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Developmental Biology

Protocole pour le développement et l’implantation de blastoïdes humains

Published: August 10, 2022
doi:
10.3791/63388
, , , , , , ,
1Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA),Vienna Biocenter (VBC), 2Institute of Molecular Pathology (IMP),Vienna Biocenter (VBC), 3Vienna BioCenter PhD Program,Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

Summary

Un protocole décrivant la formation de blastoïdes humains qui génèrent efficacement, en temps opportun et séquentiellement des cellules de type blastocyste.

Abstract

Un modèle du blastocyste humain formé à partir de cellules souches (blastoïde) soutiendrait les progrès scientifiques et médicaux. Cependant, son pouvoir prédictif dépendra de sa capacité à récapituler efficacement, opportunément et fidèlement les séquences de développement des blastocystes (morphogenèse, spécification, modelage) et à former des cellules reflétant le stade de blastocyste. Nous montrons ici que les cellules souches pluripotentes humaines naïves cultivées dans des conditions PXGL puis tripo-inhibées pour l’hippopotame, transformant le facteur de croissance β, et les voies kinases extracellulaires régulées par le signal subissent efficacement une morphogenèse pour former des blastoïdes (>70%). En fonction du calendrier de développement (~ 4 jours), les blastoïdes déroulent la séquence de spécification des blastocystes en produisant des analogues du trophoblaste et de l’épiblaste, suivis de la formation d’analogues de l’endoderme primitif et des trophoblastes polaires. Il en résulte la formation de cellules transcriptionnellement similaires au blastocyste (>96%) et une minorité d’analogues post-implantation. Les blastoïdes se dessinent efficacement en formant l’axe embryonnaire-abémbryonique marqué par la maturation de la région polaire (NR2F2+), qui acquiert le potentiel spécifique de se fixer directionnellement aux cellules de l’endomètre stimulées hormonalement, comme in utero. Un tel blastoïde humain est un modèle évolutif, polyvalent et éthique pour étudier le développement humain et l’implantation in vitro.

Introduction

Le manque de modèles expérimentaux a limité la compréhension de l’embryogenèse humaine précoce. Les connaissances actuelles sur les aspects spécifiques à l’homme du développement embryonnaire proviennent d’embryons excédentaires de fécondation in vitro (FIV) donnés pour la recherche. Cependant, la disponibilité limitée, les difficultés des manipulations expérimentales et la qualité variable des embryons entravent les recherches scientifiques. Au contraire, un modèle in vitro fidèle d’embryons humains permettrait des manipulations expérimentales complexes, offrant ainsi une opportunité éthique de compléter la recherche sur les embryons humains 1,2,3,4. Un modèle précédemment développé de blastocystes de souris combinait des cellules souches embryonnaires de souris et des cellules souches trophoblastiques5. Dans ce protocole détaillé, une méthode pour générer un modèle du blastocyste humain à partir de cellules souches pluripotentes naïves et fidèle aux critères élémentaires du blastocyste est décrite6.

Quatre critères pour les blastoïdes humains. Ici, dans une tentative d’établir une définition standardisée des blastoïdes humains, nous proposons quatre critères minimaux. Bien qu’ils ne soient pas exhaustifs, ces critères pourraient servir de base pour évaluer les paramètres qui permettent la formation de blastoïdes humains (figure 1A). (1) Les blastoïdes devraient se former efficacement en termes de morphologie et de génération des analogues des trois lignées, à savoir l’épiblaste (Epi), le trophectoderme (TE) et l’endoderme primitif (PrE). L’inefficacité est susceptible de pointer vers un état cellulaire initial inadéquat et/ou un état de culture inadéquat (p. ex., milieu blastoïde). (2) Les blastoïdes doivent générer des analogues des trois lignées en fonction de la séquence de développement (Epi/TE en premier, PrE/polarTE en dernier)7,8 et du moment (induction ~ 3 jours; jours embryonnaires 5-7)7,9. (3) Les blastoïdes doivent former des analogues du stade blastocyste, mais pas des stades post-implantation (par exemple, épiblaste post-implantation, trophoblaste ou cellules amnion). (4) Enfin, les blastoïdes devraient être capables de récapituler les caractéristiques fonctionnelles de l’implantation et du développement des blastocystes. En utilisant ce protocole, les blastoïdes humains se forment efficacement en utilisant plusieurs lignées cellulaires (>70%), sont capables de générer les analogues cellulaires des blastocystes séquentiellement et dans les 4 jours, et les analogues sont transcriptionnellement similaires au stade blastocyste (>96% sur la base de plusieurs analyses)6,10,11. Enfin, les blastoïdes génèrent de manière robuste l’axe embryonnaire-abémbryonique, ce qui leur permet d’interagir avec les cellules de l’endomètre stimulées hormonalement à travers la région polaire et d’étendre de manière robuste les lignées lors d’une culture prolongée (équivalent temporel: jour embryonnaire 13).

L’importance de l’état initial de la cellule. Les cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) peuvent être stabilisées dans différents états qui tentent de capturer des stades de développement précis. Ces états sont maintenus par des conditions de culture qui, bien que toujours sous-optimales, contraignent les cellules dansun stade épiblastique préimplantatoire (~ jours embryonnaires 5-7) ou post-implantation (~ jours embryonnaires 8-14). L’analyse transcriptomique a montré que les CSEh cultivés dans PD0325901, XAV939, Gö6983 et le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF; appelé hPSC naïf PXGL)13,14 sont plus similaires à l’épiblaste blastocyste par rapport aux CSH cultivées dans le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 2 et l’activine15 (appelées hPSC amorcées12) et aux cellules souches pluripotentes étendues humaines (hEPSC)16 (voir l’analyse dans les références17, 18,19). En conséquence, le transcriptome des CSEh amorcé correspond le mieux à une épiblaste de singe cynomolgus post-implantation/pré-gastrulation20. Des critères moléculaires supplémentaires, tels que l’expression du transposon, la méthylation de l’ADN et l’état du chromosome X, ont confirmé que les variations de l’état naïf ressemblent davantage à l’épiblaste de blastocyste qu’à l’état amorcé17,21. Enfin, des lignées de CSEh naïfs ont été dérivées avec succès directement de blastocystes en utilisant les conditions de culture PXGL22.

