in vitroで薬物誘発性肝毒性を評価するためのヒト肝臓微小生理学的システム

すべての作業は、厳格な健康と安全の手順に従って、独自のラボのリスク評価とSOPに従ってラボで実施されました。使用されるすべての機器は、製造元のガイドラインに従って整備されます。微生物学的安全キャビネット(MBSC)は毎年整備され、Ki-Discus(ヨウ化カリウム)は英国規格に準拠してテストされています。このプロトコルは、英国ヒト組織局(HTA)の行動規範および指令に従い、インフォームドコンセント(45 CFR§46.116および§46.117)およびグッドクリニカルプラクティス(GLP)、(ICH E6)、および規制および倫理委員会の一般要件に完全に準拠するベンダーが提供する倫理的に調達された初代ヒト細胞を使用します。 1. 細胞培養培地の調製 注:-1日目にシードアドバンストDMEM培地を準備し、4°Cで保存します。 メンテナンスアドバンストDMEM培地を1日目に調製し、4°Cで最大1週間保存します。 PHHおよびHKCの共存培養用のアドバンストDMEM培地の播種:500 mLのアドバンストDMEM培地(材料表)1本にカクテルA18 mL(最終濃度3.6%)と25 mLのFBS(最終濃度5%)を補充します。 PHHおよびHKCの共培養用のメンテナンスアドバンストDMEM培地:500 mLアドバンストDMEM培地(材料表)のボトル1本に、カクテルB20 mL(最終濃度4%)と500 nMヒドロコルチゾンを補充します。注意: ヒドロコルチゾンは使用日に新鮮になり、ストック溶液と必要な希釈液の調製方法の手順を以下に示します。 メンテナンスアドバンストDMEM培地における500 nMヒドロコルチゾンの調製出発ストック溶液(20 mM)の調製:7.24 mgのヒドロコルチゾン(材料表)を1 mLのガラスバイアルに計量します。計量したヒドロコルチゾンの正確な量を記録し、次の計算を使用してジメチルスルホキシド(DMSO)の量を決定します。 作動用100 μMヒドロコルチゾンストック溶液の調製:開始20 mMストック溶液5 μLを995 μLのアドバンストDMEMに加えます。注:ステップ1のDMSO溶液25 μLを水または培地で希釈すると、DMSO濃度は0.5%になります。最終溶液では、DMSO濃度は0.0025%になります。この場合、5μLの追加容量は、総容量のわずかな変化をもたらす。 アドバンストDMEMでの作業用500 nMヒドロコルチゾン溶液の調製:アドバンストDMEMで1 mLの500 nMヒドロコルチゾン溶液を調製するには、100 μMヒドロコルチゾンのストック溶液5 μLをメンテナンスアドバンストDMEM培地995 μLに追加します。 2. MPSのセットアップとプライミング(-1日目) コントローラーを細胞培養インキュベーターのドッキングステーションハウスに接続し、新しい乾燥剤(材料表)がコントローラーの背面にある乾燥剤ジャーに追加されていることを確認します。注意: コントローラーユニットは、時間の経過とともにインキュベーターから水分を引き出し、新鮮な乾燥剤を使用して乾いた状態に保ちます。 後ろにあるボートロッカースイッチを押してコントローラー の電源を入れ 、システムが安定して圧力に達するまで5分間待ちます。次に、空気圧レポートの画面をチェックして、(i)圧力リザーバ出力が~2000mBarに達し、(ii)真空リザーバ出力が~850mBarに達したことを確認します。 各プレートをパッケージから取り出し、すべてのウェルを目視検査して、考えられる欠陥(足場の欠落、亀裂など)をチェックします。 ドライバー(プレートを付けた状態)をドッキングステーションに挿入して、ドライバーがドッキングステーションとコントローラーによって認識されていることを確認します。圧力リザーバー出力が100 mBar未満低下し、真空リザーバー出力が500 mBar未満増加したことを確認します。 500 μLのシーディングアドバンストDMEM培地(37°Cに予め加温)をリザーバー側に加えて、各ウェルをプライミングします。 流体がフィルターサポートを通過するまで、コントローラー画面で Prime プログラムを選択します(2.5 μL/sで3分間アップフロー)。注意: 「アップフロー」は、LC12プレートの足場を通ってリザーバーから上向きにメディアを流すことを可能にするコントローラーの設定です。 すべてのウェルにさらに1.1 mLのシーディングアドバンストDMEM培地を充填して、表面チャネルを覆います。