Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity <em>In Vitro</em>

Ovidiu Novac; Raul Silva; Lucy-May Young; Kim Lachani; David Hughes; Tomasz Kostrzewski

doi:10.3791/63389

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Biology

Système microphysiologique du foie humain pour l’évaluation de la toxicité hépatique induite par un médicament in vitro

Published: January 31, 2022

doi:

10.3791/63389

Ovidiu Novac¹, Raul Silva¹, Lucy-May Young¹, Kim Lachani¹, David Hughes¹, Tomasz Kostrzewski¹

¹CN Bio Innovations Ltd

Summary

Les lésions hépatiques d’origine médicamenteuse (DILI) sont une cause majeure d’échec médicamenteux. Un protocole a été développé pour prédire avec précision la responsabilité DILI d’un composé à l’aide d’un système microphysiologique du foie (MPS). Le modèle hépatique utilise la coculture de cellules hépatiques primaires et des paramètres translationnellement pertinents pour évaluer les réponses cellulaires au traitement.

Abstract

DILI est une cause majeure d’attrition dans le développement de médicaments avec plus de 1000 médicaments approuvés par la FDA connus pour potentiellement causer DILI chez l’homme. Malheureusement, le DILI n’est souvent détecté que lorsque les médicaments ont atteint les stades cliniques, ce qui met en danger la sécurité des patients et entraîne des pertes substantielles pour l’industrie pharmaceutique. Compte tenu du fait que les modèles 2D standard ont des limites dans la détection de DILI, il est essentiel de développer des modèles in vitro plus prédictifs pour améliorer la traduisibilité des données. Pour comprendre en détail la causalité et les aspects mécanistes du DILI, un MPS hépatique humain composé de cellules parenchymateuses et non parenchymateuses (NPC) hépatiques primaires humaines et cultivé dans des microtissus 3D sur un échafaudage artificiel sous perfusion a été développé. Des hépatocytes humains primaires (PHH) et des cellules de Kupffer (HKC) cryoconservés ont été cocultivés sous forme de microtissus dans la plateforme MPS pendant deux semaines maximum, et chaque composé d’intérêt a été dosé à plusieurs reprises sur des microtissus hépatiques à sept concentrations d’essai pendant quatre jours. Les critères d’évaluation fonctionnels spécifiques au foie ont été analysés (y compris les biomarqueurs cliniques tels que l’alanine aminotransférase, ALT) pour évaluer la fonction hépatique. L’exposition aiguë et chronique à des composés de diverses sévérités DILI peut être évaluée en comparant les réponses à des microtissus à dose unique et multidose. La méthodologie a été validée avec un large éventail de composés sévères et légèrement hépatotoxiques. Nous montrons ici les données pour la pioglitazone et la troglitazone, des composés hépatotoxiques bien connus retirés du marché pour provoquer des insuffisances hépatiques. Dans l’ensemble, il a été démontré que le modèle MPS hépatique peut être un outil utile pour évaluer DILI et son association avec les changements dans la fonction hépatique. Le modèle peut également être utilisé pour évaluer comment les nouveaux composés se comportent dans des sous-ensembles de patients distincts et comment les profils de toxicité peuvent être affectés par les états de maladie du foie (p. ex. hépatite virale, stéatose hépatique).

Introduction

DILI reste la cause la plus fréquente d’insuffisance hépatique aiguë aux États-Unis et en Europe et est l’une des principales causes d’attrition des composés dans le processus de développement de médicaments¹. Presque toutes les classes de médicaments peuvent provoquer une hépatotoxicité, les agents du système nerveux central et les antibiotiques étant de loin les traitements les plus courants qui causent DILI chez les patients². L’hépatotoxicité induite par les médicaments est causée par une interaction complexe de facteurs génétiques, non génétiques et environnementaux, entraînant la mort des hépatocytes et d’autres types de cellules hépatiques, y compris les cholangiocytes et les cellules endothéliales ^1,3.

Les agents responsables du DILI peuvent être classés de deux manières: ceux qui causent des lésions hépatiques dose-dépendantes prévisibles ou ceux qui provoquent un DILI idiosyncratique qui est rare et se développe indépendamment de la dose de médicament, de la voie ou de la durée d’administration, mais qui est responsable de jusqu’à un sixième de toutes les insuffisances hépatiques aiguës aux États-Unis seulement⁴. Malheureusement, DILI n’est souvent pas détecté jusqu’à ce que les médicaments aient atteint les stades cliniques du processus de développement du médicament. Le classement des lésions hépatiques induites par les médicaments (ou DILIrank) comprend plus d’un millier de médicaments approuvés par la FDA qui sont divisés en quatre classes en fonction de leur potentiel de causer DILI, et leur utilisation chez les patients doit être étroitement surveillée⁵.

L’étude des mécanismes d’hépatotoxicité des médicaments reste très difficile et, par conséquent, de nombreux modèles précliniques ont été développés pour explorer les mécanismes de DILI. Les modèles in vitro et in vivo actuels utilisés pour prédire le DILI en développement préclinique présentent plusieurs limites pour fournir des informations sur les interactions complexes et multiformes dans un corps humain vivant. Les lignées cellulaires hépatiques cancéreuses (c.-à-d. HepG2, HepaRG) cultivées en 2D sont encore utilisées dans les premiers stades de la mise au point de médicaments pour évaluer la toxicité des composés candidats⁶. Malgré cela, ces lignées cellulaires proviennent de donneurs uniques et présentent des niveaux anormaux de fonction hépatique, et ne présentent pas toujours une sensibilité élevée pour la détection de DILI ^7,8. Comme alternative aux lignées cellulaires hépatiques cancéreuses, les PHH représentent mieux la physiologie du foie humain s’ils sont cultivés de manière appropriée in vitro, bien que leur culture présente plusieurs limites, comme une courte durée d’incubation avec des médicaments, une durée de vie relativement courte, une perte d’expression génique hépatique et des changements des fonctions métaboliques des médicaments 9,10,11 . Les PHH peuvent être cultivés sur des protéines de matrice extracellulaire dans des plaques de culture cellulaire 2D standard, mais comme inconvénient, le déclin rapide de leur fonction signifie qu’ils ont une faible sensibilité (<50%) pour la prédiction DILI¹².