Les cellules blastocystes précoces humaines ne sont pas encore engagées. La spécification de la lignée murine se produit à partir du stade morula qui précède le stade blastocyste23. Au contraire, des expériences de dissociation et de réagrégation ont montré que les cellules trophectodermiques humaines des blastocystes précoces ne sont pas encore engagées24. En conséquence, l’analyse des cellules des blastocystes humains par séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) a montré que la première spécification de lignée (trophoblaste/épiblaste) se produit après la formation de la cavité blastocyste7. Cette spécification humaine différée est en corrélation avec les observations selon lesquelles les CSEh sont puissants pour formerdes trophoblastes 25,26,27 lorsque les CSP de souris sont largement engagés dans la lignée épiblastique. Ces observations combinées ont conduit à la possibilité que les CSH naïfs reflètent un stade de blastocyste et conservent le potentiel de former les trois lignées de blastocystes. Dernièrement, la puissance des CSEh pour spécifier des analogues extraembryonnaires a été proposée pour passer du trophectoderme à l’amnion au cours de la progression de l’état naïf à l’état amorcé27. Ainsi, les HSPC naïfs sont plus similaires au stade préimplantatoire 17,18,21 et ont une capacité accrue à former des trophoblastes par rapport aux hPSC27 amorcés, aux hEPSC16 ou aux états reprogrammés intermédiaires28, qui sont susceptibles de former des analogues post-implantation10 (Figure 1B ). L’état cellulaire initial est donc crucial pour former les analogues extraembryonnaires appropriés. Bien qu’une analyse côte à côte approfondie des analogues du trophectoderme convertis reste à faire, un état naïf PXGL reflétant le blastocyste précoce semble important pour former des blastoïdes haute fidélité.

Incitation à la spécification et à la morphogenèse en signalant l’inhibition des voies. L’inhibition de la voie de signalisation Hippo est un mécanisme conservé conduisant à la spécification des trophoblastes chez les souris, les vaches et les humains 9,29,30. Aussi, depuis 2013, on sait que l’inhibition du NODAL (A83-01) et de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK; PD0325901 ou équivalent) et l’activation des voies de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) déclenchent des CSH amorcés pour activer le réseau transcriptionnel associé à la lignée trophoblastique 25,31,32,33,34. De plus, récemment, plusieurs rapports ont également confirmé que l’inhibition des voies NODAL et ERK et l’activation de la BMP facilitent la différenciation des trophoblastes des CSH naïfs 25,31,32,33,34. Enfin, si la spécification des trophoblastes est déclenchée à partir d’un état naïf, les cellules récapitulent les aspects de la progression développementale du trophectoderme26. Cependant, les lignes auto-renouvelantes reflétant le trophectoderme blastocyste n’ont pas été stabilisées in vitro. Selon la spécification des trophoblastes, l’induction du facteur de croissance épidermique (EGF) et des voies de signalisation Wnt ainsi que l’inhibition du HDAC pourraient faciliter la progression du développement des trophoblastes 34,35 et stabiliser les cellules en lignées de cellules souches trophoblastiques humaines (cSH) reflétant les cytotrophoblastes post-implantation 18,35. De telles lignées peuvent être dérivées à la fois de blastocystes et de tissus placentaires35.

La deuxième lignée extraembryonnaire, appelée PrE, est spécifiée d’après les trophoblastes et provient de l’épiblaste 7,9. Contrairement à la PrE36 murine, on pense que la contrepartie humaine est indépendante de la signalisation FGF37,38. Des lignes reflétant l’endoderme extraembryonnaire (appelé nEnd) ont été établies à partir de CSEh naïfs par induction de voies de signalisation à l’aide de l’activine A, Wnt et LIF39. Incompatible avec les expériences d’inhibition embryonnaire, il a été démontré que l’inhibition de l’ERK empêche la formation de telles cellules nEND in vitro39. Jusqu’à présent, de telles lignées n’ont pas été dérivées directement de blastocystes.

Dernièrement, des modèles de l’embryon précoce ont été formés en combinant des variations des milieux précédemment développés pour les hTSC35 et les cellules nEND39, utilisant ainsi des activateurs des voies de signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β), EGF et Wnt28,40. Ces modèles embryonnaires se forment à faible efficacité (10%-20%) et forment des cellules ressemblant au stade post- plutôt qu’au stade préimplantatoire10, y compris des analogues de l’épiblaste post-implantation, du trophoblaste, de l’amnion, de la gastrula, des tissus mésodermiques (~ jour embryonnaire 14) et des cytotrophoblastes10. Au contraire, une triple inhibition des voies Hippo, ERK et TGF-β guide efficacement la formation de blastoïdes comprenant des cellules de type blastocyste41. Avec l’état cellulaire initial, nous proposons que l’inhibition des voies triples (Hippo, ERK, TGF-β) est le deuxième paramètre essentiel pour former des blastoïdes haute fidélité (Figure 1B).

Évaluation de l’état de la cellule et de l’étape réfléchie à l’aide de scRNAseq. Les états des cellules composant des blastoïdes peuvent être évalués par l’analyse scRNAseq. Leur similitude transcriptionnelle avec des stades embryonnaires spécifiques peut être mesurée à l’aide de cellules blastoïdes seules et par comparaison avec des CSEh ou des CSEh amorcés qui reflètent les stades post-implantation20,35. L’exécution d’analyses de grappes à l’aide de différents niveaux de définition révèle comment les sous-populations fusionnent progressivement lorsque la définition diminue, révélant ainsi les similitudes des grappes. Bien que l’optimalité du nombre de grappes puisse être mesurée42, le regroupement à haute résolution renseigne également sur la présence éventuelle de petites sous-populations anormales, reflétant par exemple les stadespost-implantation 10. Les gènes exprimés différemment entre les grappes peuvent fournir des informations sur leurs analogues dans le processus de développement en évaluant les niveaux d’expression des ensembles de gènes de référence qui définissent les lignées spécifiques aux stades. Cela permet de mesurer l’enrichissement des sous-populations de blastoïdes soit par des cartes de distance non supervisées (par exemple, en utilisant des gènes enrichis par le haut), soit par analyse d’enrichissement d’ensembles de gènes (GSEA)43. En utilisant ce protocole blastoïde, seuls trois amas principaux se forment qui reflètent transcriptionnellement les trois lignées de blastocystes. Un groupe comprend à la fois les HSPC naïfs initiaux et l’analogue épiblastique des blastoïdes. L’analyse des cellules à différents moments a montré la nature séquentielle de la spécification des lignées (les trophoblastes commencent à se spécifier dans les 24 heures et les cellules endodermiques primitives dans les 60 heures). Un regroupement à haute résolution a capturé une sous-population de cellules (3,2%) exprimant des gènes spécifiques aux embryons au stade de la gastrulation (éventuellement mésoderme ou amnion). Il convient de noter que les CSH naïfs initiaux comprenaient également 5 % de cellules de type post-implantation, comme décrit précédemment44. Dans une deuxième analyse, les cellules blastoïdes peuvent être fusionnées in silico avec des cellules de référence isolées de concepti à différents stades 45,46,47 afin d’en déduire l’équivalence d’étape. Ici, des cellules isolées à partir de concepti45,46 préimplantatoires, des blastocystes cultivés in vitro 45 et des embryons au stade de gastrulation47 ont été utilisés comme points de référence. En utilisant ce protocole, il a été quantifié que les cellules blastoïdes dépareillées révélées par le regroupement à haute résolution se regroupent en effet avec le mésoderme et l’amnion post-implantation. Dans les étapes futures, l’analyse comparative du transcriptome devrait être complétée par une analyse de l’expression des transposons, de la méthylation de l’ADN et du statut du chromosome X qui fournissent également des repères des stades de développement21.