その後、すべてのウェルは1.6mLの全作業容量になります。 プレート付きのドライバーを37°C、5%CO2 インキュベーターに入れ、ドッキングステーションに接続して 、インキュベート プログラムを実行します。注意: 実験で使用されるすべてのプログラム(プライム、インキュベート、シード、メディアチェンジ)は、MPSシステムで事前設定されています。播種の準備ができるまでインキュベーター内のプレートをプライミングします。 3. MPSへの肝細胞の播種(0日目) すべての PHHS および HKC を事前に検証します。すべてのPHHおよびHKCロットは、細胞培養実験を実施する前に社内で事前検証されています( 補足資料を参照)。 PHHおよびHKC細胞のバイアル(材料表)を、バイアルを37°Cの水浴中で氷のわずかなスライバーだけが残るまで安定して保持することにより、解凍します。 PHHを予熱(37°C)凍結保存された肝細胞回収培地CHRM培地(チューブあたり最大2バイアル)のチューブに直接ピペットで入れます。 細胞を穏やかにピペットで固定し、1 mLのCHRMを使用して、クライオチューブから残りの細胞を洗い流します。解凍して円錐形のチューブに移すときは、細胞に非常に優しくしてください。注意 解凍中にバイアルを攪拌したり、内容物を上下にピペットで動かしたりしないでください。 HKC細胞をクライオチューブから15 mL遠沈管内の10 mLの氷冷シーディングアドバンストDMEM培地に穏やかにピペットします。注:HKCのバイアルは最大2つまで組み合わせることができます。 両方の細胞タイプを室温(RT)で100 x g で10分間遠心分離します。上清を取り除きます。 チューブに添加した細胞のバイアルあたり1 mLを使用して、PHHを温かいシーディングアドバンストDMEM培地に、HKCを氷冷シーディングアドバンストDMEM培地に再懸濁し(細胞の凝集を減らすため)、細胞を氷上に置きます。穏やかな揺れ作用を使用して、細胞を再懸濁します。注意: PHHは細胞死につながる可能性があるため、ピペットアクションでPHHを再懸濁しないでください。 複数のチューブからの細胞懸濁液を結合しますが(該当する場合-つまり、すべてのPHHが同じドナーからのものである場合)、細胞タイプを混合しないでください。 セルをカウントします。生存率(細胞タイプ、PHHおよびHKCの両方で85%を超えている必要があります)と細胞の総数を記録します。細胞生存率が85%を下回った場合は、新しいバイアルの細胞を解凍し、細胞生存率を再評価します。 次の式を使用して細胞生存率を計算します。 各ウェルに播種する細胞懸濁液の希望量と、総播種量を400 μLにするために必要なシーディングアドバンストDMEM培地の追加容量を計算します。 ウェルあたりの細胞数:ウェルあたり0.4 x 10 6 PHHおよび0.04 x 10 6 HKC、および細胞密度0.25 x 10 6 PHHs/mL、 それぞれ0.025 x 106 HKC/mL。 ドライバをドッキング ステーションから取り外し、MBSC に挿入します。 上記の足場から停止点(保持リングの深いノッチを下る)、チャネル、およびリザーバーまで媒体を吸引します。培養ウェルに0.2 mLの「デッドボリューム」を残し、足場のすぐ上に到達します。気泡が形成されないように、足場の上から全媒体を取り除かないように注意する必要があります。 400 μLのシーディングアドバンストDMEM培地をウェルチャンバーに加え、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 培地交換 プログラムを3分間実行します。プログラムは3分後に自動的に一時停止します。 完了したら、ドライバーをドッキング ステーションから取り外し、MBSC に戻します。 上記の足場から停止点および各ウェルのリザーバー端まで培地を吸引します。 チューブを軽く揺らしてPHHを慎重に再懸濁し、必要量の細胞懸濁液を各培養ウェルに加えます。細胞懸濁液を慎重にピペットでピペッティングし、細胞がプレートの足場全体に均等に分散することを確認します。注意: 足場全体を十分にカバーするには、ゆっくりと旋回する動きを使用して、細胞を足場にピペットで固定します。 同様に、HKCを注意深く再懸濁し、細胞懸濁液を各培養ウェルに追加します。注意: ゆっくりと渦巻く動きを使用してHKCをシードし、足場全体に十分なカバレッジを確保します。2つの播種サブステップを分離することも、2つの細胞タイプを適切な密度で事前に混合して同時に播種することもできます。 