D’autre part, les tests sur des modèles animaux sont lents, coûteux et nécessitent une traduction inter-espèces pour extrapoler la prédiction aux humains. La plupart des médicaments nouvellement développés ne parviennent pas à obtenir l’approbation, ce qui rend ce processus coûteux et risqué⁵. En outre, pour tester de nouvelles modalités spécifiques à l’homme, les modèles animaux sont moins appropriés en raison des différences de séquence génétique ou de réponse immunologique par rapport aux humains¹³.

Par conséquent, l’intérêt pour les modèles hépatiques in vitro tridimensionnels (3D) plus avancés a augmenté de façon exponentielle. La culture de PHH en tant que structures sphéroïdales générées par agrégation gravitationnelle dans des gouttes suspendues ou sur des surfaces de fixation ultrafaibles représente une méthode à haut débit pour évaluer les passifs composés¹⁴. Les sphéroïdes PHH ont été utilisés pour évaluer le DILI dans un contexte malade (p. ex. stéatose et cholestase)¹⁵. Une grande variété de modèles ont été développés pour inclure des cocultures plaquées à micro-motifs d’hépatocytes avec fibroblastes stromaux¹⁶, des tissus hépatiques bio-imprimés en 3D 17, des cultures sphéroïdes 3D avec ou sans cellules hépatiques non parenchymateuses¹⁵. Cependant, toutes ces méthodes présentent encore des inconvénients, et la culture des PHH dans un microenvironnement plus pertinent sur le plan physiologique pourrait leur fournir des niveaux de fonctionnalité plus élevés pendant de longues périodes pour permettre l’investigation d’une exposition prolongée à des hépatotoxiques potentiels. En outre, pour améliorer la pertinence translationnelle de toute culture avancée in vitro de PHH, des paramètres fonctionnels cliniquement pertinents ou des biomarqueurs de sortie de toxicité doivent être utilisés pour permettre la comparaison des données in vivo ou des scénarios cliniques¹⁸.

Dans cette étude, nous avons évalué si un modèle hépatique in vitro de MPS, également connu sous le nom d’organe sur puce (OOC), pouvait être utilisé pour comprendre les aspects mécanistes détaillés de la toxicité hépatique. Il a déjà été démontré que le MPS maintient des microtissus hépatiques 3D hautement fonctionnels, sous flux, jusqu’à 4 semaines¹⁹. Le système a été récemment testé par la FDA et s’est avéré avoir une reproductibilité élevée lors de la toxicité du médicament, du métabolisme et de l’accumulation intracellulaire²⁰. De plus, par rapport aux sphéroïdes et aux cultures sandwich, le système avait une fonction plus stable et une plus grande sensibilité dans la détection de la toxicité de plusieurs médicaments²⁰. À ce jour, le MPS a été utilisé dans un large éventail d’applications couvrant l’ADME²¹, la modélisation des maladies (HBV²², NAFLD 23,24,25) et les interactions médicamenteuses ²⁶^, ce qui le rend potentiellement très adapté à l’évaluation des DILI aiguës et chroniques. La technologie présentée ici offre une alternative pour combler l’écart entre les cultures cellulaires et les modèles animaux plus traditionnels et les essais cliniques humains, progressant vers la simulation des conditions biologiques humaines pour soutenir l’évaluation de la toxicité hépatique des composés candidats aux stades précliniques du processus de développement de médicaments.