Évaluation de la formation d’axes et d’autres fonctionnalités des blastoïdes humains. Un blastocyste mature est caractérisé par la formation de l’axe embryonnaire-abémbryonique modelant des trophoblastes pour l’implantation. En utilisant ce protocole blastoïde, un axe se forme de manière robuste illustrée par une maturation des trophoblastes proximaux (par exemple, NR2F2+/CDX2-) qui acquièrent la capacité de se fixer aux cellules organoïdes de l’endomètre uniquement lorsqu’elles sont stimulées hormonalement48,49. La comparaison avec les trophosphères qui ne forment pas l’épiblaste montre que ces cellules internes induisent des trophoblastes adjacents à mûrir de manière à médier l’attachement initial à l’endomètre. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture étendu conçu pour les blastocystes de singe cynomolgus50, les trois lignées du blastoïde se développent constamment pendant six jours supplémentaires (équivalent au jour 13), bien que leur organisation ne reflète pas ce stade de développement.

L’implication des blastoïdes humains à haute efficacité et haute fidélité. La conservation des principes de développement qui ont été découverts dans des organismes modèles est intrinsèquement difficile à tester dans le conceptus humain en raison de l’accès restreint et des difficultés techniques à le manipuler génétiquement et physiquement. Un modèle blastoïde à haute efficacité et haute fidélité permettrait des criblages génétiques et médicamenteux à haut débit, qui sont à la base des découvertes scientifiques et biomédicales. En outre, l’incorporation de modifications génétiques complexes pour modifier et enregistrer les processus biologiques compléterait ces études. Dans l’ensemble, nous proposons que la triple inhibition (Hippo, TGF-β, ERK) des hPSC PXGL naïfs soit conductrice pour la formation efficace de blastoïdes humains haute fidélité répondant aux quatre critères minimaux. La nature évolutive et polyvalente de ce protocole le rend apte à générer des hypothèses ciblées qui peuvent ensuite être validées à l’aide de blastocystes humains. En tant que tels, les blastoïdes humains ne remplaceront pas l’utilisation du conceptus humain pour la recherche in vitro , mais pourraient agir comme un moyen puissant de canaliser la recherche par des approches expérimentales auparavant inaccessibles au cœur du processus de découverte scientifique et biomédicale. Le protocole montre comment former des blastoïdes humains et aussi comment analyser les cellules contenues dans le blastoïde.

