胚盤胞の開発と移植をモデル化するためのヒト芽球イドのプロトコル

国際幹細胞研究協会(ISSCR)の幹細胞研究および臨床翻訳ガイドラインは、ヒト芽球に関する研究は、専門的な科学的および倫理的レビュープロセスを通じてレビューおよび承認された後にのみ許可されることを推奨しています3,4。すべての実験手順は、オーストリア科学アカデミー(IMBA)の分子バイオテクノロジー研究所(IMBA)のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って、Rivron_Stellungnahme_2020-04-22の承認の下で実施されました。研究成果を科学雑誌に掲載するためには、これらのガイドラインの遵守が必要です。 1. PXGL条件下でのヒトナイーブ胚性幹細胞の培養 注:素朴なhPSCは、関連する研究室から入手することができます。ここで使用したラインは、高島康弘(現京都府CiRA)とオースティン・スミス(現英国エクセターのリビングシステム研究所)の研究室から入手したものです。あるいは、素朴なhPSCは、前述のようにプライミングされたhPSCのラインから社内でリセットすることができる13,14。素朴なhPSCは、複数の継代(>15)で安定に見えますが、培養物の品質は時間の経過とともに変化する可能性があります。素朴なhPSCの品質が低下する場合は、新しい細胞のバイアルを解凍するか、プライミングされたPSCからde novo素朴なhPSCを生成します。すべての培地組成物については、補足表1を参照されたい。 照射マウス胚性フィーダー(MEFs)層の作製 ナイーブhPSCsの継代の前日に、下記の手順に従ってMEF層を照射した6穴細胞培養プレートを作製した。 6ウェル細胞培養プレートを1ウェルあたりPBS中の0.1%ゼラチン1mLでコーティングする。プレートを37°Cで30分間インキュベートする。ゼラチン溶液を除去する。 37°CでMEF培地を調製した。 MEFを37°Cの水浴中で、小さな氷塊だけが残るまで解凍する。P1000ピペットを用いてバイアルの容量を1mLの調製MEF培地で溶解する。 細胞懸濁液を15mLチューブに移す。サスペンションを200 x g で4分間スピンダウンします。上清を吸引し、新鮮なMEF培地(ウェルあたり1.5mLに十分)を加えてMEFペレットを再懸濁する。 細胞計数スライドを使用して細胞を計数し、1ウェルあたり300,000個の細胞を加え、プレートを37°Cの正常性インキュベーターに移す。メモ: 時間の経過とともに MEF がデタッチすると、日常的なメディア変更中に新しい MEF を PXGL メディアに追加できます。 ヒトナイーブ多能性幹細胞の継代 hPSCを継代する前に、顕微鏡下でその形態を確認してください。コロニーは通常、明るく定義された境界線を持つドーム型の形態を有する。個々のコロニーがより平坦な形態を示す場合、または分化したコロニーが出現し始めた場合は、ステップ1.2.8の指示に従ってください。 培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄する。6ウェルプレートのウェルあたり500μLの細胞剥離溶液を加える。 細胞を37°Cで5分間インキュベートする。 P1000ピペットを使用し、細胞を数回ピペットしてコロニーを単一細胞に解離させる。 細胞を集め、洗浄バッファー(6ウェルプレートのウェルあたり1 mL)を含む15 mLチューブに移します。細胞を200 x g で4分間スピンダウンします。 上清を吸引し、ペレットを新鮮なPXGL培地(ウェルあたり1.5mLに十分)に再懸濁する。日常的に継代するために、1:3-1:6の分割比を検討してください。注:3〜4継代ごとに、または細胞形態に基づいて細胞培養の品質が低下する場合(例えば、集団内の扁平なコロニーの出現)、継代後最初の24時間の間に10μM Y-27632および成長因子基底膜抽出物(5μL/ウェル)を培地に加える。 hPSCを再めっきする前に、MEF培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄することによって、新鮮なMEFでプレートを準備する。次いで、P1000ピペットを使用して、MEFsを含む6ウェルプレートのウェル当たり1.5mLのhPSCs細胞懸濁液を移す。注: ピペッティングによって、ウェル領域全体に細胞が均質に播種されることを確認します。これにより、均質なサイズと細胞の相対的な同期性を有するコロニーの成長が保証される。 