使用荧光团辅助碳水化合物电泳（FACE）方法测定糖原的葡聚糖链长分布

糖原平均链长的测定图2 表示推断糖原的链长分布和平均链长（ACL）所需的工作流程。 图 2：确定链长分布 （CLD） 和平均链长的过程。请单击此处查看此图的放大版本。 图3 显示了商用麦芽六糖和去支链牛肝糖原的电泳图。在所有实验中观察到的荧光信号在4.13-4.67分钟之间来自未反应的APTS。标记麦芽六糖（DP6）的洗脱时间估计为8.49分钟（图3A）。根据DP6的洗脱时间鉴定出牛糖原的APTS标记葡聚糖（图3B）。在对照样品中未检测到微量游离麦芽低聚糖（未与去分枝酶一起孵育的糖原）（图3C）。 图3：标准品和牛肝糖原的电泳图 （A）以葡聚糖标准品麦芽六糖（DP6）的时间洗脱（8.49分钟）作为参考，以确定APTS标记葡聚糖在去分枝酶活性作用后从牛肝糖原释放的聚合度（DP）).插图显示了高达44 DP的葡聚糖链的分离。同时，用APTS标记未经处理的牛糖原，以检测样品（C）中可能存在的游离麦芽低聚糖痕迹。 请点击此处查看此图的大图。 可以得出结论，APTS标记的葡聚糖的释放是由于异淀粉酶和拉鲁淀粉酶活性对分支点的裂解。应该注意的是，毛细管电泳曲线可以以更合适的格式重绘，以创建包含多个轮廓的镶嵌图。为此，使用“asc”扩展名生成包含荧光值的数据文件，并通过选择CSV（逗号分隔值）格式在电子表格程序中打开。不幸的是，导出的荧光值与相应的洗脱时间无关。因此，必须根据FACE设备上的采集频率设置手动添加它们（4 Hz表示每0.25秒采集一次值）。 然后使用FACE仪器的本机应用程序推断峰值面积，或导出为扩展名为“cdf”的数据文件以使用另一个应用程序。面积值在电子表格程序中导出，并通过将DP表示为总表面积的百分比进行归一化（图4）。 图 4：数据归一化、链长分布和平均链长值。 在电子表格中导入荧光峰区域并归一化。链长分布显示为每个 DP 的 DP 百分比。平均链长（ACL）是通过对每个百分比链乘以相应的聚合度来计算的。 请点击此处查看此图的大图。 最后，通过计算每个百分比链的总和乘以相应的聚合度来推断平均链长（ACL）。对兔肝糖原（图5A），牛肝糖原（图5B）和牡蛎糖原（图5C）进行了一式三份的实验。 图5：商业糖原的链长分布。 兔肝（A），牛肝（B）和牡蛎糖原（C）在去分枝酶（异淀粉酶和支链淀粉酶）存在下孵育。然后使用FACE分析根据其聚合度（DP）分离APTS标记的葡聚糖。麦芽糖（DP2），麦芽六糖（DP6）麦芽七糖（DP7）分别是兔肝，牡蛎和牛肝糖原中最丰富的葡聚糖。均值标准误（SEM）是从三个独立实验中推断出来的。 请点击此处查看此图的大图。 兔肝糖原链长分布明显显示出低麦芽低聚糖短糖（DP2）含量高于牛肝糖原（DP7）或牡蛎糖原（DP6）。因此，与牛肝糖原（ACL = 11.9）和牡蛎糖原（ACL = 12.6）相比，兔肝糖原的平均链长（ACL = 9.8）最低。需要注意的是，这些商业糖原通常用于测定糖原磷酸化酶或糖原合酶活性。这表明糖原代谢酶活性的动力学参数（Vmax 和Km）的测定将根据糖原的来源而变化。 减法分析减法分析是比较两个样品的葡聚糖链分布的简单方法。例如，测定了由野生型（WT）集胞藻PCC6803菌株和单一等基因glgaA1和glgaA2突变株产生的糖原CLD（图6A）。 图6：使用减法分析比较链长分布。 （A）从蓝藻菌株纯化的糖原的链长分布：野生型（WT） 集胞藻 PCC6803和单等基因 glgaA1 和 glgaA2 突变株使用FACE分析测定。均值标准误（SEM）是从三个独立实验中推断出来的。（B）减法分析是通过将WT的每个DP的%减去 ΔglgA1 的每个DP的%，并将WT的每个DP的%减去DP ΔglgA2的每个DP的%来执行减法分析。这种简单的数学操作显示了突变菌株（黑线）中葡聚糖链的改变。（C）根据观察到的每个CLD的最大峰（所有样品均为DP6），对来自 火连囊虫 野生型和突变体的糖原的平均链长分布进行归一化。通过在对数尺度（Nde （DP））上绘制归一化CLD来证明两个分量。每个组件都表示不同的生长停止机制（有关更多信息，请参阅参考文献2）。 请点击此处查看此图的大图。 回想一下，大多数蓝藻菌株具有两个编码糖原合酶活性的基因：GlgA1和GlgaA221。两种酶都将ADP-葡萄糖的残基葡萄糖转移到线性葡聚糖链的非还原末端。如图 6A所示，仅通过查看链长分布曲线来比较样品具有挑战性。减法分析包括减去样品之间每个DP的百分比（图6B）。对WT的%DP减去DP ΔglgA1 突变体的%的减法分析显示DP3，4和5（负值）过量，DP 10-20的含量降低。相比之下，WT的%DP和DP ΔglgA2 突变体%之间的减法分析表明具有相反的效果。由于GlgaA1和GlgaA2之间的减法分析谱不同，这表明每种糖原合成酶亚型在糖原生物合成21中的特定功能。 重要的是要注意，减法分析仅适用于涉及与样品并行执行的参考样品的实验。否则，减法分析可以是经验性的，因为它位于参考的归一化CLD上。2015年，Deng和合作者研究了小鼠和人类糖原生长的停止机制，提出了一种替代绘制和解释糖原CLDs来解决这个问题。此图使用最大峰面积对每个 CLD 进行归一化。然后以对数刻度绘制数据，突出显示两个分量。后者说明了链伸长停止2的两种不同机制。通过绘制拟合到较高DP分量的线，绝对参数（即线的斜率和截距）可用于CLD比较，而无需归一化到参考轮廓。在对数尺度上绘制野生型（WT）集胞藻PCC6803菌株的CLD和单个等基因glgaA1和glgaA2突变体，并确定每个谱的拟合线（图6C）。第一种组分在样品之间高度相似，在DP 6处达到最大值。这说明支化酶明确地产生最大这样的链。第二种成分表现为宽肩，已经为小鼠和人类糖原2进行了描述。在Δ glgA1中，第二组分的倾角在较高的DP处出现，并且相应拟合线（红线）的斜率低于野生型剖面。因此，GlgA1的缺乏减缓了生物合成过程中链伸长的停滞，这是由小鼠和人糖原2的空间位阻发生的。这些数据表明，剩余的伸长酶（即GlgaA2）在链拥挤之前产生更长的链。在ΔglgA2中，观察到相反的效应，拟合线的下降幅度更大，证实了剩余的GlgaA1产生的链总体上比GlgaA2在空间位阻之前单独合成的链短。该分析表明，两种亚型都具有不同的动力学和/或它们各自与分支酶活性的协同作用不同。