Protocol

Les Lignes directrices pour la recherche sur les cellules souches et l’application clinique de l’International Society for Stem Cell Research (ISSCR) recommandent que la recherche sur les blastoïdes humains ne soit autorisée qu’après examen et approbation dans le cadre d’un processus d’examen scientifique et éthique spécialisé 3,4. Toutes les procédures expérimentales ont été menées en suivant les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Institut de biotechnologie moléculaire de l’Académie autrichienne des sciences (IMBA) sous l’approbation Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Le respect de ces lignes directrices est nécessaire pour publier les résultats de recherche dans des revues scientifiques. 1. Culture de cellules souches embryonnaires naïves humaines dans l’état PXGL REMARQUE: Les CSEh naïfs peuvent être obtenus auprès des laboratoires concernés. Les lignes utilisées ici ont été obtenues dans les laboratoires de Yasuhiro Takashima (actuellement au CiRA, Kyoto, Japon) et d’Austin Smith (actuellement au Living Systems Institute, Exeter, Royaume-Uni). Alternativement, les CSEh naïfs peuvent être réinstallés en interne à partir de lignes de CSEh amorcés comme décrit précédemment13,14. Les CSH naïfs semblent stables pour plusieurs passages (> 15), mais la qualité de la culture peut varier au fil du temps. Si la qualité des CSEh naïfs diminue, décongelez un nouveau flacon de cellules ou générez des CSEh naïfs de novo à partir de CSP amorcés. Pour toutes les compositions de supports, voir le tableau supplémentaire 1. Préparation de la couche d’alimentation embryonnaire (MEF) de souris irradiée La veille du passage des CSEh naïfs, préparez une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec des couches de MEF irradiées en suivant les étapes décrites ci-dessous. Enduisez une plaque de culture cellulaire de 6 puits avec 1 mL de gélatine à 0,1 % dans du PBS par puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min. Retirez la solution de gélatine. Préparer le milieu MEF à 37 °C. Décongelez les MEF au bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une petite touffe de glace. Dissoudre le volume du flacon avec 1 mL de milieu MEF préparé à l’aide d’une pipette P1000. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Faire tourner la suspension à 200 x g pendant 4 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de MEF en ajoutant un milieu MEF frais (suffisant pour 1,5 mL par puits). Comptez les cellules à l’aide de lames de comptage cellulaire et ajoutez 300 000 cellules par puits et transférez la plaque dans un incubateur normoxy à 37 °C.REMARQUE: Si les MEF se détachent au fil du temps, de nouveaux MEF peuvent être ajoutés dans le support PXGL lors du changement de support de routine. Passage de cellules souches pluripotentes naïves humaines Avant de passer les CSEh, vérifiez leur morphologie au microscope. Les colonies ont généralement une morphologie en forme de dôme avec des bordures lumineuses et définies. Si les colonies individuelles présentent une morphologie plus plate ou si des colonies différenciées commencent à émerger, suivez les instructions de l’étape 1.2.8. Aspirer le milieu et laver les cellules avec PBS une fois. Ajouter 500 μL de solution de détachement cellulaire par puits d’une plaque de 6 puits. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C. Utilisez une pipette P1000 et pipetez les cellules plusieurs fois pour dissocier les colonies en cellules uniques. Prélever les cellules et les transférer dans un tube de 15 mL contenant un tampon de lavage (1 mL par puits d’une plaque de 6 puits). Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 4 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu PXGL frais (suffisant pour 1,5 mL par puits). Considérons un rapport de fractionnement de 1: 3-1: 6 pour le passage de routine.REMARQUE: Après chaque 3-4 passages ou si la qualité de la culture cellulaire diminue en fonction de la morphologie cellulaire (par exemple, l’émergence de colonies plates dans la population), ajouter 10 μM Y-27632 et l’extrait de membrane basale du facteur de croissance (5 μL / puits) au milieu pendant les 24 premières heures après le passage. Avant de replaquer les hPSC, préparez les plaques avec des MEF frais en aspirant le milieu MEF et en lavant les cellules une fois avec pbS. Ensuite, utilisez une pipette P1000 pour transférer 1,5 mL de suspension de cellule hPSCs par puits d’une plaque de 6 puits contenant les MEF.REMARQUE: Assurez-vous que le pipetage conduit à un ensemencement homogène des cellules à travers la zone du puits. Cela assurera la croissance de colonies de tailles homogènes et de synchronisation relative des cellules. Cultiver des CSEh dans des conditions hypoxiques à 37 °C dans un environnement humidifié. Après 24 h, les CSEh doivent être attachés. Un nombre élevé de cellules non adhérentes (ou flottantes) reflètent un problème de viabilité ou d’attachement au passage. Changer de milieu avec 1,5 mL de milieu PXGL par puits par jour. Passez les CSH tous les 3-4 jours ou utilisez-les pour des expériences de formation de blastoïdes.REMARQUE: Après avoir décongelé les cSEh, passez-les pendant au moins trois passages avant de commencer une expérience de blastoïde. 2. Formation de blastoïdes Formation d’agrégats naïfs de CFP Préparez et préchauffez le milieu PXGL, le milieu basal N2B27, le tampon de lavage, le PBS et le milieu d’agrégation avant de commencer l’expérience. Exclure les MEF de la suspension des hPSC pour la formation de blastoïdes en suivant les étapes décrites ci-dessous. Pour l’exclusion meF, préparer une plaque enduite de gélatine en ajoutant 1 mL de gélatine à 0,1 % dans le puits d’une plaque à 6 puits et en incubant à 37 °C pendant 30 à 90 min. Pour récolter les cellules, aspirez le milieu et lavez les cellules avec 1 mL de PBS. Ajouter 500 μL de solution de détachement cellulaire (par puits d’une plaque de 6 puits) et incuber à 37 °C pendant 5 min. Vérifiez les cellules au microscope pour suivre la dissociation des colonies en cellules uniques (quelques amas multicellulaires peuvent être dissociés plus tard par pipetage doux). Diluer la solution de détachement cellulaire avec 1 mL de tampon de lavage. Prélever les cellules de la plaque en pipetant doucement 5 à 10 fois. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 4 min. Aspirer le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 1,5 mL de milieu PXGL (par puits d’une plaque de 6 puits) et ensemencer les cellules sur les plaques recouvertes de gélatine pour l’exclusion meF et incuber à 37 °C pendant 60-90 min. Une fois que les cellules naïves sont ensemencées pour l’exclusion meF, retirez le PBS des micropuits et équilibrez les puits avec 200 μL de milieu basal N2B27 (par 1 puce de micropuit) et incubez pendant 60 min à 37 °C. Recueillir le surnageant contenant les cellules naïves non attachées, le transférer dans un tube de 15 mL et faire tourner les cellules à 200 x g pendant 4 min. Aspirer le milieu et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu basal N2B27. Comptez les cellules à l’aide de diapositives de comptage de cellules. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 4 min. Aspirer le milieu et ajouter une quantité appropriée de 10 μM Y-27632 contenue dans le milieu N2B27 pour obtenir une densité cellulaire de 30 000 cellules par 50 μL.REMARQUE: Le nombre optimal de cellules d’ensemencement initial peut varier entre les différentes lignées cellulaires. Par exemple, pour ensemencer 50 à 60 cellules / micropuit, 30 000 cellules (y compris les surplus étant donné que certaines cellules tombent à l’extérieur du micropuit) sont ensemencées dans 1 puits de 96 plaques de puits qui contient 430 micropuits. Un nombre de cellules de départ inapproprié peut entraîner la formation d’un petit agrégat sans cavité ou la formation d’une structure cavité atteignant plus de 250 μm. Aspirer le milieu à partir de réseaux de micropuits équilibrés et ajouter 25 μL de milieuX N2B27 avec 10 μM Y-27632. Ajouter 50 μL de suspension cellulaire et incuber à 37 °C pendant 15 min (jusqu’à ce que les cellules tombent au fond du micropuit). Ensuite, ajoutez 125 μL de milieu N2B27 complété par 10 μM Y-27632. Développement de blastoïdes Dans les 24 heures, des agrégats de CSH naïfs peuvent être observés (jour 0) sur la puce de micropuit. Pour initier la formation de blastoïdes, préparez le milieu PALLY et suivez les étapes décrites ci-dessous. Milieu PALLY préchauffant à 37 °C pendant 30 min.REMARQUE: L’acide 1-oléoyl lysophosphatidique (LPA) et 10 μM Y-27632 doivent être ajoutés juste avant utilisation. La concentration optimale de LPA varie entre 0,5 et 5 μM. Cela doit être titré pour les lignes hPSC individuelles utilisées pour les blastoïdes. Aspirer le milieu d’agrégation. Ajouter 200 μL de milieu PALLY préchauffé aux micropuits. Replacez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur hypoxique à 37 °C. Répétez le changement de média le jour 1. Le jour 2, retirez le milieu PALLY et ajoutez 200 μL de milieu N2B27 complété par du LPA et 10 μM Y-27632.REMARQUE: Le jour 2, la majorité des agrégats continuent de croître. Cependant, certains agrégats forment de petites cavités. Culture continue de blastoïdes dans PALLY jusqu’au jour 4 ou dans un milieu de culture in vitro (IVC1) à partir du jour 2. Cependant, à la suite de ce changement de milieu, la formation de PrE chez les blastoïdes matures augmente. Répétez le changement de média le jour 3. La formation complète de blastoïdes se produit au jour 4.REMARQUE: Les blastoïdes sont considérés comme complètement développés lorsqu’ils ont subi une morphogenèse complète basée sur la morphométrie des blastocystes humains du jour 7 (par exemple, une plage de diamètre de 150 à 250 μm; un amas interne entouré d’un épithélium de cellules de type trophectoderme) et ont formé des cellules polaires de type trophectoderme (NR2F2 +/ CDX2-) et des cellules de type PrE (GATA4+). Cela peut être évalué à l’aide de la coloration par immunofluorescence ou du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). 3. Formation de blastoïdes dans des microplaques à fixation ultra faible de 96 puits Préparer une suspension de cellules hPSCs naïve pour la formation de blastoïdes en suivant les étapes décrites ci-dessus de 2.1.1 à 2.1.11. Aspirer le milieu et ajouter une quantité appropriée de milieu N2B27 contenant 10 μM Y-27632 pour obtenir la densité cellulaire de 70 cellules pour 100 μL du milieu.REMARQUE: Le nombre optimal de cellules d’ensemencement initial peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre. Par exemple, 70 cellules/puits peut être le nombre de cellules optimal pour la plupart des lignées cellulaires. Centrifuger la plaque à 200 x g pendant 2 min à température ambiante pour regrouper les cellules au fond des puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C dans des conditions de culture hypoxique. Dans les 24 heures, des agrégats de CSH naïfs peuvent être observés (jour 0) sur les puits. Préparez 2x PALLY moyen. Ajouter 100 μL de milieu PALLY préavertissé 2x aux puits. Replacez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur hypoxique à 37 °C. Après 24 h, aspirer la moitié du milieu (100 μL) et le remplacer par 100 μL de milieu PALLY préavertis. Répétez l’étape jusqu’au jour 4. Assurez-vous de ne pas aspirer les agrégats.REMARQUE : Au jour 2, la majorité des agrégats continuent de croître. Cependant, certains agrégats ont de petites cavités remplies de liquide. Au jour 4, la majorité des structures cavitées subissent une morphogenèse complète pour former des structures de type blastocyste. 4. Formation des trophosphères Pour la formation de trophosphère, suivez le protocole de formation de blastoïdes depuis l’étape 2.1.1 (exclusion MEF) jusqu’à l’étape 2.1.12 (dernière étape du protocole d’amorçage). Une fois que des agrégats de CSH naïfs se sont formés après 24 h, échanger le milieu d’agrégation avec PALY (sans LIF) complété par 3 μM SC-144 pour la formation de trophosphères représentant le trophectoderme précoce et PALLY complété par 2 μM XMU-MP-1 pour la formation de trophosphères représentant le trophectoderme mature. Actualisez le support tous les jours. La formation complète de la trophosphère se produit au jour 4. 