hPSCsを加湿環境下、37°Cで低酸素条件下で培養する。24時間後、hPSCを取り付ける必要があります。多数の非付着性(または浮遊性)細胞は、継代時の生存率または付着の問題を反映している。 1ウェルあたり1.5 mLのPXGL培地で毎日培地を交換してください。hPSCを3〜4日ごとに通過させるか、ブラストイド形成実験に使用する。注:hPSCを解凍した後、ブラストイド実験を開始する前に、少なくとも3つの継代のためにそれらを継代してください。 2. 芽球の形成 素朴なPSC凝集体の形成 実験を開始する前に、PXGL培地、N2B27基礎培地、洗浄バッファー、PBS、および凝集培地を準備し、予備温めてください。以下に説明する手順に従って、ブラストイドを形成するためのhPSCs懸濁液からMEFを除外する。 MEF排除のために、6ウェルプレートのウェルに0.1%ゼラチン1mLを添加し、37°Cで30〜90分間インキュベートすることにより、ゼラチンコーティングプレートを作製した。 細胞を回収するには、培地を吸引し、1mLのPBSで細胞を洗浄する。 500 μLの細胞剥離溶液(6ウェルプレートのウェルあたり)を加え、37°Cで5分間インキュベートした。 顕微鏡下で細胞をチェックして、コロニーの単一細胞への解離を追跡します(いくつかの多細胞凝集塊は、後で穏やかなピペッティングによって解離することができます)。 細胞剥離溶液を1mLの洗浄緩衝液で希釈する。プレートから細胞を5〜10回穏やかにピペッティングすることによって集める。細胞懸濁液を15mLチューブに移す。細胞を200 x g で4分間スピンダウンします。 上清を吸引し、細胞を1.5 mLのPXGL培地(6ウェルプレートのウェルあたり)に再懸濁し、MEF排除のためにゼラチンコーティングプレートに細胞を播種し、37°Cで60〜90分間インキュベートする。 MEF排除のためにナイーブ細胞を播種したら、マイクロウェルからPBSを除去し、200μLの基礎N2B27培地(マイクロウェルチップ1個あたり)でウェルを平衡化し、37°Cで60分間インキュベートする。 未接続のナイーブ細胞を含む上清を収集し、それを15mLチューブに移し、細胞を200 x g で4分間スピンダウンする。 培地を吸引し、細胞を1mLのN2B27基礎培地に再懸濁する。セルカウントスライドを使用してセルをカウントします。細胞を200 x g で4分間スピンダウンします。 培地を吸引し、N2B27培地に含まれる10 μM Y-27632を適量加えると、50 μLあたり30,000細胞の細胞密度を得た。注:最適な初期播種細胞数は、異なる細胞株間で変化し得る。例えば、50~60個の細胞/マイクロウェルを播種するには、30,000個の細胞(一部の細胞がマイクロウェルの外側にあることを考慮すると余剰を含む)を、430個のマイクロウェルを含む96ウェルプレートの1ウェルに播種する。不適切な開始細胞数は、空洞のない小さな凝集体形成または250μm以上に達するキャビテーション構造の形成をもたらし得る。 平衡化したマイクロウェルアレイから培地を吸引し、25 μLのN2B27培地を10 μM Y-27632とともに加える。50 μLの細胞懸濁液を加え、37°Cで15分間(細胞がマイクロウェルの底に落ちるまで)インキュベートする。次いで、10μM Y-27632を添加したN2B27培地を125 μL加える。 ブラストイド発生 24時間以内に、ナイーブhPSCの凝集体がマイクロウェルチップ上に観察され得る(0日目)。ブラストイド形成を開始するには、PALY培地を調製し、以下に概説する手順に従ってください。 PALY培地を37°Cで30分間予備加温する。注:1-オレオイルリゾホスファチジン酸(LPA)および10μM Y-27632は、使用直前に添加する必要があります。LPAの最適濃度は0.5〜5μMの間で変化する。これは、ブラストイドに使用される個々のhPSCラインに対して滴定する必要があります。 凝集媒体を吸引する。200 μLの予備加温したPALY培地をマイクロウェルに加える。細胞培養プレートを37°Cの低酸素インキュベーターに戻した。 1日目にメディアの変更を繰り返します。 2日目に、PALY培地を除去し、LPAおよび10μM Y-27632を添加したN2B27培地を200μL加える。注: 2 日目も、集計の大部分は増加し続けています。しかし、いくつかの凝集体は小さな空洞を形成する。