すべてのウェルに両方の細胞タイプが含まれたら、MPSドライバーを物理的に接続せずにインキュベーターのドッキングステーションに置き、1時間放置します。 1時間後、各ウェルに必要量の追加のシーディングアドバンストDMEM培地を400 μLに達するまで充填し、 シード プログラムを実行します。 2分後、プログラムは自動的に一時停止し、インキュベーターからドライバーを取り外し、1000 μLのSeeding Advanced DMEM培地をチャネル(ウェルチャンバーよりもリザーバー端に近い)にゆっくりと追加して、総容量1.4 mLを達成します(チャネル内のデッドボリュームはさらに200 μLです)。 プレートをインキュベーターに移動し、 残りのシード プログラムを8時間実行します。注:フローは8時間後に自動的にインキュベートプログラムに切り替わります。 4. メディア変更(1日目) ドライバをドッキング ステーションから取り外し、MBSC に挿入します。 ウェルチャンバー内のシードアドバンスドDMEM培地を停止点まで除去して 、培地交換 を実行します。 400 μLのメンテナンスアドバンストDMEM培地をウェルチャンバーに加え、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、培地交換プログラムを3分間実行します。プログラムは3分後に自動的に一時停止します。 ドライバーをドッキングステーションから外し、MBSCで、リザーバーチャンバー、チャネル、および足場の上の停止点からメディアを吸引します。この時点で、培養ウェルはデッドボリュームに戻ります。 リザーバーチャンバーに、1.4 mLの新鮮な予熱(37°C)メンテナンスアドバンストDMEM培地を補充します。 ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを実行します。 5.肝微小組織の品質管理(QC)、培地収集、培地交換、および薬物投与(4日目) 4日目に、メンテナンスアドバンストDMEM培地とQCチェックを使用して 培地交換 を実行し、シードが成功したことを確認します。注:QCは、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)と尿素を測定することにより、形成された微小組織の健康状態をチェックするために使用されるプロセスです。 QCを実行する前に、テストする各化合物の新鮮なストック溶液を調製します(各化合物の溶解度に応じて、0.1%DMSOを含むメンテナンスアドバンストDMEM培地またはメンテナンスアドバンストDMEM培地のいずれか)。それに応じて希釈液を調製し、各化合物の試験濃度を得ます。 ドライバーとプレートをドッキングステーションから取り外し、MBSCに転送します。 各ウェルから50 μLの培地をピペットを使用して96ウェルプレートに移し、サンプリング前にLDHアッセイ(材料表)を実行し、尿素アッセイ(材料表)に25 μLを移します。注意: LDHおよび尿素アッセイは、製造元の指示に従って実行されます。 LDH測定値が2 AU / 10 6細胞未満で、尿素が40 μg/日/ 106細胞を超える場合は、QC後に実験を続行します。注:アルブミンは、当日の実行に時間がかかるアッセイであり、4日目に採取されたサンプルから実験が完了すると後でアッセイされるため、QCとしては使用されません。 QCに不合格の井戸がある場合は、実験計画から削除します。 実験レイアウトが確認されたら、足場に触れて細胞培養を妨げないようにしながら、各ウェルから残りの培地をサンプリングします。採取した培地(投与前サンプルとしてラベル付け)を-80°Cで保存し、後でアッセイします。 MBSC で メディアの変更 を実行するには、手順 4.3 から 4.5 を実行します。ウェルを、実験デザインに従って適切な薬物濃度のメンテナンスアドバンストDMEM培地に変更します。 完了したら、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを実行します。 6.メディアの収集、メディアの変更、薬物投与(6日目) テストする各化合物の新鮮なストック溶液を調製します(各化合物の溶解度に応じて、0.1%DMSOを含むメンテナンスアドバンストDMEM培地またはメンテナンスアドバンストDMEM培地のいずれか)。プレート計画に従って各化合物の試験濃度が得られるように、それに応じて希釈液を調製します。 ドライバとプレートをドッキングステーションから取り外し、MBSCに転送します。 