Protocol

Tous les travaux ont été effectués dans le laboratoire en suivant des procédures strictes en matière de santé et de sécurité et conformément à ses propres évaluations des risques et SOP. Tout l’équipement utilisé est entretenu conformément aux directives du fabricant. Les enceintes de sécurité microbiologique (MBSC) sont entretenues chaque année et les Ki-Discus (iodure de potassium) sont testés selon les normes britanniques. Le protocole suit le code de pratique et les directives de la Human Tissue Authority (HTA) du Royaume-Uni et utilise des cellules humaines primaires d’origine éthique fournies par des fournisseurs qui respectent pleinement les exigences générales en matière de consentement éclairé (45 CFR §46.116 et §46.117) et de bonnes pratiques cliniques (BPL), (ICH E6), ainsi que les comités de réglementation et d’éthique. 1. Préparation des milieux de culture cellulaire NOTE: Préparer le milieu DMEM avancé d’ensemencement le jour -1 et conserver à 4 °C. Préparer le support DMEM avancé de maintenance le jour 1 et conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine. Ensemencement du milieu DMEM avancé pour la coculture des PHH et des HKC : Compléter une bouteille de milieu DMEM avancé de 500 ml (table des matières) avec 18 mL de cocktail A (concentration finale de 3,6 %) et avec 25 mL de FBS (concentration finale de 5 %). Maintenance Milieu DMEM avancé pour la coculture PHH et HKC : Compléter une bouteille de milieu DMEM avancé de 500 ml (table des matières) avec 20 ml de cocktail B (concentration finale de 4%) et 500 nM d’hydrocortisone.NOTE: L’hydrocortisone sera fraîche le jour de l’utilisation, et les étapes sur la façon de préparer la solution mère et les dilutions requises sont mentionnées ci-dessous. Préparation de 500 nM d’hydrocortisone en milieu DMEM avancé de maintenancePréparation de la solution mère de départ (20 mM) : Peser 7,24 mg d’hydrocortisone (table des matières) dans un flacon en verre de 1 ml. Noter la quantité exacte d’hydrocortisone pesée et déterminer le volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) en utilisant le calcul suivant : Préparation de la solution mère d’hydrocortisone de 100 μM : Ajouter 5 μL de la solution mère de départ de 20 mM à 995 μL de DMEM avancé.REMARQUE : La dilution de 25 μL de la solution de DMSO de l’étape 1 dans l’eau ou le milieu entraîne une concentration de DMSO de 0,5 %. Dans la solution finale, la concentration de DMSO sera de 0,0025%. Dans ce cas, le volume supplémentaire de 5 μL entraîne une modification insignifiante du volume total. Préparation de la solution d’hydrocortisone 500 nM de travail dans Advanced DMEM : Pour préparer 1 mL de solution d’hydrocortisone 500 nM dans Advanced DMEM, ajouter 5 μL de la solution mère d’hydrocortisone 100 μM à 995 μL du milieu DMEM Advanced de maintenance. 2. Configuration et amorçage MPS (Jour -1) Connectez le contrôleur à sa station d’accueil dans un incubateur de culture cellulaire et assurez-vous que du déshydratant frais (table des matériaux) est ajouté dans le pot déshydratant situé à l’arrière du contrôleur.REMARQUE: L’unité de contrôle aspire l’humidité de l’incubateur au fil du temps et est maintenue au sec à l’aide d’un déshydratant frais. Allumez le contrôleur en appuyant sur l’interrupteur à bascule du bateau situé derrière lui et attendez 5 minutes pour que le système se stabilise et atteigne la pression. Vérifiez ensuite l’écran du rapport pneumatique pour vous assurer : (i) que la sortie du réservoir de pression a atteint ~2000 mBar et (ii) que la sortie du réservoir à vide a atteint ~850 mBar. Retirez chaque plaque de l’emballage et inspectez visuellement chaque puits pour vérifier les défauts éventuels (échafaudages manquants, fissures, etc.). Insérez un pilote (avec une plaque allumée) sur la station d’accueil pour vérifier que le pilote est reconnu par la station d’accueil et le contrôleur. Vérifiez que la sortie du réservoir sous pression a chuté de moins de 100 mBar et que la sortie du réservoir sous vide a augmenté de moins de 500 mBar. Amorcez chaque puits en ajoutant 500 μL de milieu DMEM avancé Seeding (préchauffé à 37 °C) du côté du réservoir. Sélectionnez le programme Prime sur l’écran du contrôleur (débit ascendant pendant 3 min à 2,5 μL/s) jusqu’à ce que le fluide traverse les supports du filtre. REMARQUE: « Débit ascendant » est un réglage sur le contrôleur qui permet au fluide de s’écouler du réservoir vers le haut à travers les échafaudages de la plaque LC12. Remplir tous les puits avec 1,1 mL supplémentaire de milieu DMEM Seeding Advanced pour couvrir le canal de surface. Tous les puits seront alors à leur volume de travail complet de 1,6 mL. Placez les pilotes avec des plaques dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 , connectez-vous à la station d’accueil et exécutez le programme Incubate .REMARQUE: Tous les programmes utilisés dans l’expérience (Prime, Incubate, Seed, Media Change) sont prédéfinis dans le système MPS. Amorcez les assiettes dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être ensemencées. 3. Ensemencement des cellules hépatiques dans la MPS (Jour 0) Prévalidez tous les PHHS et HKC. Tous les lots PHH et HKC sont pré-validés en interne avant d’effectuer l’expérience de culture cellulaire (voir Matériel supplémentaire). Décongeler les flacons des cellules PHH et HKC (Tableau des matériaux) en maintenant les flacons régulièrement dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace. Pipeter les PHH directement dans un tube de milieu CHRM préchauffé (37 °C) de milieu de récupération des hépatocytes cryoconservé (deux flacons maximum par tube). Pipeter doucement les cellules, puis utiliser 1 mL de CHRM pour laver les cellules restantes du cryotube. Soyez très doux avec les cellules lors de la décongélation et du transfert dans un tube conique.ATTENTION N’agitez pas les flacons pendant la décongélation et ne pipettez pas leur contenu de haut en bas. Pipeter doucement les cellules HKC du cryotube dans 10 ml de milieu DMEM avancé à ensemencement glacé dans un tube à centrifuger de 15 ml.REMARQUE: Jusqu’à 2 flacons de HKC peuvent être combinés. Centrifuger les deux types de cellules à température ambiante (RT) à 100 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant. Remettez en suspension les PHH dans un milieu DMEM Seeding Advanced chaud et des HKC dans un milieu DMEM Seeding Advanced glacé (pour aider à réduire l’agglutination cellulaire), en utilisant 1 mL par flacon de cellules ajoutées au tube et placez les cellules sur de la glace. Utilisez une action de balancement douce pour remettre les cellules en suspension.ATTENTION : Ne pas remettre en suspension les PHH par l’action de la pipette, car cela peut entraîner la mort cellulaire. Combinez les suspensions cellulaires de plusieurs tubes (s’il y a lieu, c.