5. Analyse de l’état des cellules blastoïdes et de son stade réfléchi à l’aide de scRNAseq Pour capter les blastoïdes et effectuer la dissociation, réchauffez l’incubateur à agitation à 37 °C et réglez-le à 100 tr / min. Collectez les blastoïdes de la plaque initiale de 96 puits et transférez-les à plusieurs puits d’une plaque de 96 puits à fond en U à l’aide d’une pipette buccale équipée d’un capillaire en verre.NOTE: Les blastoïdes (> 70%) doivent être sélectionnés en fonction des critères morphométriques (taille = 150-250 μm avec un amas interne unique) afin d’éviter la contamination par des structures non blastoïdes (< 30%). Laver une fois avec 200 μL de PBS à l’aide d’un P200 en visualisant sous un stéréomicroscope. Transférer dans un puits contenant 50 μL de collagénase et incuber pendant 30 min dans l’incubateur à agitation. Transférer les blastoïdes dans un puits avec 100 μL de 10x trypsine-EDTA et bien mélanger. Incuber pendant 20 min dans l’incubateur à agitation. Dissocier les blastoïdes en une seule cellule à l’aide d’une pipette P200. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL avec tampon FACS (1% FBS en PBS). Pour capturer des rapports spécifiques des analogues des trois lignées, colorez les analogues TE et PrE avec des anticorps TROP2 et PDGFRa respectivement.REMARQUE: Le nombre de cellules PrE chez les blastocystes humains est inférieur à celui des blastocystes de souris, qui pourraient refléter des défauts de développement des blastocystes formés par fécondation in vitro (FIV) ou une différence d’espèce. Dans les blastoïdes, les analogues PrE sont moins abondants que les analogues TE et EPI et représentent 7,4% des cellules lors du comptage des cellules GATA4+ par imagerie par immunofluorescence. En outre, le processus de dissociation pourrait induire des biais dans les proportions des différents types de cellules en tant qu’analogues PrE pour représenter 1% à 2% des cellules lors de la dissociation blastoïde, du marquage PDGFRa et de l’analyse FACS. Les cellules de tri FACS des trois analogues de lignée en 384 plaques contenant un tampon de lyse pour l’analyse smart-seq2. Exclure les cellules mortes marquées par une coloration DAPI (effectuée conformément aux instructions du fabricant). Pour évaluer les états cellulaires (type cellulaire et stade de développement), comparez les données transcriptomiques du blastoïde avec les témoins appropriés. 6. Culture étendue pour évaluer la progression du développement blastoïde Cultiver des blastoïdes humains sur des plaques enduites de matrice de membrane basale (fond de verre). Enduisez la plaque d’une matrice de membrane basale. Inspectez visuellement les blastoïdes pour évaluer et enregistrer la morphologie.REMARQUE: Seuls les blastoïdes qui présentent la morphologie classique des blastocystes à boule creuse avec un ICM compact ont le potentiel de croître et de se développer davantage. Ajouter 100 μL de CMRL medium-1 par puits de la plaque de 96 puits et placer la plaque dans l’incubateur au moins 2 h avant le transfert des blastoïdes pour l’équilibre. À l’aide d’un stéréomicroscope, identifier visuellement les blastoïdes ayant une bonne morphologie, transférer les blastoïdes sélectionnés dans un puits de plaque de 96 puits contenant 100 μl de CMRL medium-1 pour éliminer les traces de milieu blastoïde. Transférer les blastoïdes dans le puits contenant des supports CMRL-1 prééquilibrés. Placez la plaque dans l’incubateur et incubez à 37°C pendant la nuit.REMARQUE: Jusqu’à 5 blastoïdes peuvent être cultivés dans un puits de 96 plaques de puits. Avoir trop de blastoïdes dans un seul puits peut conduire à la formation d’agrégats de blastoïdes multiples. Le lendemain, inspectez visuellement les blastoïdes au microscope. Si les blastoïdes sont fixés, ajouter 100 μL de milieu CMRL-1 prééquilibré complété par une matrice de membrane basale à 5 %. Placer la plaque dans l’incubateur et incuber à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, surveillez les blastoïdes au microscope. Retirer la moitié du milieu (100 μL) et le remplacer par 100 μL de milieu CMRL-2 prééquilibré complété par une matrice de membrane basale à 5 %. Les jours suivants, remplacer la moitié du milieu (100 μL) par un milieu CMRL-3 prééquilibré complété par une matrice de membrane basale à 5 %. Placer la plaque dans l’incubateur et incuber à 37 °C pendant la nuit. Répétez tous les jours jusqu’à 4-6 jours de culture in vitro .REMARQUE: Nous avons cultivé des blastoïdes jusqu’à 6 jours dans des conditions de culture prolongée, ce qui correspond à l’équivalent en temps du jour 13 des embryons humains cultivés in vitro . 7. Blastoïdes immunocolorants Aspirer le milieu. Laver les échantillons 3x avec PBS pendant 5 min. Ajouter 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) froid à 4 % dans le PBS et fixer les échantillons pendant 30 min à température ambiante. Retirer la solution de PFA et laver les échantillons 3x avec du PBS pendant 10 min.REMARQUE: Si les blastoïdes ont été cultivés sur des puces de micropuit, transférez les blastoïdes de la puce dans des plaques à fond en U de 96 puits pour les étapes suivantes. Perméabiliser et bloquer les blastoïdes dans 100 μL de solution bloquante par puits (PBS contenant 0,3% de Triton-X 100 et 10% de sérum d’âne normal) pendant 60 min.REMARQUE: Selon l’espèce hôte des anticorps, adaptez le sérum en conséquence. Supprimez la solution de blocage. Ajouter 100 μL d’anticorps primaires dilués dans une solution bloquante fraîche et incuber des échantillons pendant la nuit à 4 °C.REMARQUE : Les concentrations d’anticorps primaires doivent être déterminées en fonction des instructions du fabricant. Laver les échantillons 3x avec 0,1% triton-X 100 dans PBS (solution de lavage) pendant 10 min. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires en solution bloquante avec 20 μg/mL de coloration nucléaire Hoechst et incuber des échantillons pendant 1 h à température ambiante. Protéger les échantillons de la lumière.REMARQUE: Les concentrations d’anticorps secondaires doivent être déterminées en fonction des instructions du fabricant. Laver les échantillons 3x avec la solution de lavage pendant 10 min. Pour l’imagerie, transférez les échantillons sur le fond en verre μ-slide dans PBS.REMARQUE: Le support de montage doit être sélectionné en fonction de l’objectif utilisé pour l’imagerie. Par exemple, 80% de glycérol dans pbS est possible d’utiliser pour le montage des échantillons tout en utilisant des objectifs d’huile.