各ウェル(~1 mL)からピペットで手動で培地を採取し、足場に触れて細胞培養を妨げないようにし、LDHと尿素をアッセイします。採取した培地の残りを後のアッセイのために-80°Cで保存し、投与後48時間のサンプルで標識します。 手順4.3〜4.5に従って 培地交換 を実行して、4日目と同じ薬物濃度でプレート計画に従って各ウェルを再投与します。. 完了したら、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを実行します。 7. 実験の終了(8日目) ドライバとプレートをドッキングステーションから取り外し、MBSCに転送します。 ピペットを使用して各ウェルから培地を手動でサンプリングし、足場に触れて細胞培養を妨げないようにします。 回収した培地をLDHおよび尿素用にアッセイし、回収した培地の残りを後のアッセイのために-80°Cで保存します。 CYP3A4-gloアッセイの実行。このアッセイを使用して、実験終了時にPHHのシトクロムP450 CYP3A4活性に対して試験された薬物の効果を測定します。 製造元の指示に従って、検出試薬を再構成します(CYP3A4アッセイの場合は、 材料の表を参照)。検出試薬を再構成して凍結したことがある場合は、-20°Cの冷凍庫から取り出し、RTで解凍します。 製造元の指示に従って、20 mMストックD-ルシフェリン標準を準備します。 メンテナンスアドバンストDMEM培地(ウェルあたり2 mLの発光基質培地)でルシフェリンIPAを1:1000希釈して、実用的な発光基質培地を準備します。 発光性基質培地を使用して、手順4.3〜4.5で説明されている ようにメディア交換 を実行します。500 μLの発光基質培地を、投入材料として1.5 mLガラスバイアル(材料表)に保存します。 ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、 インキュベート プログラムを1.5時間実行します。 製造元の指示に従って1.5 mLチューブの培地でD-ルシフェリン標準曲線を作成し、ブランクまたは0 μMの培地を使用して、白色不透明な96ウェルプレート( 材料の表を参照)上に各標準物質50 μLを複製してピペットします。 時間が経過したら、手順に従って、ドッキングステーションとCYP3A4アッセイ用のサンプルメディアからドライバーを取り外し、手順7.4.9-7.4.13を実行します。 インキュベーション後、各ウェルおよび投入材料から50 μLのサンプル培地を、標準物質を含む96ウェルの不透明な白色ルミノメータープレートに移します。トップスタンダードとサンプル測定値の間の軽いキャリーオーバーを避けるために、標準とサンプルの間の不透明なプレートに少なくとも2つの空の列を残すように注意してください。 50 μLのルシフェリン検出試薬を各ウェルに追加して、発光反応を開始します。 プレートシェーカーでRTでプレートを暗所で20分間インキュベートし、発光信号を安定させます。 ルミノメーターまたはCCDカメラを使用して発光を記録します。 各点の平均を取り、空白の平均を引くことによって、標準曲線をプロットします。線の式を使用して、残りのサンプルの代謝率(pmol/min/106 細胞)を計算し、行われた希釈を含めることを忘れないでください。 ピンセットを使用してプレートから足場を取り外し、微小組織を乱さないように注意しながら、各ウェルに500 μLのD-PBS(Ca++およびMg++なし)を含む24ウェルプレートに入れます。 倍率10倍の倒立光学顕微鏡を使用して、各足場のスナップショットを撮ります。 製造元の指示に従ってATPアッセイ( 材料表を参照)を実行します。RTで試薬を解凍します。 洗浄ステップごとに、500 μLのD-PBS(Ca++およびMg++なし)で足場を2回洗浄します。 各足場に120 μLの試薬と120 μLのPBSを追加し、同じ容量を空のウェルに追加します(これはブランクとして機能します)。アルミホイルで覆われたプレートをシェーカーに置き、5分間激しく振とう(500 rpm)、続いて30分間インキュベートして発光信号を安定させます。 溶解したサンプル100 μLを、測定用の透明な平底96ウェルアッセイプレートに二重に移します。ブランクウェルが高発光の他の測定ウェルの隣に配置されていないことを確認してください。 マイクロプレートリーダーを使用して発光を記録します。 サンプルの発光と標準の発光を比較して、サンプル中の試薬によって検出されたATPを決定します。