-à-d. si tous les PHH proviennent du même donneur), mais ne mélangez pas les types de cellules. Comptez les cellules. Enregistrer la viabilité (doit être supérieure à 85 % pour les deux types de cellules, PHH et HKC) et le nombre total de cellules. Si la viabilité cellulaire tombe en dessous de 85%, décongelez un nouveau flacon de cellules et réévaluez la viabilité cellulaire. Calculez la viabilité des cellules à l’aide de la formule suivante : Calculer le volume souhaité de la suspension cellulaire à ensemencer dans chaque puits et le volume supplémentaire de milieu DMEM avancé d’ensemencement nécessaire pour porter le volume total d’ensemencement à 400 μL. Nombre de cellules par puits: 0,4 x 10 6 PHH et 0,04 x 10 6 HKC par puits, et densité cellulaire de 0,25 x 106 PHH/mL, respectivement 0,025 x 106 HKCs/mL. Déconnectez le pilote de la station d’accueil et placez-le dans le MBSC. Aspirer le média de l’échafaudage ci-dessus au point d’arrêt (en descendant l’encoche profonde sur l’anneau de retenue), au canal et au réservoir. Laisser un « volume mort » de 0,2 mL dans le puits de culture, atteignant juste au-dessus de l’échafaudage. Il faut veiller à ne pas retirer le milieu total au-dessus de l’échafaudage pour éviter la formation de bulles d’air. Ajouter 400 μL de milieu DMEM avancé d’ensemencement dans la chambre du puits, remettre le pilote sur la station d’accueil dans l’incubateur et exécuter le programme Media Change pendant 3 min. Le programme se mettra automatiquement en pause après 3 min. Une fois terminé, déconnectez le pilote de la station d’accueil et replacez-le dans le MBSC. Aspirer les médias de l’échafaudage ci-dessus jusqu’au point d’arrêt et à l’extrémité du réservoir de chaque puits. Remettez délicatement en suspension les PHH en balançant doucement le tube, puis ajoutez le volume requis de la suspension cellulaire à chaque puits de culture. Pipeter soigneusement la suspension cellulaire, s’assurer que les cellules se dispersent uniformément sur l’échafaudage de la plaque.REMARQUE: Pour assurer une bonne couverture tout au long de l’échafaudage, utilisez un mouvement de tourbillon lent pour pipeter les cellules sur l’échafaudage. De même, remettez soigneusement en suspension les HKC et ajoutez bien les suspensions cellulaires à chaque culture.REMARQUE: Utilisez un mouvement de tourbillon lent pour ensemencer les HKC afin d’assurer une bonne couverture dans tout l’échafaudage. Les deux sous-étapes d’ensemencement peuvent être séparées, ou les deux types de cellules peuvent être prémélangés à une densité appropriée et ensemencés en concomitance. Une fois que tous les puits contiennent les deux types de cellules, placez le pilote MPS sur la station d’accueil dans l’incubateur sans le connecter physiquement et laissez-le reposer pendant 1 h. Après 1 h, remplissez chaque puits avec le volume requis de milieu DMEM avancé d’ensemencement supplémentaire pour atteindre 400 μL et exécutez le programme de semences . Après 2 min, le programme se mettra automatiquement en pause, retirera le pilote de l’incubateur et ajoutera lentement 1000 μL du milieu DMEM Seeding Advanced au canal (plus près de l’extrémité du réservoir que de la chambre du puits) pour atteindre un volume total de 1,4 mL (avec un volume mort supplémentaire de 200 μL dans les canaux). Déplacez les plaques vers l’incubateur et exécutez le reste du programme Seed pendant 8 h.REMARQUE: Flow passera automatiquement au programme Incuber après 8 heures. 4. Changement de média (Jour 1) Déconnectez le pilote de la station d’accueil et placez-le dans le MBSC. Effectuez un changement de média en retirant le milieu DMEM avancé d’ensemencement dans la chambre du puits jusqu’au point d’arrêt. Ajouter 400 μL du milieu DMEM Maintenance Advanced dans la chambre du puits, remettre le pilote sur la station d’accueil dans l’incubateur et exécuter le programme Media Change pendant 3 min. Le programme se mettra automatiquement en pause après 3 min. Débranchez le conducteur de la station d’accueil et, dans le MBSC, aspirez le média de la chambre du réservoir, du canal et du point d’arrêt au-dessus de l’échafaudage. À ce stade, le puits de culture sera retourné au volume mort. Remplissez la chambre du réservoir avec 1,4 mL de milieu DMEM frais préchauffé (37 °C) Maintenance Advanced DMEM. Remettez le pilote sur la station d’accueil de l’incubateur et exécutez le programme Incubate . 5. Contrôle de la qualité des microtissus hépatiques (CQ), collecte des milieux, changement de milieu et dosage du médicament (Jour 4) Le jour 4, effectuez un changement de support à l’aide du support DMEM avancé de maintenance et des contrôles de contrôle qualité pour vous assurer que l’ensemencement a réussi.NOTE: Le CQ est un procédé utilisé pour vérifier la santé des microtissus formés en mesurant la lactate déshydrogénase (LDH) et l’urée. Avant d’exécuter le CQ, préparer des solutions mères fraîches pour chaque composé à tester (soit dans un milieu DMEM de maintenance avancée, soit dans un milieu DMEM avancé de maintenance contenant 0,1 % de DMSO, selon la solubilité de chaque composé). Préparer les dilutions en conséquence pour obtenir des concentrations d’essai pour chaque composé. Déconnectez le pilote et la plaque de la station d’accueil et transférez-les vers un MBSC. Transférer 50 μL de milieu de chaque puits à l’aide d’une pipette vers une plaque de 96 puits pour effectuer un dosage de la LDH (Table des matériaux) avant l’échantillonnage et 25 μL pour un dosage de l’urée (Tableau des matériaux).REMARQUE: Les dosages de LDH et d’urée seront effectués conformément aux instructions du fabricant. Poursuivre l’expérience après le CQ si les lectures de LDH sont inférieures à 2 UA/10 6 cellules