Representative Results

Typiquement, les CSEh naïfs cultivés dans PXGL (Figure 2A) sont des structures agrégées et cavitées qui émergent entre 48 et 72 h après l’induction PALLY et atteignent un diamètre de 150-250 μm en 96 h (Figure 2B). En utilisant (1) le nombre optimal de cellules d’ensemencement, (2) la durée de l’agrégation pré-culture avec N2B27 (0 à 24 h), (3) la concentration de composants chimiques individuels (en particulier LPA) et (4) la durée du traitement PALLY, l’efficacité d’induction atteint 70% à 80% tel que défini sur la base de paramètres morphométriques (taille globale de 150-250 μm, cavité régulière unique, groupe de cellules internes unique; Figure 2C,D) et la présence des trois lignées. Un état cellulaire initial sous-optimal et/ou des conditions d’induction entraîneront une formation de blastoïde moins efficace ou inexistante. Pour assurer une efficacité maximale et ne former que des analogues préimplantatoires, il est crucial d’utiliser une culture de haute qualité de PXGL hPSC naïfs. Cela peut être évalué en mesurant par FACS le pourcentage de cellules positives pour les marqueurs de surface SUSD2 (état naïf) et CD24 (état amorcé). D’autres marqueurs de surface spécifiques aux lignées extraembryonnaires hors cible (p. ex., amnion, mésoderme extraembryonnaire) seraient également utiles, mais, à notre connaissance, ils ne sont actuellement pas disponibles. Si l’efficacité de formation obtenue est inférieure aux résultats rapportés, il est important de vérifier soigneusement tous les composants du milieu blastoïde, en particulier le LPA qui est reconstitué dans le PBS et qui, en tant que ligand GPCR, peut être plus instable par rapport aux molécules synthétiques reconstituées dans le DMSO. Dans la plupart des cas, même si le rendement n’est pas maximal, les structures cavitées sont toujours composées des trois lignées de blastocystes. L’émergence de trois lignées de blastocystes et la formation de l’axe embryonnaire-abémbryonique peuvent être confirmées par la coloration par immunofluorescence des marqueurs (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figure 2E,G). Les trophosphères, qui ne sont composées que de TE, aident à disséquer davantage le rôle de la communication intercellulaire. Les trophosphères peuvent se former à une efficacité de 50% à 60% dans les 96 h suivant l’induction (Figure 2H,I). La formation de blastoïdes peut être effectuée non seulement dans des réseaux de micropuits faits maison, mais également dans des plaques de puits à fixation ultra-faible 96 disponibles dans le commerce avec optimisation des conditions d’induction (voir protocole et figure 2J). Les blastoïdes ont également la capacité de se développer pendant 6 jours supplémentaires, ce qui équivaut à l’équivalent en temps de l’embryon du jour 13, avec un protocole de différenciation in vitro (Figure 2K). Afin de caractériser davantage l’état cellulaire des cellules blastoïdes, la technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire doit être utilisée. UMAP est couramment appliqué pour visualiser une distribution d’états cellulaires et une analyse de clustering non supervisée est effectuée dessus pour évaluer la proximité des états cellulaires individuels. Différents paramètres de l’analyse des données unicellulaires peuvent affecter la façon dont les cellules sont affichées dans les UMAP, conduisant ainsi à des grappes avec des positions et des formes spatiales et relatives différentes (Figure 3A). Cependant, dans cette analyse, les cellules affichent des profils de clustering nettement reproductibles, quels que soient les paramètres utilisés pour effectuer le clustering et la visualisation des données, ce qui permet de distinguer avec une grande confiance les trois lignées de blastocystes. Nous avons utilisé comme référence des cellules d’embryons prélevés à différents stades de développement. La fusion de ces ensembles de données montre que la majorité de l’analogue du trophectoderme du blastoïde est regroupée avec un trophectoderme préimplantatoire, mais pas avec des trophoblastes post-implantation (Figure 3B). Ces résultats ont également été confirmés par un consortium indépendant10. Lorsque des embryons gastrulés de stade 7 (CS7) de Carnegie sont introduits dans la carte de référence, une petite population de cellules blastoïdes (3 %) est regroupée avec les lignées mésoderme et amnion de ces embryons (Figure 3C). Lorsque des cellules de type amnion sont introduites dans la carte de référence, une petite population de cellules blastoïdes (< 2%) regroupées avec de telles cellules de type amnion. Dans l’ensemble, seules les structures comprenant une seule cavité régulière, un seul amas de cellules internes, une taille globale allant de 150 à 250 μm, comprenant des analogues transcriptomiques des trois lignées de blastocystes, et largement dépourvues d’autres lignées (par exemple, amnion, mésoderme, mésoderme extraembryonnaire) sont considérées comme des blastoïdes humains. Figure 1 : Quatre caractéristiques et deux approches pour générer des blastoïdes haute fidélité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2 : Blastoïdes et trophosphères dérivés d’agrégats de cSEh naïfs. (A) Images à contraste de phase montrant des CSH naïfs cultivés dans un milieu PXGL co-cultivé avec du MEF irradié. Barre d’échelle : 50 μm. (B) Images à contraste de phase montrant le changement morphologique d’agrégats naïfs de CSH cultivés sur un réseau de micropuits d’hydrogel non adhérent avec un LPA (milieu PALLY) de 500 nM. Barre d’échelle: 200 μm. (C) Blastoïdes humains formés sur un réseau de micropuits après 96 h. Barres d’échelle: 400 μm. (D) Quantification du pourcentage de micropuits contenant un blastoïde humain induit par l’état de culture PALLY avec une concentration optimisée de LPA à partir de différentes lignées naïves de hPSC (n = 3 réseaux de micropuits). (E) Coloration par immunofluorescence des blastoïdes humains avec des marqueurs d’épiblaste (EPI) (jaune) NANOG et OCT4; les marqueurs TE (cyan) CDX2 et GATA3; et le marqueur endodermique primitif (magenta) SOX17 et GATA4. Barre d’échelle: 100 μm. (H-I) Quantification du nombre de cellules (à gauche) et du pourcentage de cellules (à droite) appartenant à chaque lignée dans le blastoïde (96 h) sur la base de la coloration par immunofluorescence de OCT4, GATA3 et GATA4. (G) Coloration par immunofluorescence des blastoïdes humains pour CDX2 (cyan) et NR2F2 (magenta). (F) Images à contraste de phase de trophosphères précoces et tardives sur réseau de micropuits induites par l’ajout de 3 μM SC144 (H) ou 2 μM XMU-MP-1 (I), respectivement. (J) Images à contraste de phase montrant le changement morphologique d’agrégats naïfs de CSH cultivés dans une plaque de puits 96 à fixation ultra-faible avec un LPA (milieu PALLY) de 500 nM. (K) Image à contraste de phase (à gauche) et coloration par immunofluorescence (à droite) pour OCT4 (jaune), GATA3 (cyan) et GATA4 (magenta) dans un blastoïde cultivé en culture post-implantaire pendant 6 jours. Barre d’échelle: 100 μm. Ce chiffre est adapté de 6,10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Caractérisation de la composition des blastoïdes par séquençage unicellulaire. (A) Analyse groupée non supervisée avec différents paramètres sur UMAP du transcriptome de cellules individuelles dérivées des différents points temporels du blastoïde (24 h, 60 h, 96 h), des hPSC naïfs, des hPSC amorcés et du hTSC (représentent le cytotrophoblaste post-implantation). (B) UMAP du transcriptome de cellules dérivées de blastoïdes (96 h), de CSEh naïfs et de CSEh amorcés intégrés à des ensembles de données publiés provenant d’embryons humains de stades préimplantatoire, périimplantatoire (blastocystes cultivés in vitro) et gastrulation (stade Carnegie 7, c’est-à-dire entre E16 et 19). Les cellules individuelles sont colorées en fonction de leur origine dans les embryons humains (à gauche), les cellules dérivées de blastoïdes ou les cellules souches (au milieu) et le résultat d’une analyse groupée non supervisée (à droite). (C) UMAP du transcriptome de cellules dérivées de blastoïdes, de csah naïfs, de cSEh amorcés et intégrés à un ensemble de données publiées à partir d’embryons au stade de la gastrulation (stade Carnegie 7, c’est-à-dire entre E16 et 19). Les cellules individuelles sont colorées en fonction de leur origine dans les embryons humains (à gauche), les cellules dérivées de blastoïdes ou les cellules souches (au milieu) et le résultat d’une analyse groupée non supervisée (à droite). Ce chiffre est adapté de6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Tableau supplémentaire 1 : Composition de tous les milieux utilisés dans la présente étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Dans la présente étude, nous montrons, étape par étape, comment établir des blastoïdes humains à haut rendement en utilisant un protocole simple et robuste. Lors de l’agrégation des HSPC PXGL naïfs et de leur triple inhibition, les blastoïdes se forment efficacement (> 70%) et génèrent séquentiellement les 3 analogues de blastocystes en 4 jours. Des limitations dans l’efficacité et la qualité des blastoïdes (par exemple, la présence de cellules hors cible) peuvent survenir si l’état initial est sous-optimal. Il est à noter que nous avons mesuré que les CSH PXGL contiennent environ 5% de cellules reflétant les étapes post-implantation. Ces cellules pourraient limiter la formation de blastoïdes de haute qualité. Au-delà de l’état PXGL naïf initial qui reflète l’épiblaste du blastocyste, un autre facteur pivot est le milieu utilisé pour la formation de blastoïdes. Afin de former rapidement des cellules de type blastocyste et d’empêcher la formation de cellules hors cible, de type post-implantation, nous proposons que l’inhibition des voies triples (Hippo, ERK, TGF-β) est essentielle. Alors que différentes lignées cellulaires donnent des rendements différents de blastoïde lors de l’inhibition de l’ERK / TGF-β (généralement autour de 10% à 20%), l’exposition au LPA entraîne la formation d’un rendement blastoïde tout aussi élevé dans toutes les lignées cellulaires, tout en utilisant des critères morphométriques et de spécification de lignée stricts. LPA agit peut-être sur l’inhibition de la voie hippopotame, qui joue un rôle essentiel dans la première ségrégation de lignée entre les lignées épiblastique et trophectoderme chez la souris et l’homme 8,51. L’amélioration significative de l’efficacité blastoïde par LPA suggère que les mécanismes de spécification de la cellule interne-externe médiés par la voie Hippo en jeu dans le blastocyste sont cooptés lors de la formation du blastoïde. Une limitation actuelle réside dans le fait que, en raison d’une sous-optimalité des protocoles utilisés pour cultiver des blastocystes humains ou des blastoïdes au jour équivalent temps 7-13 (après la formation de blastocystes / blastoïdes), nous ne sommes pas en mesure d’évaluer dans quelle mesure nous pouvons modéliser correctement le développement post-implantation.