4日目までPALYでブラストイドを連続的に培養するか、2日目以降から in vitro 培養液(IVC1)で培養する。しかし、この培地変化に続いて、成熟した芽球におけるPrEの形成が増強される。 3日目にメディアの変更を繰り返します。完全な芽球形成は4日目までに起こる。注:胚盤状は、7日目のヒト胚盤胞の形態測定法(例えば、直径150-250μmの範囲;栄養胚葉様細胞の上皮に囲まれた1つの内部クラスター)に基づく完全な形態形成を受け、極性栄養胚葉様細胞(NR2F2+/CDX2-)およびPrE様細胞(GATA4+)を形成したときに完全に発達したと考えられる。これは、免疫蛍光染色または蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて評価することができる。 3. 96ウェル超低付着マイクロプレートにおけるブラストイドの形成 上記の2.1.1~2.1.11の手順に従って、ブラスト様形成用のナイーブhPSC細胞懸濁液を調製する。 培地を吸引し、10 μM Y-27632を含むN2B27培地を適量加えて、培地100 μLあたり70細胞の細胞密度を得た。注:最適な初期播種細胞数は、異なる細胞株間で異なり得る。たとえば、70細胞/ウェルは、ほとんどの細胞株にとって最適な細胞数となり得る。 プレートを室温で200 x g で2分間遠心分離し、ウェルの底に細胞をクラスター化します。 プレートを低酸素培養条件下で37°Cのインキュベーター内でインキュベートする。24時間以内に、ナイーブhPSCの凝集体が井戸上に観察され得る(0日目)。 2倍のPALLY培地を用意する。予温した2x PALY培地100 μLをウェルに加える。 細胞培養プレートを37°Cの低酸素インキュベーターに戻す。 24時間後、培地の半分(100 μL)を吸引し、100 μLの予温したPALY培地と交換する。4日目までこの手順を繰り返します。アグリゲートを吸引しないようにしてください。注: 2 日目も、集計の大部分は増加し続けています。しかし、いくつかの凝集体は、小さな液体充填空洞を有する。4日目に、キャビテーションされた構造の大部分は完全な形態形成を受け、胚盤胞様構造を形成する。 4. 対流圏の形成 対流圏形成のためには、ステップ2.1.1(MEF排除)からステップ2.1.12(播種プロトコルの最後のステップ)までのブラストイド形成プロトコルに従う。 24時間後にナイーブhPSCの凝集体が形成されたら、初期対流球を表す対流球圏の形成のために3μM SC-144を添加したPALY(LIFなし)と凝集培地を交換し、成熟した対流球を表す対流球圏の形成のために2μM XMU-MP-1を添加したPALYと交換する。 メディアを毎日リフレッシュします。完全な対流圏形成は4日目までに起こる。 5. scRNAseqを用いた芽球様細胞の状態とその反射ステージの解析 ブラストイドを拾い上げて解離を行うには、振とう培養器を37°Cに温め、100rpmに設定してください。 最初の96ウェルプレートからブラストイドを収集し、ガラスキャピラリーを備えたマウスピペットを使用して、U底96ウェルプレートの複数のウェルに移します。注:非ブラストイド構造(>30%)による汚染を避けるために、形態測定基準(サイズ= 150-250μm、固有の内部クラスターを持つ)に基づいてブラストイド(<70%)を選択する必要があります。 実体顕微鏡下で観察することによりP200を用いて200μLのPBSで1回洗浄する。50 μLのコラゲナーゼを含むウェルに移し、振とうインキュベーター内で30分間インキュベートする。 ブラストイドを100 μLの10倍トリプシン-EDTAを含むウェルに移し、よく混合する。振とうインキュベーター内で20分間インキュベートする。 P200ピペットを用いてブラストイドを単一細胞に解離させる。FACS緩衝液(PBS中の1S)を用いて細胞を15mLチューブに移す。 3つの系統の類似体の特異的比を捕捉するために、TEおよびPrE類似体をそれぞれTROP2およびPDGFRa抗体で染色する。注:ヒト胚盤胞中のPrE細胞の数は、マウス胚盤胞と比較して少なく、これは 体外 受精(IVF)によって形成された胚盤胞の発生欠陥または種差を反映している可能性がある。芽球において、PrE類似体はTEおよびEPI類似体よりも豊富ではなく、免疫蛍光イメージングによるGATA4+細胞の計数時に細胞の7.4%を表す。また、解離プロセスは、ブラスト様解離時に細胞の1%〜2%を表すPrE類似体として異なる細胞型の割合に偏りを誘発する可能性があり、PDGFRaタグ付けおよび、FACS分析。 