et l’urée est supérieure à 40 μg/jour/106 cellules.NOTE: L’albumine n’est pas utilisée comme CQ car il s’agit d’un test long à exécuter le jour même et sera analysé plus tard une fois l’expérience terminée à partir des échantillons prélevés le jour 4. Si des puits échouent au CQ, retirez-les de la conception expérimentale. Une fois la disposition expérimentale confirmée, échantillonnez le milieu restant de chaque puits, en veillant à ne pas perturber la culture cellulaire en touchant l’échafaudage. Conservez les milieux collectés (étiquetés comme échantillons pré-dose) à -80 °C pour des dosages ultérieurs. Effectuez un changement de support dans un MBSC en suivant les étapes 4.3 à 4.5. Changer les puits en milieu DMEM avancé de maintenance avec la bonne concentration de médicament selon la conception expérimentale. Une fois terminé, remettez le conducteur sur la station d’accueil dans l’incubateur et exécutez le programme Incubate . 6. Collecte des médias, changement de média et dosage du médicament (Jour 6) Préparer des solutions mères fraîches pour chaque composé à tester (soit en milieu DMEM de maintenance avancée, soit en milieu DMEM avancé de maintenance contenant 0,1 % de DMSO, selon la solubilité de chaque composé). Préparer les dilutions en conséquence pour obtenir des concentrations d’essai pour chaque composé conformément au plan de la tôle. Déconnectez le pilote et la plaque de la station d’accueil et transférez-les vers un MBSC. Recueillir manuellement le milieu de chaque puits (~1 mL) à l’aide d’une pipette en veillant à ne pas perturber la culture cellulaire en touchant l’échafaudage, en analysant la LDH et l’urée. Conservez le reste du milieu collecté à -80 °C pour les dosages ultérieurs et étiquetez-les 48 heures après la dose. Redoser chaque puits avec la même concentration de médicament que le jour 4 et selon le plan de la plaque en effectuant le changement de média en suivant les étapes 4.3-4.5. Une fois terminé, remettez le conducteur sur la station d’accueil dans l’incubateur et exécutez le programme Incubate . 7. Fin de l’expérience (Jour 8) Déconnectez le pilote et la plaque de la station d’accueil et transférez-les vers un MBSC. Prélevez manuellement les milieux de chaque puits à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas perturber la culture cellulaire en touchant l’échafaudage. Doser les milieux prélevés pour la LDH et l’urée et stocker le reste des milieux collectés à -80 °C pour les dosages ultérieurs. Exécution du test CYP3A4-glo.Mesurer les effets des médicaments testés sur l’activité du cytochrome P450 CYP3A4 dans les PHH à la fin de l’expérience à l’aide de ce test. Reconstituer le réactif de détection (pour le dosage du CYP3A4, voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant. Si le réactif de détection a déjà été reconstitué et congelé, retirez-le du congélateur à -20 °C et laissez-le décongeler à TA. Préparer 20 mM de D-luciférine mère étalon en suivant les instructions du fabricant. Préparer le milieu de substrat luminogène de travail avec une dilution de 1:1000 de Luciferin IPA dans un milieu DMEM avancé d’entretien (2 mL de milieu substrat luminogène par puits). Effectuer un changement de milieu comme décrit aux étapes 4.3-4.5 avec un milieu de substrat luminogène. Conservez 500 μL du substrat luminogène dans un flacon en verre de 1,5 mL (Table des matériaux) comme matériau d’entrée. Remettez le conducteur sur la station d’accueil de l’incubateur et exécutez le programme Incubate pendant 1,5 h. Préparer la courbe étalon de D-luciférine dans un milieu de culture dans des tubes de 1,5 mL en suivant les instructions du fabricant et pipeter 50 μL de chaque étalon en double sur une plaque opaque blanche de 96 puits (voir le tableau des matériaux), en utilisant le milieu de culture comme blanc ou 0 μM. Une fois le temps écoulé, retirez le pilote de la station d’accueil et du milieu d’échantillonnage pour le test CYP3A4 en suivant les étapes 7.4.9-7.4.13. Après l’incubation, transférer 50 μL du milieu d’échantillon de chaque puits et matériau d’entrée vers la plaque de luminomètre blanc opaque à 96 puits contenant des étalons. Prenez soin de laisser au moins deux rangées vides sur la plaque opaque entre les étalons et les échantillons pour éviter un léger transfert entre les étalons supérieurs et les lectures d’échantillons. Ajouter 50 μL de réactif de détection de la luciférine à chaque puits pour initier une réaction luminescente. Incuber la plaque à TA sur un agitateur à plaques pendant 20 min dans l’obscurité pour stabiliser le signal luminescent. Enregistrez la luminescence à l’aide d’un luminomètre ou d’une caméra CCD. Tracez la courbe standard en prenant la moyenne de chaque point, puis en soustrayant la moyenne des blancs. Utilisez l’équation de la ligne pour calculer le taux métabolique (pmol / min / 106 cellules) dans le reste des échantillons, en n’oubliant pas d’inclure toutes les dilutions effectuées. Retirez les échafaudages des plaques à l’aide d’une pince à épiler et placez-les dans une plaque de 24 puits contenant 500 μL de D-PBS (sans Ca++ et Mg++) dans chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber le microtissu. Prenez des instantanés de chaque échafaudage à l’aide d’un microscope à lumière inversée à un grossissement de 10x. Exécution du test ATP (voir le tableau des matières) en suivant les instructions du fabricant :Décongeler le réactif à TA. Lavez les échafaudages deux fois avec 500 μL de D-PBS (sans Ca++ et Mg++) pour chaque étape de lavage. Ajouter 120 μL de réactif et 120 μL de PBS à chaque échafaudage et les mêmes volumes à un puits vide (cela servira de blanc). Placer la plaque recouverte de papier d’aluminium sur un agitateur et agiter vigoureusement (500 tr/min) pendant 5 min suivi de 30 min d’incubation pour stabiliser le signal de luminescence. Transférer 100 μL des échantillons lysés en double sur une plaque d’essai transparente à fond plat de 96 puits pour la mesure. S’assurer que les puits blancs ne sont pas placés à côté des autres puits de mesure à haute luminescence. Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques. Comparer la luminescence des échantillons à la luminescence des étalons pour déterminer l’ATP détecté par le réactif dans les échantillons.