L’analyse de l’état transcriptomique des cellules blastoïdes peut facilement être réalisée à l’aide de scRNAseq, de cartes de référence adéquates et de méthodes bioinformatiques. Auparavant, l’analyse transcriptomique a montré que les CSEh cultivés dans PXGL sont plus similaires à l’épiblaste de blastocyste par rapport à l’état amorcé. Des limitations dans l’analyse des données peuvent survenir si la carte de référence ne comprend que des cellules au stade de blastocyste. La carte de référence devrait inclure des cellules provenant d’embryons post-implantation afin d’évaluer la présence de cellules potentielles hors cible. À l’avenir, afin de comparer les cellules blastoïdes, une carte de référence incluant tous les tissus du conceptus humain pré-et post-implantation serait extrêmement précieuse. En outre, les cartes de référence unicellulaires multi-omiques, par exemple incluant le transcriptome, l’accessibilité de la chromatine et la méthylation de l’ADN, aideraient davantage. Enfin, des méthodes bioinformatiques normalisées permettant d’évaluer quantitativement les similitudes entre les cellules à partir de modèles embryonnaires et de concepts de référence, et d’identifier positivement les cellules hors cible aideraient davantage à analyser et à comparer les résultats de manière impartiale.

Dans l’ensemble, les blastoïdes formés par la triple inhibition des voies Hippo, TGF-β et ERK possèdent les quatre caractéristiques de 1) morphogenèse très efficace, 2) séquence correcte de spécification de la lignée, 3) grande pureté des cellules de type blastocyste au niveau du transcriptome, 4) capacité à modéliser le développement péri-implantation. Ces caractéristiques des blastoïdes faciliteront la construction d’hypothèses sur le développement et l’implantation de blastocystes, mais elles ne récapitulent pas les premiers stades du développement embryonnaire. Contrairement à l’accessibilité et à la polyvalence limitées des blastocystes humains, les blastoïdes se prêtent aux tests génétiques et médicamenteux pour les études fonctionnelles du développement et de l’implantation des blastocystes. À l’avenir, ces connaissances de base pourraient contribuer à améliorer la formulation des supports de FIV, à développer des contraceptifs post-fécondation et à mieux gérer les grossesses précoces.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention ERC-Co n° 101002317 « BLASTOID: une plate-forme de découverte pour l’embryogenèse humaine précoce »). H.H.K. est soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. Nous remercions Yasuhiro Takashima d’avoir partagé les lignées cellulaires H9 et H9-GFP, et Austin Smith, Peter Andrews et Ge Guo d’avoir partagé les lignées cellulaires HNES1, Shef6, niPSC 16.2b et cR-NCRM2. Nous remercions Hossein Baharvand d’avoir partagé les organoïdes de l’endomètre. Nous remercions Joshua M. Brickman d’avoir partagé l’ARN isolé à partir de cellules différenciées PrE et de cellules nEND. Nous remercions Shankar Srinivas d’avoir partagé les données de séquençage de l’ARN unicellulaire de l’embryon de péri-gastrulation. Nous remercions Aleksand Bykov et Luisa Cochella pour leur assistance technique pour la préparation de la bibliothèque SMARTSeq2. Nous remercions l’installation NGS, Biooptic et Stem Cell de l’IMBA pour son aide essentielle.

Materials

Neurobasal media in house
DMEM/F12 in house
100X N2 supplemen Gibco 17502048
50X B27 supplement Gibco 17504044
100X Glutamax Gibco 35050038
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360039
MEM-Non-essential amino acids Gibco 11140050
1 M Hepes in house
50 mM 2-Mercaptoethanol Thermofisher 31350010
100X Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A7979
PD0325901 Medchem express HY-10254
XAV-939 Medchem express HY-15147
Gö 6983 Medchem express HY-13689
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor in house
A83-01 Medchem express HY-10432
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) Peprotech 2256236
Y-27632 Medchem express HY-10583
CMRL medium Gibco 21530027
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10-828-028
Accutase Biozym B423201 cell detachment solution
Geltrex Thermofisher A1413302 growth factor basement membrane extract
TROP2 antibody R&D systems MAB650
PDGFRα antibody R&D systems AF307
SC-144 Axon 2324
XMU-MP-1 Med Chem Express HY-100526
Matrigel basement membrane matrix
Countess cell counting chamber slides Thermo fisher cell counting slides
DAPI Staining Solution Miltenyi Biotec 130-111-570
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Kagawa, H., Javali, A., Heidari Khoei, H., Sommer, T. M., Sestini, G., Novatchkova, M., Scholte op Reimer, Y., Rivron, N. Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation. J. Vis. Exp. (186), e63388, doi:10.3791/63388 (2022).
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