FACSは、3つの系統類似体すべてから細胞を、smart-seq2分析用の溶解バッファーを含む384プレートに選別します。DAPI染色(製造元の指示に従って実施)によってマークされた死細胞を除外する。 細胞状態(細胞型および発生段階)を評価するには、ブラストイドからのトランスクリプトームデータを適切な対照と比較する。 6. 芽球発生の進行を評価するための培養の延長 ヒト芽球を基底膜マトリックスコーティングプレート(ガラス底)上で培養する。 プレートを基底膜マトリックスでコーティングします。 ブラストイドを目視で検査して、形態を評価および記録します。注:コンパクトなICMで古典的な中空ボール胚盤胞の形態を示す胚盤状のみが、さらに成長し、発達する可能性を秘めています。 96ウェルプレートの1ウェルあたり100μLのCMRL培地-1を加え、平衡化のためにブラストイドが移入される少なくとも2時間前にプレートをインキュベーターに入れます。 実体顕微鏡を用いて、良好な形態を有する胚盤状を目視で同定し、選択した胚盤状体を100μlのCMRL培地−1を含む96ウェルプレートのウェルに移し、胚盤状媒体の痕跡を除去した。 ブラストイドを、予め平衡化したCMRL培地-1を含むウェルに移す。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cで一晩インキュベートします。注:最大5つのブラストイドを96ウェルプレートの1ウェルで培養することができます。1つのウェルにあまりにも多くのブラストイドを有すると、複数のブラストイドの凝集体が形成される可能性がある。 翌日、顕微鏡下でブラストイドを目視検査する。ブラストイドが付着している場合は、5%基底膜マトリックスを添加した100μLの予め平衡化したCMRL培地-1を加える。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cで一晩インキュベートした。 翌日、顕微鏡下でブラストイドをモニターする。培地の半分(100 μL)を除去し、5%基底膜マトリックスを添加した100 μLの予め平衡化したCMRL培地-2と交換する。 翌日、培地の半分(100μL)を、5%基底膜マトリックスを添加した予め平衡化したCMRL培地-3と交換する。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cで一晩インキュベートした。 体外 培養を最大4〜6日間毎日繰り返す。注: インビトロ 培養ヒト胚の13日目に相当する時間に相当する延長培養条件で、ブラストイドを最大6日間培養した。 7. 芽球の免疫染色 媒体を吸引する。サンプル3xをPBSで5分間洗浄する。 PBSに200μLの冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、室温で30分間サンプルを固定する。PFA溶液を除去し、サンプル3xをPBSで10分間洗浄する。注: ブラストイドをマイクロウェルチップで培養した場合は、以下の手順でチップから 96 ウェル U ボトムプレートにブラストイドを移します。 1ウェルあたり100 μLのブロッキング溶液(0.3%Triton-X 100および10%ノーマルロバ血清を含むPBS)でブラストイドを透過処理し、60分間ブロックします。注:抗体の宿主種に応じて、それに応じて血清を適応させる。 ブロック ソリューションを削除します。新鮮なブロッキング溶液で希釈した一次抗体100 μLを加え、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。注:一次抗体の濃度は、製造元の指示に基づいて決定する必要があります。 サンプル3xをPBS(洗浄溶液)中の0.1%Triton-X 100で10分間洗浄する。ブロッキング溶液に100 μLの二次抗体を20 μg/mLのヘキスト核染色剤とともに加え、サンプルを室温で1時間インキュベートします。サンプルを光から保護します。注:二次抗体の濃度は、製造元の指示に基づいて決定する必要があります。 サンプル3xを洗浄液で10分間洗浄する。イメージングのために、サンプルをPBSでスライドμガラス底に移します。メモ:取り付け媒体は、イメージングに使用する目的に基づいて選択する必要があります。例えば、PBS中の80%グリセロールは、油目的を使用しながらサンプルをマウントするために使用することができる。