Representative Results

Le manuscrit décrit un modèle MPS hépatique utilisé pour évaluer DILI. Le MPS facilite la génération de microtissus hépatiques 3D qui sont maintenus hautement fonctionnels sous flux jusqu’à 4 semaines. Les PHH/HKC sont ensemencés sur des échafaudages recouverts de collagène pour former des microtissus hépatiques qui sont perfusés avec un milieu de croissance et, après avoir passé le contrôle de contrôle de la qualité, sont dosés avec des composés. Ici, nous montrons des données pour la troglitazone et la pioglitazone, deux composés structurellement similaires mais avec des sévérités DILI différentes. Au jour 4, avant l’administration du médicament, une vérification du CQ des microtissus hépatiques formés est évaluée et consiste en la libération de LDH et la synthèse de l’urée (Figure 1A). Le CQ vise à confirmer que le MPS hépatique produit des microtissus hépatiques très cohérents et fonctionnels. Les données présentées ici sont générées à partir de trois expériences et montrent de bons niveaux de reproductibilité avec une faible variabilité intra et inter-études. Après une culture de 8 jours, de multiples paramètres de santé et hépatiques (albumine, urée, CYP3A4, ATP) sont évalués et les microtissus témoins montrent des niveaux élevés de fonctionnalité hépatique et de reproductibilité (Figure 1B,C). La microscopie en phase de contraste et la coloration IF des microtissus hépatiques (voir le matériel supplémentaire) montrent une consistance élevée de l’ensemencement dans les microcanaux de l’échafaudage et révèlent la distribution des HKC dans les microtissus PHH (Figure 1D) Figure 1 : La MPS hépatique produit des données hautement reproductibles et des microtissus cohérents. (A) Mesures de contrôle qualité des microtissus hépatiques 3D au jour 4 et évaluation de la fonctionnalité à la fin de l’étude au jour 8 – (B) albumine et urée, (C) CY3A4 et ATP). Les données sont collectées à partir de 3 expériences; Dans chaque expérience, il y avait 3 répétitions de contrôle du véhicule. Les données présentées sont la moyenne ± écart-type, N = 9. (D) Microscopie à contraste de phase (10x et 20x) et IF de microtissus hépatiques 3D générés par la coculture de PHH et de HKC dans la plate-forme MPS hépatique pour l’évaluation de DILI. Pour visualiser les HKC, avant l’ensemencement, les HKC ont été transduits avec un vecteur adénoviral exprimant eGFP (voir Matériel supplémentaire). Des photomicrographies représentatives sont présentées. La transduction et l’imagerie ont été réalisées en tant qu’expérience autonome pour démontrer la localisation cellulaire et non avec le protocole DILI décrit. Les cellules HKC sont pré-validées en interne avant d’être utilisées dans des cultures cellulaires expérimentales et doivent avoir de faibles niveaux d’activation post-décongélation; ceci est évalué en mesurant les biomarqueurs IL-6 et TNF-alpha. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. La troglitazone est connue pour causer une DILI sévère; suite à sa licence pour le traitement du diabète de type 2, il a été retiré par la FDA après 3 ans sur le marché en raison de la fréquence des lésions hépatiques associées à son utilisation. À ce jour, les études animales publiées n’ont pas permis de prédire le potentiel de la troglitazone à causer des lésions hépatiques graves. La toxicité de ce composé n’a pas non plus été détectée dans les tests hépatiques 2D in vitro standard14. Les microtissus hépatiques du MPS ont reçu une dose de troglitazone pendant 96 h, ce qui a provoqué une réponse toxique aiguë, en C max, qui a été détectée par la libération d’ALT et de LDH et une réduction rapide de la production d’albumine et d’urée, à environ 15 x Cmax, après une exposition aiguë à la troglitazone (Figure 2A). Le paramètre cellulaire (teneur en ATP) et l’activité du CYP3A4 (pour évaluer la biotransformation métabolique), échantillonnés après 96 heures d’exposition, la toxicité confirmée par la troglitazone et les valeurs EC:50 étaient très comparables à d’autres paramètres (Figure 2B). Les images de microscopie à fond clair prises après une culture de 8 jours dans le MPS révèlent un microtissu hépatique sain, uniformément ensemencé dans tout l’échafaudage (contrôle du véhicule), contrairement à la mort/dégradation généralisée des tissus observée dans les répétitions traitées avec un témoin positif et une troglitazone aux deux concentrations d’essai supérieures (figure 2C). Figure 2 : Détermination du risque DILI de troglitazone à l’aide de plusieurs paramètres hépatotoxiques. Les microtissus hépatiques ont été exposés à sept concentrations d’essai de troglitazone pendant 96 h et comparés pour (A) la libération de LDH, la libération d’ALT, la production d’albumine, la synthèse de l’urée, l’activité du CYP3A4 et la teneur en ATP. Lignes bleues – exposition de 48 h (paramètres multimédias uniquement), lignes rouges – exposition de 96 heures. Le témoin positif était de 100 μM de chlorpromazine. Tous les critères d’évaluation sont mesurés à partir des mêmes cultures de MPS hépatiques. Les données présentées sont des moyennes ± écart-type, N = 3. (B) Résumé des chiffres E:50 générés à partir des données. N.D. = données non traçables. Ligne = non analysée. (C) Microscopie représentative en fond clair des microtissus hépatiques après culture de 8 jours (grossissement 10x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. La toxicité hépatique à la suite d’une exposition à la pioglitazone a également été étudiée. La pioglitazone est un composé connu pour être de faible préoccupation DILI4 et n’a pas exercé d’hépatotoxicité dans les cultures d’hépatocytes primaires 2D classiques et même dans certains modèles 3D plus avancés10,11. De légers effets hépatotoxiques ont été observés aux deux points temporels testés (figure 3). Aucun rejet de LDH ou d’ALT n’a été détecté; cependant, après 48 h, une légère réduction de la production d’albumine et d’urée a été observée, à environ 25xC max (Figure 3A). Une réduction très mineure de la teneur en ATP a également été observée à des concentrations élevées de pioglitazone, mais cela n’était pas significatif. Les valeurs EC:50 obtenues à partir des courbes dose-réponse sont présentées à la figure 3B. La microscopie a révélé une légère altération microtissulaire après 96 heures d’exposition à la pioglitazone aux deux concentrations testées les plus élevées (figure 3C). Les résultats démontrent la capacité du MPS hépatique à détecter la toxicité des composés légèrement préoccupants pour le DILI. Figure 3 : Détermination du risque DILI de pioglitazone à l’aide de plusieurs paramètres hépatotoxiques. Les microtissus hépatiques ont été exposés à sept concentrations d’essai de pioglitazone pendant 96 h et comparés pour la libération de LDH, la libération d’ALT, la production d’albumine, la synthèse de l’urée, l’activité du CYP3A4 et la teneur en ATP. Lignes bleues – exposition de 48 h (paramètres multimédias uniquement), lignes rouges – exposition de 96 heures. Le témoin positif était de 100 μM de chlorpromazine. Tous les critères d’évaluation sont mesurés à partir des mêmes cultures de MPS hépatiques. Les données présentées sont des moyennes ± écart-type, N = 3. B) Résumé des chiffres EC:50 générés à partir de données. N.D. = données non traçables. Ligne = non analysée. (C) Microscopie représentative en fond clair des microtissus hépatiques après culture de 8 jours (grossissement 10x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. En évaluant tous les paramètres fonctionnels et les biomarqueurs de sortie de toxicité qui pourraient représenter des scénarios in vivo ou cliniques (libération de LDH, synthèse d’urée, production d’albumine, activité du CYP3A4, teneur en ATP, libération d’ALT) et corroborant les données générées pour les deux composés testés dosés à une plage de doses de sept points pendant 48 h et 96 h, une carte thermique a été générée pour produire une « signature d’hépatotoxicité », aider à identifier les composés présentant divers niveaux de préoccupation DILI (Figure 4). Figure 4 : Détermination de la « signature de toxicité » avec le MPS hépatique. Carte thermique montrant la troglitazone et la pioglitazone à partir de six paramètres fonctionnels spécifiques au foie (libération de LDH, synthèse de l’urée, production d’albumine, libération d’ALT, activité du CYP3A4 et teneur en ATP) après une exposition de 48 h et 96 heures à une plage de doses de sept points. Chaque valeur est générée sous forme de moyenne, N = 3 et normalisée pour contrôler les échantillons. Les valeurs sur les barres de couleur représentent une augmentation de pli par rapport aux contrôles de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Matériel supplémentaire : Imagerie au microscope fluorescent des microtissus et évaluation de la préqualification des cellules. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les MPS sont conçus pour récapituler les unités fonctionnelles des organes humains in vitro et ont été développés pour répondre aux limites des modèles de culture cellulaire 3D conventionnels²⁷. Le foie est l’un des organes les plus modélisés utilisant la MPS, et une grande variété de systèmes ont été développés. Le foie humain est responsable du métabolisme des médicaments et de la génération de métabolites toxiques des médicaments, et sa fonction est un élément clé à modéliser pour le développement de médicaments, y compris l’évaluation de la responsabilité DILI des composés²⁸. Ici, nous avons introduit une nouvelle méthode d’évaluation de DILI à l’aide d’un MPS hépatique; le protocole permet de rechercher des informations mécanistes pour chaque dosage de composé afin de déterminer comment il peut causer DILI tout en étant un test très sensible et robuste. Les microtissus hépatiques sont formés dans les plaques MPS, qui sont une coculture de PHH et de HKC et sont très fonctionnelles avec des niveaux élevés de production d’albumine et d’urée ainsi qu’une activité élevée du CYP3A4 par rapport aux modèles hépatiques in vitro standard²⁰.

