מיקרוסקופ אור. היו שינויים רבים בשיטת Golgi לאורך השנים כדי להפוך את השיטה לקלה יותר ואת הכתמים עקביים יותר4. בשנת 1984, Gabbott ו Somogyi5 תיארו את הליך ההספגה גולגי סעיף אחד שאיפשר עיבוד מהיר יותר. שיטת הספגה גולגי זו דורשת זלוף עם 4% paraformaldehyde ו 1.5% חומצה picric, לאחר קיבוע ואחריו חלוקת ויברטום לתוך אמבטיה של 3% אשלגן dichromate. חלקים רכובים על מגלשות זכוכית, ארבע פינות הכיסוי מודבקות כך שכאשר שקועים בכסף חנקתי, הדיפוזיה הדרגתית. לאחר מכן מכסים נפתחים, חלקים מיובשים, ובסופו של דבר מכסים החליק לצמיתות עם מדיום הרכבה. טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי לתייג נוירונים גליה 6,7,8 בהיפוקמפוס. שיטת גולגי המהירה המתוארת כאן היא שיפור מכיוון שיש הרבה פחות חשיפה הן אשלגן דיכרומט והן חנקתי כסף ולא נעשה שימוש בפרפורמלדהיד וחומצה פיקרית. בנוסף, למרות תאים שהיו ספוגים באמצעות שינויים של שיטת Gabbott ו Somogyi5 ניתן לנתח, לעתים קרובות החלקים היו חשופים יתר על המידה או מתחת או נפלו מהשקופיות במהלך שלב ההתייבשות ובאופן כללי, כמה ניסויים היו צריכים להיות משולבים יש מספיק תאים לניתוח.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בערכת הכתמה של גולגי (ראה טבלת חומרים) לתיוג דנדריטים וקוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) של החולדה. היתרונות של שיטה זו על פני קודמים הם שזה מהיר, יש פחות חשיפה לכימיקלים רעילים עבור החוקר ויש כתמים עקביים של נוירונים. הפרוטוקול המתואר להלן שימש עם שינויים קלים כדי להעריך את צפיפות עמוד השדרה דנדריטי בהיפוקמפוס ו- mPFC של החולדה במחקרים רבים 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הספגת גולגי המאפשרת עיבוד סימולטני מהיר של חלקים רבים. זהו שיפור לעומתשתוארו בעבר 5 שיטות עתירות עבודה יותר, בעקביות מניב נוירונים ספוגים לניתוח. בנוסף, יש פחות חשיפה לכימיקלים רעילים המשמשים בהספגת גולגי. החלק המאתגר ביותר של התהליך הוא מקבל את ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת הלב הקדוש יוזמת מחקר לתואר ראשוןGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