Bien que le modèle DILI décrit ici puisse servir d’outil utile dans les étapes ultérieures des essais précliniques dans le processus de développement de médicaments, il présente également plusieurs limites. Comme la majorité des MPS actuellement disponibles sur le marché, il s’agit d’une plate-forme à faible débit et, par conséquent, plus difficile à utiliser pour les activités de dépistage de médicaments à grande échelle. Constitué de microtissus formés par la coculture de PHH et de HKC, le modèle DILI ne peut pas non plus saisir entièrement la complexité du foie humain, et une optimisation supplémentaire en incorporant différents types de cellules (par exemple, les cellules immunitaires) serait bénéfique pour ajouter de la valeur au modèle existant. Cette MPS à organe unique pourrait également être combinée avec d’autres plates-formes d’organes qui peuvent partager un milieu commun et permettre la diaphonie d’organes au niveau cellulaire ou endocrinien, et qui peuvent aider à mieux comprendre les connaissances mécanistes de la toxicité qui ne se limitent pas au foie lui-même. En outre, comme toute technologie relativement nouvelle, elle peut être considérée comme coûteuse et donc d’une accessibilité limitée.

MPS est une plateforme utilisée pour développer des modèles organotypiques de tissus simples ou multi-humains. Le système est composé d’un contrôleur, d’un câble ombilical et d’un pilote MPS dans lequel la plaque est insérée (Figure 5A). Chaque plaque MPS hépatique dispose de 12 puits ouverts indépendants pour la culture de cellules hépatiques primaires en 3D sur des échafaudages artificiels. En résumé, le système est vérifié QC, et les plaques sont amorcées au jour -1, les PHH et les HKC sont ensemencés sur les plaques au jour zéro (Figure 5B, voir 1). Les micropompes intégrées facilitent la circulation des milieux de culture cellulaire à travers les échafaudages pour faciliter la formation de microtissus 3D (Figure 5B, voir 2). Les microtissus formés sont analysés au jour 4, dosés à des concentrations différentes de chaque composé toutes les 48 heures pendant 4 jours et dosés pour les biomarqueurs finaux au jour 8 (figure 5C). La chronologie expérimentale du test DILI dans la plaque MPS est représentée à la figure 5D.

Figure 5: Système microphysiologique et chronologie expérimentale d’un test DILI standard. (A) Le système microphysiologique avec ses composants: contrôleur (1), câble ombilical (2), station d’accueil (3), pilote MPS (4) et plaque LC12 (5). (B) L’ensemencement des PHH et des HKC sur la plaque CL12 au jour 1 (1) et les micropompes intégrées facilitent la circulation des milieux de culture cellulaire avec des débits réglables à travers les microtissus 3D ensemencés sur les échafaudages (2). (C) Démontage des échafaudages à la fin de l’étude. (D) Calendrier expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Lors de l’exécution du protocole, il est important qu’une vérification approfondie du contrôle qualité du système soit effectuée avant le démarrage, que le système fonctionne correctement et que les plaques consommables soient inspectées visuellement et apprêtées efficacement pour assurer un fonctionnement uniforme sur tous les puits. Avoir des cellules humaines primaires de haute qualité est essentiel pour ce protocole, avec des hépatocytes connus pour adhérer de manière constante dans les expériences de culture cellulaire et former des interactions 3D. La décongélation de ces cellules est également une étape critique, car les hépatocytes primaires ne doivent pas être remis en suspension par une action de pipetage, car cela peut rapidement entraîner la mort cellulaire. Une viabilité cellulaire supérieure à 85% est essentielle à la réussite de l’ensemencement, car de grandes quantités de débris cellulaires interféreront avec la formation de microtissus 3D. La vérification du contrôle qualité des microtissus hépatiques formés au jour 4 est également importante, et l’utilisateur doit s’assurer que des niveaux acceptables de LDH et d’urée sont mesurés, car des paramètres hors plage peuvent indiquer une formation tissulaire de mauvaise qualité et permettre un dépannage simple. Enfin, l’hydrocortisone utilisée dans les milieux de culture cellulaire doit être préparée fraîche le jour de l’utilisation pour éviter toute dégradation indésirable qui pourrait avoir un impact sur la fonctionnalité de la culture cellulaire, car elle est nécessaire pour maintenir la fonctionnalité métabolique des hépatocytes.

Malgré sa complexité importante, le MPS hépatique ne contient pas tous les types de cellules du foie humain. Il est possible d’ajouter d’autres types de cellules au modèle^24,29 pour augmenter la pertinence physiologique^, mais ceux-ci ne devraient être ajoutés qu’avec une justification claire du contexte d’utilisation. Pour l’étude DILI PHH sont le type de cellule clé, et l’incorporation de HKC dans ce modèle permet de déterminer certaines réponses immunologiques. Il convient également de noter que les PHH isolés du foie humain et les PHH cryoconservés disponibles dans le commerce ont tendance à présenter certaines variations d’un lot à l’autre. Nous avons démontré ici que ce protocole produit des résultats reproductibles lorsqu’il est utilisé avec des préparations cellulaires de haute qualité. Cependant, on s’attendrait à une certaine variation de lots de lots, et cela pourrait être surmonté davantage en utilisant des lots groupés de donneurs multiples. Ces limitations pourraient être surmontées en utilisant des cellules de type hépatocytes différenciées des CSPi qui récapitulent de nombreuses propriétés fonctionnelles des PHH et qui ont été utilisées dans le processus de développement de médicaments³⁰. Les HKC présentent également une variabilité importante des lots et un niveau élevé d’activation lors du dégel; par conséquent, les donneurs de HKC sont pré-validés à l’interne avant d’être utilisés dans des cultures cellulaires expérimentales (coculture avec des PHH validés) et doivent avoir de faibles niveaux d’activation post-décongélation; ceci est évalué en mesurant les biomarqueurs IL-6 et TNF-alpha (voir Matériel supplémentaire).

Les données présentées ici confirment que le test peut détecter DILI avec précision, aidant à identifier les hépatotoxiques qui pourraient ne pas être détectés par 2D^10,11 et même certains modèles 3D. Les données générées par les MPS ne sont toujours pas utilisées comme norme par l’industrie pharmaceutique pour les présentations réglementaires ou les tests de dépistage de médicaments en raison du manque de normalisation et d’harmonisation des processus, y compris la reproductibilité intersite²⁰. Les données et les approches expérimentales présentées ici abordent ce problème, montrant que le modèle hépatique peut être utilisé de manière routinière et robuste dans les criblages DILI pour prédire avec précision la responsabilité de nouveaux composés.

En mesurant une gamme de paramètres pour produire une « signature d’hépatotoxicité », en aidant à identifier les composés présentant différents niveaux de préoccupation DILI (y compris les composés non détectables par d’autres méthodes in vitro) et leurs mécanismes de toxicité révélés. Cette technologie peut combler l’écart entre la culture cellulaire traditionnelle et les modèles animaux d’un côté et les essais cliniques humains, progressant vers la simulation des conditions biologiques humaines pour l’évaluation préclinique de la toxicité hépatique dans le cadre du processus de développement de médicaments.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CN Bio Innovations Ltd. a financé cette étude.

Materials

24 well cell culture cluster plates flat bottom	Corning	3524
96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic	Greiner	655101
96 well plates black flat bottom	Corning	3915
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	ThermoScientific	165306
Advanced DMEM (1x)	Gibco	12491015	Cell culture media.
AssayMax Albumin ELISA Kit	AssayPro	EA3201-1	Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8.
Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements)	Gibco	CM4000
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9682	Dilution 1:1. Time point Day 8.
Chlorpromazine HCl	Sigma Aldrich	C8138
Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps	ThermoScientific	9-SCK(B)-ST1	glass vial
Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials	ThermoScientific	2-SVW
Class 2 Microbiological Safety Cabinets – Trimat2 1500 exhaust	Contained Air Solutions
Conical tubes 50 mL	Greiner	227261
Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM)	ThermoFisher Scientific	Gibco CM7000
Cryopreserved primary human hepatocytes	BioIVT Europe	Lot. RAS
CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit	Promega	G1781	Dilution – none. Time point Day 4, 6 and 8
>Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration	GraphPad Prism 9
Disposable PES Filter Units 500mL	Fisher Scientific	15913307
Disposable Pipette Basins 50ml	Fisher Scientific	12369175
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	Sigma D2650
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS)	ThermoFisher Scientific	14190-144
Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL	Fisher Scientific	11889640
Foetal bovine serum	Gibco	10500064
Human ALT ELISA Kit	Abcam	ab 234578	Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8.
Human Cryopreserved Kupffer Cells	Lonza Europe	Lot. 190088KC
hydrocortisone	Merck	H0888-1G
Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170.	Eppendorf		All serviced yearly; paperwork available upon request.
Inverted Microscope	Leica DMIL LED
MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC)	CN Bio Innovations Ltd.
MPS LC-12 plate	CN Bio Innovations Ltd.
Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel)	Cambridge Bioscience	DHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System	Promega	V9002	Dilution – none. Time point Day 8
PhysioMimix MPS platform	CN Bio Innovations Ltd.
Pioglitazone	MedChemExpress Tocris	HY-13956/CS-1700
Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems	Bioassay Systems	DY970-05	Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8.
Silica gel	Sigma-Aldrich	S7625
Software used to analyse and generate all the graphs was	GraphPad Prism 9
Stripettes 10 mL	Fisher Scientific	11839660
Stripettes 25 mL	Fisher Scientific	11839181
Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)	Gibco	CM3000
Troglitazone	MedChemExpress Tocris	97322-87-7
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tubes 1.5 mL	Greiner	616201
Weighing balance – model PA214C and AV213C	Ohaus Corp

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Novac, O., Silva, R., Young, L., Lachani, K., Hughes, D., Kostrzewski, T. Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro. J. Vis. Exp. (179), e63389, doi:10.3791/63389 (2022).

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